siRNA干擾膜聯(lián)蛋白AI表達(dá)對(duì)甲狀腺乳頭狀癌TPC-1細(xì)胞凋亡的影響

鐘雪梅,林一民,周 源,鄧世山,丁 浩

(1.重慶醫(yī)藥高等?？茖W(xué)校臨床醫(yī)學(xué)院 401331；2.重慶市腫瘤研究所檢驗(yàn)科 400030；3.川北醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，四川南充 637000)

siRNA干擾膜聯(lián)蛋白AI表達(dá)對(duì)甲狀腺乳頭狀癌TPC-1細(xì)胞凋亡的影響

鐘雪梅1,林一民2△,周 源1,鄧世山3,丁 浩1

(1.重慶醫(yī)藥高等專科學(xué)校臨床醫(yī)學(xué)院 401331；2.重慶市腫瘤研究所檢驗(yàn)科 400030；3.川北醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，四川南充 637000)

目的 通過小干擾RNAs(siRNA)干擾膜聯(lián)蛋白A1(ANX A1)在甲狀腺乳頭狀癌(PTC)細(xì)胞中的表達(dá)，探討ANX A1對(duì)PTC細(xì)胞的生物學(xué)特性的影響。方法 設(shè)計(jì)并篩選使用高效的siRNA在PTC TPC-1細(xì)胞株特異性干擾ANX A1的表達(dá)，然后用流式細(xì)胞術(shù)觀察ANX A1干擾后對(duì)PTC細(xì)胞TPC-1凋亡的影響。結(jié)果 篩選的siRNA可高效沉默ANX A1在PTC細(xì)胞中的表達(dá)，促進(jìn)PTC細(xì)胞的凋亡。結(jié)論 siRNA干擾ANX A1表達(dá)，可促進(jìn)PTC細(xì)胞的凋亡，提示ANX A1可能是PTC治療的一個(gè)重要的生物學(xué)靶標(biāo)。

甲狀腺腫瘤；乳頭狀瘤;膜聯(lián)蛋白A1；TPC-1細(xì)胞；RNA,小分子干擾；凋亡

甲狀腺癌(thyroid cancer，TC) 是內(nèi)分泌系統(tǒng)常見腫瘤，發(fā)病率在頭頸部惡性腫瘤中居首位。而甲狀腺乳頭狀癌(papillary thyroid carcinoma，PTC)的發(fā)病率約占所有甲狀腺癌發(fā)病類型的80%以上[1]。臨床上PTC常表現(xiàn)為甲狀腺結(jié)節(jié)，但由于甲狀腺結(jié)節(jié)構(gòu)成復(fù)雜，良惡性很難鑒別，易過度治療。研究表明，對(duì)不確定惡性患者的術(shù)后病理發(fā)現(xiàn)，僅20%～25%為甲狀腺癌，另75%～80%的患者則接受了不必要的甲狀腺手術(shù)[2]。2016年，《美國(guó)醫(yī)學(xué)會(huì)雜志》已經(jīng)將包裹性濾泡型PTC改稱為“腫瘤”，雖然目前還沒有標(biāo)準(zhǔn)化診治規(guī)范，但診斷性甲狀腺切除的概率會(huì)減少[3]。為此，需探索新的生物學(xué)靶標(biāo)和診治方法。膜聯(lián)蛋白(annexins，ANX)是一類鈣依賴性、能夠結(jié)合帶負(fù)電荷膜磷脂的蛋白超家族，是一種高豐度蛋白，而ANX A1是第一個(gè)被發(fā)現(xiàn)的家族成員，它主要介導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)糖皮質(zhì)激素抗炎作用的效應(yīng)分子，與細(xì)胞增殖、細(xì)胞凋亡的信號(hào)傳導(dǎo)及腫瘤發(fā)生的機(jī)制都密切相關(guān)[4]。筆者的前期實(shí)驗(yàn)也發(fā)現(xiàn)，ANX A1在PTC原發(fā)灶、轉(zhuǎn)移灶的表達(dá)明顯高于癌旁正常組織，且與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和腫瘤大小相關(guān)[5]。因此，深入研究ANX A1在PTC中的作用是非常必要的。

雙鏈小干擾RNA(small interfecting RNA,siRNA)由21～25個(gè)核苷酸組成，能引起RNA的干擾和抑制靶蛋白的表達(dá)[6-7]。為進(jìn)一步明確ANX A1在PTC中的作用，本研究擬使用siRNA干擾ANX A1的表達(dá)，觀察其對(duì)PTC細(xì)胞株TPC-1細(xì)胞的增殖、凋亡的生物學(xué)影響，從而進(jìn)一步探討ANX A1在PTC發(fā)生、發(fā)展中的作用。

1 材料與方法

1.1 主要材料及儀器 RPMI-1640培養(yǎng)基(HyClone公司)；脂質(zhì)體Lipofectamine2000(Invitrogen公司)；RNA提取試劑盒(TaKaRa公司);PCR儀、凝膠圖像系統(tǒng)、酶標(biāo)儀(Bio-Rad公司)；流式細(xì)胞儀(BD公司)。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng) TPC-1細(xì)胞購(gòu)自深圳百恩維生物公司，細(xì)胞在生長(zhǎng)至90%匯合度時(shí)進(jìn)行傳代，在含10%～15%的胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基中，5% CO2、37 ℃恒溫孵箱內(nèi)培養(yǎng)。

1.2.2 ANX A1 siRNA設(shè)計(jì) 使用Version2.0軟件設(shè)計(jì)出針對(duì)ANX A1基因的特異性片段3對(duì)及無(wú)關(guān)序列siRNA片段1對(duì)。以上siRNA由廣州銳博生物科技有限公司復(fù)核并合成。

1.2.3 細(xì)胞轉(zhuǎn)染 將TPC-1細(xì)胞以4.5×105～5.0×105個(gè)/孔的密度接種于6孔板生長(zhǎng)24 h，使其生長(zhǎng)至80%匯合度或剛好鋪滿培養(yǎng)板且處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期進(jìn)行轉(zhuǎn)染。根據(jù)Lipfectamine2000(Invitrogen美國(guó))說明書操作，將帶有熒光標(biāo)記的siRNA轉(zhuǎn)染至TPC-1細(xì)胞內(nèi)。實(shí)驗(yàn)分為:實(shí)驗(yàn)組(分別轉(zhuǎn)染3對(duì)siRNA)、陰性對(duì)照組(轉(zhuǎn)染無(wú)關(guān)序列siRNA)和空白組(不轉(zhuǎn)染)及脂質(zhì)體組，其中實(shí)驗(yàn)組又包括ANX A1-siRNA1組、ANX A1-siRNA2組、ANX A1-siRNA3組。

1.2.4 半定量逆轉(zhuǎn)錄PCR(RT-PCR) 在GeneBank中檢索出人ANX A1和β-actin全長(zhǎng)序列，用 Oligo6.0軟件分別設(shè)計(jì)引物，將逆轉(zhuǎn)錄所得的cDNA模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增反應(yīng)，以β-actin為內(nèi)參對(duì)照。反應(yīng)條件：預(yù)變性94 ℃ 5 min；變性94 ℃ 30 s，退火 56 ℃ 30 s， 72 ℃ 45 s，30個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸10 min。PCR反應(yīng)結(jié)束后4 ℃保存。將PCR擴(kuò)增產(chǎn)物及DNA marker在1.0%～1.5%的瓊脂糖凝膠上電泳，嗅氛藍(lán)染色，在凝膠成像系統(tǒng)上觀察擴(kuò)增的條帶，采集圖片后，用圖像分析軟件PDQuest進(jìn)行分析，測(cè)量灰度值，計(jì)算mRNA的相對(duì)表達(dá)量。

1.2.5 細(xì)胞凋亡檢測(cè) 根據(jù)Annexin V-異硫氰酸熒光素(FITC)/碘化丙啶(PI)雙染細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒說明書操作：將細(xì)胞以1×105～2×105接種于6孔板，轉(zhuǎn)染72 h后收集約1×105個(gè)細(xì)胞，加入500 μL Binding Buffer懸浮細(xì)胞，TPC-1細(xì)胞懸液中先加入5 μL Annexin V-FITC室溫孵育5 min后再加入5 μL PI 雙染混合液混勻，室溫避光反應(yīng)15～20 min，1 h內(nèi)進(jìn)行流式細(xì)胞儀的檢測(cè)。數(shù)據(jù)結(jié)果的分析與統(tǒng)計(jì)用軟件為WinMDI2.9。

表1 目的基因上、下游引物及產(chǎn)物大小

2 結(jié) 果

2.1 轉(zhuǎn)染效率 分別細(xì)胞轉(zhuǎn)染于轉(zhuǎn)染24、48、72 h后在熒光顯微鏡下觀察轉(zhuǎn)染情況，計(jì)數(shù)轉(zhuǎn)染熒光陽(yáng)性的細(xì)胞，估算轉(zhuǎn)染效率，在48～72 h轉(zhuǎn)染效率達(dá)80%以上。見圖1。

A：ANX A1-siRNA3組；B：陰性對(duì)照組；C：空白組

圖1 TPC-1細(xì)胞轉(zhuǎn)染24 h后熒光顯微鏡下圖像(×200)

2.2 RT-PCR檢測(cè)各組ANX A1 mRNA表達(dá)情況 各組TPC-1細(xì)胞中ANX A1 mRNA的比較，RT-PCR結(jié)果表明，轉(zhuǎn)染72 h后，ANX A1基因的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)電泳及凝膠成像后，由PDQuest軟件分析ANX A1/β-actin的比值：ANX A1-siRNA1組、ANX A1-siRNA2組、ANX A1-siRNA3組基因mRNA表達(dá)水平分別為0.51±0.11、 0.49±0.08、0.41±0.14，空白組、脂質(zhì)體組及陰性對(duì)照組的基因mRNA表達(dá)水平分別為1.34+0.17、1.15+0.10、1.25+0.18 。各實(shí)驗(yàn)組mRAN表達(dá)水平較其他組明顯下降(P<0.05)，其中，ANX A1-siRNA3組下降最明顯。而空白組、脂質(zhì)體組及陰性對(duì)照組的基因mRNA表達(dá)無(wú)明顯變化，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見圖2。

2.3 凋亡能力 siRNA干擾ANX A1基因后對(duì)TPC-1細(xì)胞凋亡能力的影響：轉(zhuǎn)染72 h后，ANX A1-siRNA3組細(xì)胞凋亡率為 (18.93±1.16)% ，而陰性對(duì)照組和空白組的細(xì)胞凋亡率分別為(6.04±0.72)%、(5.19±0.65)%，ANX A1-siRNA3組與陰性對(duì)照組和空白組比較凋亡增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，而陰性對(duì)照組與空白組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見圖3。

1、2、3分別為ANX A1-siRNA1、2、3組;4:陰性對(duì)照組;5:空白組;6：脂質(zhì)體組

圖2 RT-PCR檢測(cè)ANX A1基因mRNA的表達(dá)

A:ANX A1-siRNA3組；B：陰性對(duì)照組；C：空白組。

圖3 Annexin A1基因?qū)谞钕偃轭^狀癌TPC-1細(xì)胞凋亡率的影響

3 討 論

PTC是TC的最常見類型。PTC的治療方法有藥物治療、手術(shù)治療、放射治療、放射性131I治療、甲狀腺激素(TSH)抑制治療、靶向治療等[8]。PTC雖然惡性程度較低、生存期長(zhǎng)，但易轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)，其中尤以手術(shù)導(dǎo)致的喉返神經(jīng)損傷引起聲音嘶啞、呼吸困難甚至窒息等為甲狀腺手術(shù)的嚴(yán)重并發(fā)癥。因此，深入探討如何提高PTC的療效，改善患者的生活質(zhì)量具有重要的臨床價(jià)值。PTC的發(fā)生不僅僅由環(huán)境、電離輻射等因素引起，更是多基因、多通路、多因素共同調(diào)控的結(jié)果。其中，多基因調(diào)控如已知的有 BRAF、RAS、RET/PTC 癌基因，多通路則包括磷酸肌醇(-3)激酶(PI3K)/AKT信號(hào)通路和絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)信號(hào)通路等。ANX A1是一類鈣依賴型、高豐度蛋白，與細(xì)胞增殖、細(xì)胞凋亡的信號(hào)傳導(dǎo)及腫瘤發(fā)生機(jī)制密切相關(guān)。目前，關(guān)于ANX A1的研究已成為腫瘤治療領(lǐng)域的熱點(diǎn)。ANX A1與組織學(xué)不同類型的肺癌關(guān)聯(lián)，它在肺腺癌和小細(xì)胞肺癌表達(dá)比在肺鱗癌更豐富[9]；研究還發(fā)現(xiàn)ANX A1在直結(jié)腸癌中表達(dá)上調(diào)，可促進(jìn)結(jié)腸癌的發(fā)生[10]。ANX A1蛋白的周期調(diào)控，參與惡性腫瘤的發(fā)生和發(fā)展過程可能與ANX A1和酪氨酸蛋白激酶的底物結(jié)合，且有多個(gè)磷酸化位點(diǎn),參與細(xì)胞內(nèi)信號(hào)傳遞有關(guān)[11]。 ANX A1也參與MAPK信號(hào)通路傳導(dǎo)、基因轉(zhuǎn)錄因子激活及各種生長(zhǎng)因子蛋白結(jié)合等，引發(fā)一系列反應(yīng)，導(dǎo)致細(xì)胞增殖、凋亡細(xì)胞分化和炎性反應(yīng)[12]。故猜測(cè)ANX A1與PTC的發(fā)生有一定程度的關(guān)聯(lián)性。

目前，關(guān)于ANX A1與PTC關(guān)系研究的文獻(xiàn)，國(guó)內(nèi)外報(bào)道極少，國(guó)內(nèi)已有ANX A2在TC中及PTC中的表達(dá)及意義的研究。國(guó)外有關(guān)于ANX A1在TC類組織中的表達(dá)情況研究，包括乳頭狀癌、濾泡狀癌、未分化癌。但都是僅研究了表達(dá)情況，未做進(jìn)一步基因阻低試驗(yàn)[13]。還有關(guān)于ANX A1在甲狀腺未分化癌中的基因阻低試驗(yàn)[14]，但也未見ANX A1與PTC的阻低試驗(yàn)的報(bào)道。

本實(shí)驗(yàn)前期的研究發(fā)現(xiàn)，ANX A1蛋白在PTC組織及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組織中高表達(dá)，在癌旁正常組織中低表達(dá)，并與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和腫瘤大小相關(guān)。也提示了ANX A1與PTC發(fā)生的相關(guān)性。這為ANX A1在PTC的分子診斷、治療方法、療效及預(yù)后評(píng)估上的研究提供了很好的著眼點(diǎn)，抑制ANX A1基因功能是否影響PTC的生物學(xué)特性成為本次研究的目的。研究也證明，ANX A1在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展中有很重要的作用，通過干擾其活性顯示很好的抑制小細(xì)胞肺癌的效果[15]。分子靶向治療PTC顯示出一定的治療前景，如索拉菲尼、舒尼替尼靶向血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF)通道，小分子多靶點(diǎn)酪酸激酶抑制劑凡德他尼等。但這些靶向治療也存在一些不足，如是否提高總體生存率，能否恢復(fù)放射性131I治療的敏感性等，且這些靶向藥物缺乏直接比較研究，有沒有一種靶向治療的藥物都優(yōu)于所有的藥物也尚未明確。

siRNA能引起RNA的沉默和抑制靶蛋白的表達(dá)。因此，siRNA對(duì)很多疾病(如腫瘤、基因疾病、病毒性干擾等)具有極好的治療前景。本研究結(jié)果顯示，設(shè)計(jì)并合成的siRNA在mRNA水平顯著抑制了ANX A1的表達(dá)，具有高效性和專一性。進(jìn)而利用篩選的效率最高的siRNA作為研究工具，進(jìn)行細(xì)胞轉(zhuǎn)染，觀察干擾后對(duì)細(xì)胞凋亡的影響。結(jié)果表明siRNA顯著干擾了ANX A1蛋白的表達(dá)，促進(jìn)了TPC-1細(xì)胞的凋亡。這可能與ANX A1和PTC基因中的某些通路有相似的結(jié)構(gòu)域和與特異配體相結(jié)合，參與細(xì)胞內(nèi)信號(hào)傳遞有關(guān)[11-12]。這也與已有文獻(xiàn)報(bào)道的ANX A1抑制在甲狀腺未分化癌的凋亡結(jié)果一致[16]。提示ANX A1在PTC中可能作為一個(gè)癌基因。ANX A1在癌組織中高表達(dá)，運(yùn)用siRNA技術(shù)干擾ANX A1在PTC中的表達(dá)，有促進(jìn)細(xì)胞凋亡的作用，這為PTC的臨床治療提供了新思路，即通過靶向抑制ANX A1蛋白表達(dá)來(lái)抑制腫瘤的生長(zhǎng)，從而達(dá)到控制腫瘤的作用。但是ANX A1通過何種方式參與，其具體機(jī)制還不十分清楚。本實(shí)驗(yàn)的缺陷在于siRNA干預(yù)方法雖然高效，但容易降解，價(jià)格昂貴，干擾或沉默時(shí)效短，不適合做長(zhǎng)期的基因抑制研究，未對(duì)ANX A1通過何種機(jī)制來(lái)調(diào)控PTC細(xì)胞的增殖、凋亡等生物學(xué)行為進(jìn)行深入探討，這也是下一步需改進(jìn)和研究的方向。

總之，本實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)合成并篩選了高效專一的能夠抑制ANX A1基因的siRNA,成功干擾了PTC細(xì)胞ANX A1基因的表達(dá)，抑制ANX A1表達(dá)的同時(shí)，促進(jìn)了腫瘤細(xì)胞的凋亡，這為ANX A1作為PTC治療靶點(diǎn)提供了新方向。

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Influnence of siRNA interfering Annexina A1 expression on apoptosis of papillary thyroid carcinomar TPC-1 cells*

ZhongXuemei1,LinYimin2△,ZhouYuan1,DengShishan3,DingHao1

(1.DepartmentofClinicalMedicine,ChongqingMedicalandPharmaceuticalCollege,Chongqing401331,China;2.DepartmentofClinicalLaboratory,ChongqingCancerInstitute,Chongqing400030,China;3.SchoolofBasicMedicalSciences,NorthSichuanMedicalCollege,Nanchong,Sichuan637000,China)

Objective To investigate the effect of ANX A1 on the biological characteristics of papillary thyroid carcinom cells by interfering with the expression of Annexina A1 (ANX A1) in papillary thyroid carcinoma cells through small interfering RNAs (siRNA).Methods The designed highly efficient siRNA was used to conduct the specific interfence on ANXA1 expression in the papillary thyroid carcinoma TPC-1 cells.The effect of ANXA1 on TPC-1 apoptosis in PTC was observed by flow cytometry.Results The designed siRAN could efficiently inhibit the expression of ANXA1 mRNA in PTC,enhanced the cell apoptosis in TPC-1 cells in vitro.Conclusion siRNA can interfere with the expression of ANXA1 and promote the apoptosis of papillary thyroid carcinoma which suggesting that ANXA1 may be an important biological target for the treatment of papillary thyroid carcinoma.

thyroid neoplasms；papilloma;annexin A1；TPC-1 cells；RNA,small Interfering； apoptosisec

國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(81172496)。

鐘雪梅(1980-)，講師，碩士，主要從事內(nèi)分泌基礎(chǔ)與臨床研究。

△通信作者，E-mail:3102175660@qq.com。

10.3969/j.issn.1671-8348.2017.23.004

R736.1

A

1671-8348(2017)23-3180-04

2017-03-10

2017-04-20)

論著·基礎(chǔ)研究