白細胞介素-17對人牙周膜成纖維細胞表達RANKL、OPG的影響

李琳娟，黎 敏，彭娟敏，康 娜

(廣西醫(yī)科大學附屬口腔醫(yī)院正畸科，南寧 530021)

白細胞介素-17對人牙周膜成纖維細胞表達RANKL、OPG的影響

李琳娟，黎 敏，彭娟敏，康 娜△

(廣西醫(yī)科大學附屬口腔醫(yī)院正畸科，南寧 530021)

目的 研究白細胞介素17(IL-17)水平對人牙周膜成纖維細胞(HPDLF)中細胞核因子κB受體活化因子配體(RANKL)、骨保護素(OPG)表達的影響，探討IL-17與正畸牙根吸收的相關(guān)性。方法 采用組織塊培養(yǎng)法，在體外建立人牙周膜成纖維細胞系。以不同水平(0、5、10、20、40 ng/mL)的IL-17作用HPDLF 24 h。采用RT-PCR和ELISA法，分別檢測RANKL和OPG的mRNA、蛋白的表達。結(jié)果 (1)在0 ng/mL組中,HPDLF表達RANKL、OPG。(2)0～20 ng/mL各組中，HPDLF中RANKL的mRNA、蛋白表達量與IL-17水平呈正相關(guān)性。(3)5～20 ng/mL各組中，OPG的mRNA、蛋白表達量與IL-17水平呈負相關(guān)性。(4)0～20 ng/mL組中，RANKL/OPG的mRNA、蛋白的比值與IL-17水平呈正相關(guān)性。結(jié)論 在無IL-17刺激時，HPDLF可表達RANKL、OPG。IL-17能夠促進HPDLF表達RANKL，同時抑制HPDLF表達OPG，上調(diào)RANKL/OPG的比值。

牙周膜;成纖維細胞；白細胞介素17；RANK配體；骨保護素

正畸相關(guān)炎性牙根吸收的重要原因之一是正畸牙移動所致的炎性反應(yīng)[1]。而白細胞介素17(interleukin-17，IL-17)主要由輔助性T淋巴細胞17(Th17)分泌，是一種重要的促炎性細胞因子，具有強大的骨吸收作用和促炎癥作用[2]。研究表明，人牙周膜成纖維細胞(human periodontal ligament fibroblasts,HPDLF)可以通過表達細胞核因子κB受體活化因子配體(receptor activator of nuclear factor-κB ligand，RANKL)和骨保護素(osteoprogeterin，OPG)來影響破骨細胞的活動，從而參與破牙骨質(zhì)細胞的活動并調(diào)節(jié)牙根吸收過程[3-4]。本實驗用逆轉(zhuǎn)錄PCR(RT-PCR)法和酶聯(lián)免疫吸附實驗(ELISA)法分別檢測HPDLF中RANKL、OPG兩種因子的mRNA、蛋白的表達情況，觀察不同水平的IL-17對HPDLF中RANKL、OPG表達的影響，探討IL-17與正畸牙根吸收的相關(guān)性。

1 材料與方法

1.1 材料 胎牛血清、DMEM培養(yǎng)液(南京維森特生物技術(shù)有限公司)，雙抗(青霉素100 U/mL、鏈霉素100 U/mL，北京索萊寶科技有限公司)，鼠抗人細胞角蛋白抗體、鼠抗人波形絲蛋白抗體(北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司)，RNA提取試劑盒、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、引物、Taq DNA PCR反應(yīng)試劑盒(Takara寶生物工程有限公司)，IL-17、RANKL、OPG ELISA檢測試劑盒(武漢博士德生物工程有限公司)等。

1.2 方法

1.2.1 HPDLF的培養(yǎng)與鑒定 采用組織塊培養(yǎng)法進行HPDLF原代培養(yǎng)。培養(yǎng)所需組織均取自本院口腔外科門診因正畸需要而拔除的前磨牙(牙齒牙周健康、無牙體疾病)。牙齒離體后立即置于預(yù)冷的含雙抗的DMEM培養(yǎng)液中，于0.5 h內(nèi)送至實驗室。取根中1/3的牙周膜組織，接種于75 mL培養(yǎng)瓶瓶底。豎直培養(yǎng)瓶并加入1.5 mL含20%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液，置于37 ℃、5% CO2的培養(yǎng)箱內(nèi)。4～6 h后組織塊貼壁牢固，慢慢放平培養(yǎng)瓶，繼續(xù)培養(yǎng)，細胞貼壁后每隔2～3 d更換1次培養(yǎng)液[5]。當HPDLF爬出后覆蓋培養(yǎng)瓶底達80%時進行傳代。取第4代細胞，行波形絲蛋白抗體和角蛋白抗體染色，鑒定細胞來源。

1.2.2 IL-17對HPDLF增殖活性的影響 取第4～5代細胞，培養(yǎng)24 h后，分別給予0、5、10、20、40、60、80 ng/mL水平的IL-17作用24 h，采用四甲基偶氮噻唑藍(MTT)比色法檢測吸光度(A)值，觀察IL-17對HPDLF增殖活性的影響。

1.2.3 實驗干預(yù)和檢測 取第4～6代細胞，制成1×105個/mL的細胞懸液，接種于6孔培養(yǎng)板中，每孔2 mL，常規(guī)培養(yǎng)3 d。棄培養(yǎng)液，加入條件培養(yǎng)液進行干預(yù)，培養(yǎng)24 h。其中實驗組條件培養(yǎng)液所含IL-17的水平分別為5、10、20、40 ng/mL，對照組為0 ng/mL，共5個組，每組設(shè)3個重復(fù)樣品。收集細胞，提取細胞總RNA，取1 μg的RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。用SYBR Green Ⅰ染料法進行RT-PCR反應(yīng)，檢測RANKL、OPG的mRNA相對表達水平，內(nèi)參為GAPDH。同時收集細胞上清液，按ELISA試劑盒操作步驟檢測RANKL、OPG的蛋白表達水平。根據(jù)所測數(shù)據(jù)計算RANKL/OPG的比值。

表1 RT-PCR引物序列

2 結(jié) 果

2.1 HPDLF的培養(yǎng)與鑒定 組織塊培養(yǎng)8～10 d時，鏡下見其周邊有游出的細胞，呈高折光率的長梭形(圖1A)。10～14 d后，大量成纖維細胞游出，向四周呈放射狀生長(圖1B)。高倍鏡下細胞呈長梭形，細胞核呈橢圓形或圓形，細胞體豐滿，細胞質(zhì)均勻，折光性強。細胞經(jīng)免疫細胞化學染色后，細胞波形絲蛋白染色呈陽性(圖2A)，角蛋白染色呈陰性(圖2B)，表明所取細胞為中胚層來源，并且沒有被外胚層來源的細胞污染。根據(jù)細胞長梭形的形態(tài)及牙周的取材部位，可判定所用細胞為HPDLF。

2.2 IL-17對HPDLF增殖活性的影響 MTT結(jié)果顯示，細胞在0～40 ng/mL的IL-17刺激24 h后，OD值持續(xù)升高，HPDLF增殖能力逐漸增強，在40 ng/mL組達到高峰(P<0.01)。60～80 ng/mL組中OD值逐漸下降，HPDLF增殖變緩并逐漸下降(P<0.01)，其增殖活性被抑制(圖3)。因而選擇0～40 ng/mL的IL-17用于實驗。

A:原代培養(yǎng)8 d;B:原代培養(yǎng)14 d

圖1 細胞形態(tài)(普通光學顯微鏡×100)

A:波形絲蛋白染色陽性;B:角蛋白染色陰性

圖2 波形絲蛋白及角蛋白抗體染色(×100)

圖3 IL-17對HPDLF增殖的影響

2.3 HPDLF的RANKL表達 在對照組(0 ng/mL)中，RANKL的mRNA和蛋白都存在表達。不同水平的IL-17作用于HPDLF 24 h后，各實驗組(5、10、20、40 ng/mL組)RANKL的mRNA相對表達量均比對照組顯著上調(diào)，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05，P<0.01)。0～20 ng/mL各組，RANKL的mRNA表達量隨著IL-17水平的增大而增大，在20 ng/mL組達最高水平，在40 ng/mL組開始下降(圖4A)。各實驗組中RANKL的蛋白表達量均比對照組顯著上調(diào)(P<0.05，P<0.01)。0～40 ng/mL各組，RANKL的蛋白表達量隨著IL-17水平的增大而增大，在40 ng/mL組達最高水平(圖4B)。

2.4 HPDLF的OPG表達 在對照組(0 ng/mL組)中，OPG的mRNA和蛋白都存在表達。與對照組(0 ng/mL組)比較，除5 ng/mL組，其余各組OPG的mRNA表達均下調(diào)(P<0.05)。5～20 ng/mL組中，OPG的mRNA表達量隨著IL-17水平的增大而下降，20 ng/mL組表達量最小，40 ng/mL組開始上升(圖5A)。各實驗組中OPG的蛋白表達量均比對照組顯著下調(diào)(P<0.05)。0～20 ng/mL各組，OPG蛋白的表達量隨著IL-17水平的增大而減小，在20 ng/mL組達最低，在40 ng/mL組開始上升(圖5B)。

2.5 RANKL/OPG的比值 各實驗組RANKL/OPG的mRNA、蛋白的比值均比對照組顯著上調(diào)，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。0～20 ng/mL各組，RANKL/OPG的mRNA、蛋白比值隨著IL-17水平的增大而增大，在20 ng/mL組達最高水平，在40 ng/mL組開始下降，見圖6。

A:RANKL mRNA；B：RANKL蛋白；a：P<0.05;b:P<0.01

圖4 RANKL mRNA及蛋白表達

A:OPG mRNA;B:OPG 蛋白；a：P<0.05;b:P<0.01

圖5 OPG mRNA及蛋白表達

A:RANKL/OPG的mRNA比值;B:RANKL/OPG的蛋白比值；a：P<0.05;b:P<0.01

圖6 RANKL/OPG mRNA及蛋白表達

3 討 論

RANKL為Ⅱ型跨膜蛋白，與細胞核因子κB受體活化因子(receptor activator of nuclear factor-κB，RANK)結(jié)合后，能直接啟動破骨細胞前體和破骨細胞的胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，通過一系列酶促級聯(lián)反應(yīng)引起破骨細胞前體分化、增殖和成熟，并激活破骨細胞從骨膜中釋放、轉(zhuǎn)移、黏附到骨質(zhì)表面，從而引起骨吸收。而OPG是一種分泌性糖蛋白，通過與RANKL特異性結(jié)合，起到競爭性抑制RANK與RANKL結(jié)合的作用，從而抑制破骨細胞分化成熟，并誘導(dǎo)破骨細胞凋亡[6]。其中由破骨細胞介導(dǎo)的骨吸收程度常以RANKL/OPG的比值來衡量[7]。HPDLF是牙周膜中最主要的細胞之一，其功能和代謝受多種細胞因子調(diào)節(jié)和影響，也能通過表達多種細胞因子影響骨代謝活動。研究表明，HPDLF可以通過表達RANKL和OPG來影響破牙骨質(zhì)細胞的活動，并調(diào)節(jié)牙根吸收過程[8-9]。

正畸相關(guān)炎性牙根吸收的重要原因之一是正畸牙移動所致的炎性反應(yīng)。而IL-17作為一種重要的促炎性細胞因子，與其他已知的白細胞介素和蛋白的結(jié)構(gòu)不相似，擁有獨特的結(jié)構(gòu)，具有強大的促炎癥作用和骨吸收作用[10-11]。本課題組前期實驗顯示，靜壓力能刺激HPDLF產(chǎn)生IL-17等促炎因子。其中動物實驗顯示，牙周膜注射外源性IL-17能上調(diào)RANKL的表達，加重正畸牙根吸收的范圍和嚴重程度；而外源性IL-17抗體下調(diào)RANKL的表達，減輕正畸牙根吸收。這提示，IL-17可能通過調(diào)節(jié)HPDLF中的RANKL參與正畸相關(guān)炎性牙根吸收。

為證實推斷，本研究采用組織塊培養(yǎng)法，在體外建立人HPDLF系。以不同水平的IL-17刺激HPDLF，作用24 h后，檢測RANKL和OPG的表達情況。實驗結(jié)果顯示，在0 ng/mL組中HPDLF能表達RANKL和OPG，說明在無IL-17刺激時，RANKL和OPG均能表達于HPDLF。與對照組(0 ng/mL組)比較，IL-17作用于HPDLF后，RANKL的mRNA、蛋白表達量均增加；OPG的mRNA、蛋白表達量均減小；RANKL/OPG的mRNA、蛋白的比值均增大?？梢缘贸?，IL-17可促進HPDLF中RANKL的表達，抑制OPG的表達。Ogasawara等[12]報道的在大鼠實驗性正畸牙移動中，成骨細胞和牙周膜細胞均存在RANKL和OPG的表達；Kanzaki等[13]研究發(fā)現(xiàn)HPDLF是通過上調(diào)RANKL和抑制OPG的表達，調(diào)節(jié)破骨細胞進行骨吸收，均與本實驗結(jié)果相符。

RANKL的mRNA、蛋白表達量隨著IL-17水平的增加而增大，OPG的mRNA、蛋白表達量隨著IL-17水平的增加而下降。說明IL-17對HPDLF中RANKL、OPG細胞因子的調(diào)節(jié)存在一定的濃度依賴性，與林丹萍等[14]的研究發(fā)現(xiàn)相符，即IL-17可提高人HPDLF中RANKL的表達水平，并隨著IL-17水平增高和刺激時間延長而增加。RANKL/OPG的比值是衡量由破骨細胞介導(dǎo)的骨吸收程度的指標。本實驗結(jié)果顯示，在0～40 ng/mL各組中IL-17能通過上調(diào)RANKL和下調(diào)OPG，從而上調(diào)RANKL/OPG的比值。其中，20 ng/mL組RANKL/OPG的比值最大，受到的影響最為明顯。這提示IL-17調(diào)節(jié)RANKL/OPG骨代謝系統(tǒng)的體外理想水平是20 ng/mL。為下一步研究IL-17作用時間對RANKL、OPG表達的影響，提供了適宜的刺激水平。

綜上所述，在HPDLF中，IL-17主要通過促進RANKL和抑制OPG等骨吸收相關(guān)因子的表達，介導(dǎo)破骨細胞的分化與成熟，進而參與正畸相關(guān)性牙根吸收。且IL-17對HPDLF中RANKL、OPG因子的調(diào)節(jié)存在濃度依賴性。牙周膜成纖維細胞RANKL和OPG之間的平衡可受外界因素干擾，因而外源性因素可干預(yù)正畸牙根吸收過程中的牙周組織代謝活動，即通過調(diào)節(jié)RANKL、OPG的表達參與牙槽骨的改建。但破骨細胞的形成是受多因素調(diào)節(jié)的，IL-17與RANKL、OPG之間的具體作用機制仍然需要未來更多實驗去研究及驗證。

[1]Yamada K,Yamaguchi M,Asano M,et al.Th17-cells in atopic dermatitis stimulate orthodontic root resorption[J].Oral Dis,2013,19(7):683-693.

[2]Steinman L.A brief history of T(H)17,the first major revision in the T(H)1/T(H)2 hypothesis of T cell-mediated tissue damage[J].Nat Med,2007,13(2):139-145.

[3]Yamaguchi M.RANK/RANKL/OPG during orthodontic tooth movement[J].Orthod Craniofac Res,2009,12:113-119

[4]李盛楠,霍波,張丁.定量觀察力值對人牙周膜細胞骨改建相關(guān)細胞因子表達的影響[J].中華口腔正畸學雜志,2015,22(2):100-103.

[5]任嬡姝,付鋼,邱雨,等.缺氧對人牙周膜細胞OPG和RANKL基因表達的影響[J].重慶醫(yī)學,2015,44(35):4955-4957.

[6]Liu JZ,Ji ZL,Chen SM.The OPG/RANKL/RANK system and bone resorptive disease[J].Sheng Wu Gong Cheng Xue Bao,2003,19(6):655-660.

[7]Hofbauer LC,Kuhne CA,Viereck V.The OPG/RANKL/RANK system in metabolic bone diseases[J].J Musculoskelet Neuronal Interact,2004,4(3):268-275.

[8]Kanzaki H,Chiba M,Arai K,et al.Local RANKL gene transfer to the periodontal tissue accelerates orthodontic tooth movement[J].Gene therapy,2006,13(8):678-685.

[9]Nishijima Y,Yamaguchi M,Kojima T,et al.Levels of RANKL and OPG in gingival crevicular fluid during orthodontic tooth movement and effect of compression force on releases from periodontal ligament cells in vitro[J].Orthod Craniofac Res,2006,9(2):63-70.

[10]Bettelli E,Korn T,Kuchroo VK.Th17:the third member of the effector T cell trilogy [J].Curr Opin Immunol,2007,19(6):652-657.

[11]Korn T,Bettelli E,Oukka M,et al.IL-17 and Th17 cells [J].Annu Rev Immunol,2009,27:485-517.

[12]Ogasawara T,Yoshimine Y,Kiyoshima T，et al.In situ expression of RANKL,RANK,osteoprotegerin and cytokines in osteoclasis of rat periodontal tissue[J].J Periodontal Res,2004,39(1):42-49.

[13]Kanzaki H,Chiba M,Shimizu Y,et al.Dual regulation of osteoclast differentiation by periodontal ligament cells through RANKL stimulation and OPG inhibition[J].J Dent Res,2001,80(3):887-891.

[14]林丹萍,王威棟,李璐,等.IL-17對人牙周膜成纖維細胞RANKL表達的影響[J].口腔醫(yī)學,2014,36(6):405-408.

Effects of different concentration of IL-17 on the expression of RANKL and OPG in human periodontal ligament fibroblasts*

LiLinjuan,LiMin,PengJuanmin,KangNa△

(DepartmentofOrthodontics,AffiliatedStomatologicalHospitalofGuangxiMedicalUniversity,Nanning,Guangxi530021,China)

Objective To study the effects of different concentration of interleukin(IL)-17 on the expression of receptor activator of nuclear factor-κB ligand (RANKL) and osteoprogeterin (OPG) in human periodontal ligament fibroblasts (HPDLF) and explore the relationship between IL-17 and orthodontic root resorption.Methods HPDLF cell line was established through the tissue pieces culture method in vitro.HPDLF were stimulated by IL-17 with five different concentrations(0,5,10,20,40 ng/mL) for 24 h.The expression level of mRNA and protein of RANKL and OPG in HPDLF were detected by RT-PCR and ELISA,respectively.Results HPDLF expressed RANKL and OPG in 0 ng/mL group.The expression amount of mRNA and protein of RANKL in HPDLF was positive correlation with the concentration of IL-17 in 0 to 20 ng/mL group.The expression amount of mRNA and protein of OPG was negative correlation with the concentration of IL-17 in 5 to 20 ng/mL group.The ralative RANKL/OPG ratio of mRNA and protein were positive correlation with the concentration of IL-17 in 0 to 20 ng/mL group.Conclusion HPDLF expresses RANKL and OPG in the absence of IL-17.IL-17 enhances the expression of RANKL and inhibits the expression of OPG in HPDLF.

periodontal ligament;fibroblasts；IL-17；RANK ligand；osteoprotegerin

國家自然科學基金資助項目(81360170)。

李琳娟(1990-)，碩士，主要從事口腔正畸研究。

△通信作者，E-mail:kangna78@126.com。

10.3969/j.issn.1671-8348.2017.23.003

R783.5

A

1671-8348(2017)23-3177-03

2017-03-19

2017-04-21)

論著·基礎(chǔ)研究