絲氨酸/蘇氨酸激酶31對骨肉瘤惡性生物學(xué)行為的影響

莫 堅，朱江龍，豐 哲，李書振，韓 杰，蘇 波，馮思壇

(廣西中醫(yī)藥大學(xué)附屬瑞康醫(yī)院骨關(guān)節(jié)科,南寧 530011)

絲氨酸/蘇氨酸激酶31對骨肉瘤惡性生物學(xué)行為的影響

莫 堅，朱江龍△，豐 哲，李書振，韓 杰，蘇 波，馮思壇

(廣西中醫(yī)藥大學(xué)附屬瑞康醫(yī)院骨關(guān)節(jié)科,南寧 530011)

目的 觀察絲氨酸/蘇氨酸激酶31(STK31)在骨肉瘤中的表達及其對骨肉瘤惡性生物學(xué)行為的影響。方法 收取15例骨肉瘤組織標(biāo)本及瘤旁正常組織標(biāo)本，利用免疫組織化學(xué)技術(shù)、實時定量PCR技術(shù)和Western blot技術(shù)檢測腫瘤組織及瘤旁正常組織中STK31的表達；構(gòu)建STK31敲除質(zhì)粒pGenesil-STK31-shRNA，以骨肉瘤細胞系MG63細胞為靶細胞轉(zhuǎn)染pGenesil-STK31-shRNA或?qū)φ召|(zhì)粒pGenesil-1，通過CCK8細胞活性實驗，檢測STK31對MG63細胞增殖能力的影響；Tanswell實驗觀察STK31對骨肉瘤細胞遷移能力的影響。結(jié)果 免疫組織化學(xué)顯示腫瘤組織中STK31表達明顯高于瘤旁正常組織；實時定量PCR檢測骨肉瘤STK31 mRNA的表達量顯著高于瘤旁正常組織[(3.65±0.83)vs.(1.05±0.14)，P<0.05]；Western blot顯示腫瘤組織中STK31蛋白表達顯著高于瘤旁正常組織(P<0.05)；CCK8細胞活性實驗顯示敲除STK31后MG63細胞增殖能力明顯降低，36 h后與對照組相比[(1.71±0.17)vs.(1.39±0.11)，P<0.05]，72 h后與對照組相比[(2.15±0.21)vs.(1.54±0.14)，P<0.05]，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義；Tanswell實驗顯示轉(zhuǎn)染pGenesil- STK31-shRNA后，MG63細胞遷移能力明顯受到抑制[(13±4)個vs.(55±8)個，P<0.05]。結(jié)論 STK31在骨肉瘤組織中的表達升高，具有增加骨肉瘤細胞生物學(xué)活性的作用。

絲氨酸/蘇氨酸激酶31；骨肉瘤；MG63；基因表達

絲氨酸/蘇氨酸激酶(serine/threonine kinase,STKs)是細胞中經(jīng)典的蛋白激酶組，近年來大量研究報道STKs在腫瘤細胞中表達異常，對腫瘤的發(fā)生、發(fā)展起著重要作用。STK31是STK家族中高度保守的成員之一，最初在小鼠的精原細胞中被發(fā)現(xiàn)，與小鼠生殖相關(guān)。隨后研究人員發(fā)現(xiàn)，人源的STK31僅在睪丸組織中表達，在其他分化成熟的正常組中沉默表達。近年，研究報道發(fā)現(xiàn)STK31在胃腸道惡性腫瘤組織中重新激活，并對腫瘤的發(fā)生、發(fā)展起著關(guān)鍵作用[1]。目前，尚未見研究報道STK31在骨肉瘤中的生物學(xué)角色，本研究擬通過臨床樣本檢測骨肉瘤中STK31的表達情況，并進一步通過RNA干擾技術(shù)探索STK31對骨肉瘤惡性生物學(xué)行為的影響。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑 本研究中所有骨肉瘤標(biāo)本皆來自2012年1月至2015年12月在本院接受了腫瘤切除手術(shù)的15例患者，術(shù)后病理確診為骨肉瘤。所入選的病例均被告知研究內(nèi)容，并取得患者本人或委托人的知情同意。收取的典型骨肉瘤組織及瘤旁正常組織立即放入液氮凍存。本研究中所使用的MG63細胞購自美國ATCC公司，配制含10%胎牛血清(FBS)、90% DMEM高糖培養(yǎng)基、1%雙抗(鏈霉素、青霉素)的培養(yǎng)基培養(yǎng)細胞。

1.2 免疫組織化學(xué)檢測STK31 10%甲醛固定標(biāo)本；梯度乙醇脫水，石蠟包埋組織；切片機切片，厚4 μm，制片留用；石蠟切片60°烘烤20 min，二甲苯浸泡10 min，重復(fù)1次，無水乙醇浸泡5 min，梯度乙醇脫水，蒸餾水洗滌；使用抗原修復(fù)液修復(fù)抗原，3%過氧化氫阻斷過氧化物；STK31抗體(1∶3 000稀釋;美國Santa公司)室溫孵育1 h，PBS洗滌5 min，共3次；孵育二抗，過程同前；使用DAB溶液顯色7 min，適當(dāng)流水沖洗；蘇木素復(fù)染，松節(jié)油封片，晾干；顯微鏡下觀察、拍照。

1.3 RNA提取、逆轉(zhuǎn)錄及實時定量PCR 液氮下研磨組織至粉碎，加入適量Trizol裂解細胞，依照常規(guī)步驟提取總RNA，儲存于-80 ℃?zhèn)溆?。使用日本Takara公司逆轉(zhuǎn)錄試劑盒逆轉(zhuǎn)錄。實時熒光定量PCR試劑盒購自美國ABI公司，依說明書配制反應(yīng)體系。設(shè)置反應(yīng)程序為：初始95 ℃ 10 min；95 ℃ 30 s解鏈，58 ℃ 30 s退火，70 ℃ 10 s延伸，共40個循環(huán)；70 ℃ 10 min。以GAPDH為內(nèi)參，設(shè)3個復(fù)孔，取平均值。STK31引物為，正向：5′-GGA TGA AGA TAC ACA TTA CG-3′;反向：5′-AGA AAA CTG CAG CTC CAA AG-3′；GAPDH引物為，正向：5′-AAC GGA TTT GGT CGT ATT G-3′;反向：5′-GGA AGA TGG TGA TGG GAT T-3′。

1.4 Western blot法檢測STK31表達 裂解組織細胞收集蛋白；常規(guī)電泳、轉(zhuǎn)膜；10%脫脂牛奶封閉，室溫、搖床約2 h；TBST漂洗5 min；將聚偏氟乙烯(PVDF)膜放入抗體孵育盒中，加入一抗稀釋液(抗STK31、抗β-actin，購自美國Santa公司)，搖床4 ℃過夜；搖床上用TBST緩沖液漂洗3次，每次10 min；加入辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗(美國Santa公司),搖床室溫孵育1 h；TBST漂洗3次，將電化學(xué)發(fā)光(ECL)法發(fā)光底物A、B按比例混合，適量覆蓋PVDF膜，顯影。

1.5 構(gòu)建STK31敲除質(zhì)粒pGenesil-STK31-shRNA 設(shè)計針對STK31信使RNA的短發(fā)夾序列，正向：5′-CCG GGA TGT TTG GCT ATG CGC TTA ACT CGA GTT AAG CGC ATA GCC AAA CAT CTT TTT-3′；反向：5′-AAA AAG ATG TTT GGC TAT GCG CTT AAC TCG AGT TAA GCG CAT AGC CAA ACA TCC CGG-3′。以pGenesil-1為骨架質(zhì)粒，將該序列插入BamHⅠ和HindⅢ酶切位點之間，送蘇州金維智公司測序驗證。

1.6 CCK8細胞活性及Tanswell實驗 轉(zhuǎn)染試劑購自Biotool公司，將MG63細胞均勻接種于96孔板中，按說明書轉(zhuǎn)染pGenesil-STK31-shRNA (STK31敲除組)或pGenesil-1(對照組)，檢測前2 h加入CCK8試劑(Biotool公司)，分別于12、24、36、72 h檢測吸光度(A)值；按說明書對MG63細胞轉(zhuǎn)染pGenesil- STK31-shRNA或pGenesil-1，1%胎牛血清培養(yǎng)基重懸轉(zhuǎn)染后的細胞，以相同細胞數(shù)接種于Transwell上室(武漢博士德生物技術(shù)有限公司)，下室加入含10% FBS的培養(yǎng)基。培養(yǎng)24 h后結(jié)晶紫染色，拍照記錄結(jié)果。

2 結(jié) 果

2.1 骨肉瘤中STK31表達升高 通過免疫組織化學(xué)技術(shù)，對15例患者骨肉瘤組織及瘤旁正常組織標(biāo)本的STK31進行檢測。如圖1所示腫瘤組織中STK31表達量明顯高于瘤旁正常組織。實時熒光定量PCR檢測骨肉瘤組織及瘤旁正常組織中STK31 mRNA的表達量，腫瘤組織中STK31 mRNA的表達量明顯高于瘤旁正常組織[(3.65±0.83)vs.(1.05±0.14)，P<0.05]，差異有統(tǒng)計學(xué)意義；Western blot法進一步證實骨肉瘤中STK31蛋白表達[(2.38±0.22)vs. (0.62±0.13),P<0.05]升高，見圖2。

2.2 敲除STK31可抑制骨肉瘤細胞遷移能力 MG63細胞轉(zhuǎn)染pGenesil-STK31-shRNA或pGenesil-1后均勻接種于Transwell小室，培養(yǎng)24 h后結(jié)晶紫染色，拍照記錄。敲除STK31后MG63細胞遷移能力明顯被抑制，STK31敲除組穿出上層小室的細胞明顯減少[(13±4)個vs.(55±8)個，P<0.05]，見圖3。

2.3 敲除STK31可抑制骨肉瘤細胞增殖活性 MG63細胞轉(zhuǎn)染pGenesil-STK31-shRNA或pGenesil-1后，分別于12、24、36、72 h檢測細胞增殖活性，結(jié)果如圖4所示，STK31敲除組36 h [(1.71±0.17)vs.(1.39±0.11)，P<0.05],72 h [(2.15±0.21)vs.(1.54±0.14)，P<0.05]后與對照組比較，MG63細胞增殖活性明顯受抑制。

A：腫瘤組織；B：癌旁正常組織

圖1 免疫組織化學(xué)檢測STK31的表達(×400)

圖2 Western blot檢測STK31蛋白的表達

A：Transwell實驗；B：Transwell實驗分析圖；a：P<0.01，與對照組比較

圖3 STK31對肉瘤細胞遷移能力的影響

A:Western blot；B：CCK8細胞活性實驗；C：鏡下觀察MG63增殖情況

圖4 STK31對肉瘤細胞增殖活性的影響

3 討 論

骨肉瘤是青少年最常見的惡性骨腫瘤，好發(fā)于10～25歲青少年，在原發(fā)性骨腫瘤中，骨肉瘤的發(fā)病率僅次于漿細胞骨髓瘤，居第2位[2-3]。骨肉瘤的惡性程度極高，在臨床上作出診斷時有近80%的患者發(fā)生了肺部或其他部位的轉(zhuǎn)移。既往骨肉瘤患者的預(yù)后極差，5年生存率僅有20%左右，盡管近年來外科手術(shù)和新輔助化療取得了長足的進展，骨肉瘤患者的5年生存率仍在65%左右[4-7]。隨著分子生物學(xué)的不斷發(fā)展，基因治療、免疫治療、生物治療、分子靶向治療等治療方式不斷涌現(xiàn)，其中分子靶向治療被認(rèn)為是目前最有前景的治療方式之一[8-9]。由于骨肉瘤惡性生物學(xué)行為演變過程的分子機制十分復(fù)雜，目前對這一分子機制的了解還非常有限，這已成為骨肉瘤基礎(chǔ)研究與臨床治療的瓶頸。

STK作為一種化學(xué)酶廣泛存在于細胞中，主要是通過特異地催化蛋白質(zhì)的絲氨酸、蘇氨酸殘基磷酸化來參與細胞的增殖、分化、凋亡等生命活動。STK31基因是一種癌-睪丸基因，存在于多種人類腫瘤組織，而在正常情況下，僅存在于精細胞及睪丸[10-11]。Kuo等[12]研究發(fā)現(xiàn)，STK31可能與細胞周期調(diào)控有關(guān)，且STK31表達可增加細胞遷移能力與侵襲能力。有研究證實，STK31基因的表達受到其啟動子區(qū)甲基化狀態(tài)的調(diào)控，通過抑制細胞的凋亡，保持細胞的未分化狀態(tài)等機制在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展中起重要作用[12-13]。Fok等[1]通過對比110份結(jié)腸癌組織標(biāo)本與10份正常組織標(biāo)本發(fā)現(xiàn)STK31在腫瘤中表達升高，促使結(jié)腸癌細胞處于未分化狀態(tài)。然而，STK31在骨肉瘤中的研究尚未見報道，本研究通過免疫組織化學(xué)技術(shù)、實時熒光定量PCR技術(shù)及Western blot法檢測了15例患者骨肉瘤組織及相應(yīng)瘤旁正常組織標(biāo)本中STK31 mRNA及蛋白的表達量，發(fā)現(xiàn)腫瘤組織中STK31的表達量明顯高于瘤旁正常組織。為了進一步探討STK31對骨肉瘤生物學(xué)功能的影響，筆者以MG63細胞為靶細胞，敲除STK31表達，通過CCK8實驗和Tanswell實驗發(fā)現(xiàn)敲除STK31后MG63的增殖能力和遷移能力明顯受到抑制。

磷脂酰肌醇-3激酶/蛋白激酶B(phosphate phosphoinositide 3-kinase/protein kinase B,PI3K/AKT)信號通路在多種惡性腫瘤中異常激活，促進腫瘤細胞的增殖和侵襲[14]。AKT是PI3K信號通路上的關(guān)鍵蛋白，當(dāng)PH結(jié)構(gòu)域的蘇氨酸蛋白、絲氨酸蛋白被磷酸化后AKT才被激活[15-16]。STK家族是細胞內(nèi)重要的絲氨酸、蘇氨酸磷酸化激酶，STK31可能通過磷酸化AKT關(guān)鍵結(jié)構(gòu)域的蘇氨酸、絲氨酸參與PI3K/AKT信號通路的活化，從而促進腫瘤細胞的增殖和侵襲。

本研究表明，STK31作為一個促癌基因在骨肉瘤的增殖和遷移過程中起重要作用，為骨肉瘤的進一步研究和治療提供了新的理論參考。同時，關(guān)于STK31促進骨肉瘤進展的具體分子機制及其所參與的信號通路有待進一步研究。

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The influence of STK31 on osteosarcoma′s malignant biological behavior

MoJian,ZhuJianglong△,FengZhe,LiShuzhen,HanJie,SuBo,FengSitan

(DepartmentofBoneandJointSurgery,RuikangHospitalAffiliatedtoGuangxiUniversityofTraditionalChineseMedicine,Nanning,Guangxi530011,China)

Objective To observe the expression of serine/threonine kinase 31 (STK31) in osteosarcoma and its effect on the malignant biological behavior of osteosarcoma.Methods Fifteen cases of osteosarcoma specimens and adjacent normal tissue were collected.The expression of STK31 in tumor tissues and normal tissue were detected by immunohistochemistry,real-time quantitative PCR and Western blot.The STK31 knockout plasmids PGenesil-STK31-shRNA or control plasmid pGenesil-1 were transfected into osteosarcoma cell line MG63 cells.The effect of STK31 on the proliferation of MG63 cells was detected by CCK8 cell activity assay.Tanswell experiment was used to observed the effect of STK31 on the migration ability of osteosarcoma cells.Results Immunohistochemical showed that STK31 expressed in the tumor tissue,and it was significantly higher than the adjacent normal tissues;Real time quantitative PCR[(3.65±0.83)vs.(1.05±0.14),P<0.05] and Western blot also revealed that STK31 expression in tumor tissue were significantly higher than adjacent normal tissues(P<0.05);CCK8 experiments showed that knockdown STK31 inhibited proliferation of MG63 cell when compared with the control group after 36 h[(1.71±0.17)vs.(1.39±0.11),P<0.05],72 h[(2.15±0.21)vs.(1.54±0.14),P<0.05];Tansewell experiments showed that transfection of pGenesil-STK31-shRNA could suppress MG63 cell′s migration[(13±4)vs.(55±8)，P<0.05].Conclusion STK31 is overexpression in osteosarcoma with increased biological activity of osteosarcoma cells.

serine/threonine kinase 31;osteosarcoma;MG63 cells;gene expression

國家自然科學(xué)基金地區(qū)科學(xué)基金項目(81560779)。

莫堅(1980-)，主治醫(yī)師，碩士，主要從事骨病研究。

△通信作者，E-mail:122559396@qq.com。

10.3969/j.issn.1671-8348.2017.23.008

R684.2

A

1671-8348(2017)23-3195-03

2017-03-21

2017-04-29)

論著·基礎(chǔ)研究