廣西壯族人群白細(xì)胞介素-27基因rs17855750 G/T、rs40837 A/G多態(tài)性分布特點

胡仁統(tǒng),王俊利,韋葉生,陸 潞,韋貴將,黃 可,廖品琥,唐毓金

(右江民族醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院，廣西百色 533000)

·論 著·

廣西壯族人群白細(xì)胞介素-27基因rs17855750 G/T、rs40837 A/G多態(tài)性分布特點

胡仁統(tǒng),王俊利,韋葉生,陸 潞,韋貴將,黃 可,廖品琥,唐毓金△

(右江民族醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院，廣西百色 533000)

目的 分析廣西壯族人群白細(xì)胞介素(IL)-27基因rs17855750 G/T、rs40837 A/G多態(tài)性分布特點，對比其基因型和等位基因頻率與不同國家(地區(qū))間種族的分布差異。方法 采用單堿基延伸的PCR技術(shù)對168例廣西壯族人群IL-27 基因rs17855750 G/T、rs40837 A/G進行多態(tài)性檢測，對比國際人類基因組計劃(HapMap)公布的中國北京人、日本人、非洲人和意大利人的單核苷酸多態(tài)性(SNP)分型數(shù)據(jù)，分析5個人群rs17855750 G/T、rs40837 A/G位點的基因型和等位基因頻率差異。結(jié)果 在廣西壯族人群中IL-27基因rs17855750 G/T位點TT基因型最常見，約為70.2%，T等位基因頻率最高，約為50.3%， rs40837 A/G多態(tài)性位點AA基因型最常見，約為35.7%，A等位基因頻率最高，約為52.1%，IL-27基因rs17855750 G/T、rs40837 A/G多態(tài)性位點基因型及等位基因頻率男女性別間比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，IL-27 rs17855750 G/T與北京人比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，但與日本人、意大利人和非洲人比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)；IL-27 rs40837 A/G與北京人比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，且與日本人、非洲人和意大利人比較差異也有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)。結(jié)論 IL-27基因rs17855750 G/T、IL-27 rs40837 A/G位點基因型和等位基因在廣西壯族人群中的分布頻率與其他國家(地區(qū))人群相比存在差異，這種差異可能是導(dǎo)致某些疾病在不同人群發(fā)病率和臨床表現(xiàn)存在差異的原因之一。

白細(xì)胞介素27；多態(tài)性,單核苷酸;分布特點；廣西[壯族自治區(qū)]；種族關(guān)系

白細(xì)胞介素27(interleukin-27,IL-27)是由Pflanz等在2002年首先發(fā)現(xiàn)，它是一個由IL-27 p28和EBI3亞單位組成的異二聚體細(xì)胞因子[1]。IL-27屬于IL-12細(xì)胞因子家族,因此與其家族其他成員(IL-12、IL-23、IL-35) 一樣具有很多共同的結(jié)構(gòu)特征和生物學(xué)功能，而生物學(xué)功能主要是在適應(yīng)性免疫系統(tǒng)及固有免疫系統(tǒng)中具有調(diào)節(jié)作用[2-3]。研究發(fā)現(xiàn)，IL-27基因存在多種功能性多態(tài)性位點，而且這些多態(tài)性位點的遺傳易感性對多種疾病的發(fā)生、發(fā)展有影響，例如自身免疫性疾病[4]、惡性腫瘤[5]、結(jié)核病[6-7]等。因此，深入分析IL-27基因多態(tài)性在不同地區(qū)及不同人群中的分布差異情況，可為探討IL-27基因多態(tài)性及其與某些疾病的發(fā)生、發(fā)展的相關(guān)性提供更多強有力的試驗依據(jù)，同時能進一步揭示IL-27基因多態(tài)性的生物學(xué)功能和遺傳特性。本文采用SNaPshot單核苷酸多態(tài)性(SNP)分型技術(shù)檢測168例廣西壯族人群IL-27基因rs17855750 G/T位點和rs40837 A/G位點的遺傳多態(tài)性，并通過NCBI數(shù)據(jù)庫與北京、日本、意大利和非洲等地區(qū)相應(yīng)的位點進行比較分析，為探討IL-27相關(guān)的遺傳特性在地域及疾病等方面的關(guān)聯(lián)性提供研究依據(jù)。

表1 PCR引物序列及產(chǎn)物長度

1 資料與方法

1.1 一般資料 168份檢測標(biāo)本來自本院進行體檢的健康人員，標(biāo)本收集時間大約從2012年10月到2013年10月。作為考察對象各項臨床及實驗室檢查指標(biāo)均正常，籍貫均為廣西，且長期在廣西居住，向上追溯3代均為壯族人，無可查親緣關(guān)系；其中男98例，女70例，年齡18～71歲，平均(39.53±14.39)歲。

1.2 方法

1.2.1 基因組DNA的提取 抽取空腹健康體檢者靜脈血2 mL，用含乙二胺四乙酸二鉀(EDTA-K2)抗凝劑的血常規(guī)管保存；采用改良碘化鈉法提取白細(xì)胞總DNA，DNA保存于-80 ℃冰箱備用。

1.2.2 PCR 根據(jù)NCBI數(shù)據(jù)庫找到EBI3基因DNA全序列，通過Primer 5引物設(shè)計軟件設(shè)計引物，再以Blast比對軟件分析得到特異性最好的上、下游引物和延伸引物，見表1，引物擴增區(qū)域必須分別包含rs17855750 G/T位點和rs40837 A/G位點的序列。然后進行PCR擴增反應(yīng)，反應(yīng)體系為20 μL，cDNA 1.0 μL，上游引物1.0 μL，下游引物1.0 μL，Mix-Tag 5.0 μL，ddH2O 12.0 μL。PCR反應(yīng)條件為：94 ℃預(yù)變性15 min；94 ℃ 30 s，60 ℃ 30 s，72 ℃ 20 s，共35個循環(huán)；最后1個循環(huán)結(jié)束后72 ℃ 10 min延伸以維持?jǐn)U增DNA雙鏈。最后PCR擴增產(chǎn)物放置于4 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3 SNaPshot SNP分型技術(shù) PCR擴增產(chǎn)物首先用蝦堿酶和外切酶Ⅰ處理純化后，用ABI公司的SNaPshot Multiplex kit試劑進行延伸反應(yīng)。延伸產(chǎn)物通過蝦堿酶再次純化，然后采用ABI3130XL測序儀對純化產(chǎn)物進行測序，最后用Gene Mapper 4.0(Applied biosystems)軟件對rs17855750 G/T位點和rs40837 A/G位點進行分型分析。

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理 采用SPSS19.0軟件進行統(tǒng)計分析。根據(jù)測序結(jié)果直接計算廣西壯族人群rs17855750 G/T位點和rs40837 A/G位點基因型和等位基因頻率；登陸NCBI查找國際人類基因組計劃(HapMap)公布的4個國家(地區(qū))人群(北京人、日本人、非洲人和意大利人)基因多態(tài)性位點rs17855750 G/T 、rs40837 A/G的基因型和基因頻率結(jié)果。采用χ2檢驗分析廣西壯族人群與HapMap公布的4個國家(地區(qū))人群該位點基因型和等位基因頻率的分布差異，以P<0.05為差異有統(tǒng)計意義。

2 結(jié) 果

2.1 IL-27基因rs17855750 G/T和rs40837 A/G位點SNP分型結(jié)果 IL-27基因rs17855750 G/T位點和rs40837 A/G位點的PCR擴增產(chǎn)物片段長度分別為210 bp和217 bp。ABI 3130XL的SNP分型結(jié)果顯示，rs17855750 G/T位點的基因型有3種，分別為GG、GT和TT，基因分型結(jié)果如圖1；rs40837 A/G位點的基因型有3種，分別為AA、AG和GG，基因分型結(jié)果如圖2。

圖1 IL-27基因rs17855750 G/T位點SNP分型結(jié)果

圖2 IL-27基因rs40837 A/G位點SNP分型結(jié)果

2.2 IL-12基因多態(tài)性在廣西壯族人群中的分布 廣西壯族人群中，IL-27 rs17855750位點的TT基因型最常見，約為70.2%；G等位基因型的頻率略高，約為50.3%。IL-27 rs40837位點的AA基因型最常見，約為35.7%；A等位基因型的頻率較高，約為52.1%。兩位點基因型及等位基因頻率男女組間比較差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(rs17855750位點；χ2=0.196,0.105,均P>0.05；rs40837位點χ2=4.123，0010，均P>0.05)。見表3、4。

表3 IL-27基因rs17855750 G/T位點基因型及等位基因頻率在廣西壯族人群的分布[n(%)]

2.3 IL-27基因多態(tài)性與其他國家(地區(qū))人群的比較 廣西壯族人群IL-27 rs17855750 G/T基因型和等位基因頻率與北京人比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，但與日本、非洲和意大利人差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)，見表5；IL-27 rs40837 A/G基因型與北京人比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，等位基因頻率與北京人比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05);L-27 rs40837 A/G基因型和等位基因頻率與日本、意大利和非洲人比較差異仍有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)，見表6。

表4 IL-27基因rs40837 A/G位點基因型及等位基因頻率在廣西壯族人群的分布[n(%)]

表5 不同種族及地區(qū)人群IL-27基因rs17855750 G/T位點多態(tài)性分布頻率的比較[n(%)]

表6 不同種族及地區(qū)人群IL-27基因rs40837 A/G位點多態(tài)性分布頻率的比較[n(%)]

3 討 論

人們對IL-27最開始的認(rèn)識集中在它具有促炎作用，主要是能夠促進輔助性T淋巴細(xì)胞(TH1)反應(yīng)，因此它被描述成為一種促炎細(xì)胞因子[1,8]。但是單獨的IL-27并沒有明顯的直接刺激性，它只有在與IL-12或者IL-2結(jié)合的情況下才能誘導(dǎo)NK細(xì)胞、T細(xì)胞產(chǎn)生促炎物質(zhì)γ-干擾素(IFN-γ)，并通過IFN-γ發(fā)揮作用[1]。有研究又發(fā)現(xiàn)：IL-27在幼稚CD4+T細(xì)胞分化為Th1細(xì)胞的過程中起到關(guān)鍵性作用，而WSX-1是IL-27的受體，其在Th1分化中的角色已得到證實，通過大鼠動物實驗進行了分析，試驗證明：WSX-1陰性的大鼠產(chǎn)生IFN-γ的水平比野生型大鼠少很多[9-10]。同時發(fā)現(xiàn)WSX-1陰性的大鼠對于胞內(nèi)寄生病原體L.major具有明顯的易感性，L.major清除依賴Th1介導(dǎo)的反應(yīng)[9]。然而只有在L.major感染的早期階段IFN-γ的產(chǎn)生才減少,在L.major感染后階段WSX-1陰性的大鼠產(chǎn)生IFN-γ的水平又逐步恢復(fù)到與野生大鼠同一水平，因此認(rèn)為IL-27/WSX-1信號只是在CD4+T細(xì)胞分化為Th1的初始階段被需要[11]。而另一項研究又報道：IL-27/WSX-1信號能抑制GATA-3的表達,其中GATA-3是Th2分化過程中一個關(guān)鍵性的轉(zhuǎn)錄因子，因此認(rèn)為IL-27促進Th1的分化是以一種STAT1-依賴或非依賴方式[12-13]。IL-27不僅具有促炎及抗炎作用，在機體抗結(jié)核免疫過程中，IL-27能通過促進單核巨噬細(xì)胞產(chǎn)生IFN-γ及增加NK細(xì)胞和CD8+T細(xì)胞發(fā)揮細(xì)胞毒活性作用等方式參與免疫應(yīng)答[14]。IL-27也能與IL-12協(xié)同作用促進毒性T細(xì)胞IL-10的產(chǎn)生[15]。

IL-27在免疫功能方面的作用主要是通過IL-27蛋白來完成，蛋白屬于功能物質(zhì)，蛋白水平在體內(nèi)的變化可能影響其發(fā)揮相應(yīng)的生物學(xué)功能，而基因的變化和表現(xiàn)形式往往影響蛋白的合成和分泌。IL-27基因多態(tài)性與疾病發(fā)生、發(fā)展的相關(guān)性也得到很多研究者的證實，IL-27基因存在多種功能性多態(tài)性位點，基因多態(tài)性的差異影響體內(nèi)IL-27的轉(zhuǎn)錄和表達，可能對一些疾病的發(fā)生和進展產(chǎn)生影響。Zhang等[16]對229例卵巢上皮瘤患者和206例健康人的IL-27基因多態(tài)性檢測發(fā)現(xiàn)，病例組rs153109 C/T位點CC、CT/TT基因型和rs17855750 G/T 位點GG、GT/TT基因型與健康人群組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義，且在卵巢上皮瘤患者中IL-27 rs17855750 G/T位點基因型GG和GT要明顯高于對照組，同時還發(fā)現(xiàn)IL-27p28 mRNA在上皮卵巢癌患者中的表達減少，說明IL-27基因多態(tài)性與上皮卵巢癌的易感性相關(guān)。Nematollahi等[17]研究發(fā)現(xiàn)IL-27基因rs964位點基因型AA、AG和GG在婦女反復(fù)流產(chǎn)組與正常組比較有明顯差異，提示IL-27基因rs964可能是婦女反復(fù)流產(chǎn)的一個危險因素。Zhou等[5]在研究基因多態(tài)性與膀胱癌發(fā)病機制時發(fā)現(xiàn)IL-27基因rs153109 C/T位點和rs17855750 G/T位點基因多態(tài)性可能是膀胱癌的易感因素，同時在膀胱癌發(fā)病過程中IL-27在蛋白水平表達也降低。因此，準(zhǔn)確分析IL-27基因多態(tài)性在不同人群中的分布，可為深入探討與IL-27相關(guān)的各種疾病的發(fā)生、發(fā)展提供更多有力的研究數(shù)據(jù)。

課題組前期研究也發(fā)現(xiàn)廣西壯族人群IL-12基因rs568408 A/G、rs3212227多態(tài)性分布情況與其他地區(qū)人群比較存在差異[18]。而IL-27作為IL-12家族的重要成員目前有關(guān)IL-27基因多態(tài)性在不同地區(qū)不同人群中是否有差異的報道還比較少，為了探討不同地區(qū)不同人群中IL-27基因多態(tài)性的變化情況，本課題組通過試驗及數(shù)據(jù)庫分析了IL-27基因rs17855750 G/T位點和rs40837 A/G位點基因型和等位基因頻率在廣西壯族人群的表現(xiàn)形式及與幾個國家(地區(qū))人群的差異情況。結(jié)果顯示，在廣西壯族人群中，rs17855750 G/T和rs40837 A/G 位點基因型和等位基因頻率在男女性別間比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義，說明2個位點基因型分布可能與性別無關(guān)。而對比HapMap上4個人群的SNP分型數(shù)據(jù)，廣西壯族人群的rs17855750 G/T位點基因型和等位基因頻率與親緣關(guān)系最近的北京人比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義，但是與親緣關(guān)系相對較遠(yuǎn)的日本、非洲和意大利等人群相比存在差異。而rs40837 位點基因型和等位基因頻率與以上4個人群比較都存在統(tǒng)計學(xué)差異。這表明此2位點基因型分布可能與種族和地域存在密切關(guān)系，也符合“親緣關(guān)系越近，其基因型分布越相似，親緣關(guān)系越遠(yuǎn)，差異越顯著”的遺傳學(xué)規(guī)律。這說明在種族進化中具有明顯的異質(zhì)性，而這種遺傳異質(zhì)性很可能是導(dǎo)致某些疾病在不同地區(qū)不同人群中發(fā)病率和臨床表現(xiàn)存在差異的原因之一。對于rs17855750 G/T位點，廣西壯族人群的基因型及等位基因頻率與北京人比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義，而rs40837 A/G位點存在差異，這提示rs40837 A/G位點可能是廣西地區(qū)某些特異性疾病發(fā)生、發(fā)展的一個危險因素，這為后續(xù)探討該位點與廣西地區(qū)高發(fā)疾病的相關(guān)性提供了有利的線索。

總之，本研究初步探討了廣西壯族人群IL-27基因rs17855750 G/T和rs40837 A/G位點基因多態(tài)性分布情況及其與不同地區(qū)人群的差異，為后續(xù)研究與IL-27相關(guān)的疾病提供了參考資料，特別是為探索廣西地區(qū)某些特異性高發(fā)疾病與IL-27基因多態(tài)性的關(guān)聯(lián)性提供有力的線索和依據(jù)，同時也為人類學(xué)和群體遺傳學(xué)補充了重要數(shù)據(jù)。

[1]Pflaxiz S,Timans JC,Cheung J,et al.IL-27,a heterodimeric cytokine composed of EBI3 and p28 protein,induces proliferation of na?ve CD4+T cells[J].Immunity,2002,16(6):779-790.

[2]Vignali DA,Kuchroo YK.IL-12 family cytokines:immunological playmakers[J].Nat Immnnol,2012,13(8):722-728.

[3]Jones LL,Vignali DA.Molecular interactions within the IL-6/IL-12 cytokine/receptor superfamily[J].Immunol Res,2011,51(1):5-14.

[4]Zhao H,Zhang Y,Xue F,et al.Interleukin-27 rs153109 polymorphism and the risk for immune thrombocytopenia[J].Autoimmunity，2013,46(8):509-512.

[5]Zhou B,Zhang P,Tang T,et al.Polymorphisms and plasma levels of IL-27:impact on genetic susceptibility and clinical outcome of bladder cancer[J].BMC Cancer,2015,27(8):1459-1467.

[6]Peresi E,Oliveira LR,da Silva WL,et al.Cytokine polymorphisms,their influence and levels in Brazilian patients with pulmonary tuberculosis during antituberculosis treatment[J].Tuberc Res Treat,2013,27(8):1155-1163.

[7]Wang J,Tang S,Shen H.Association of genetic polymorphisms in the IL12-IFNG pathway with susceptibility to and prognosis of pulmonary tuberculosis in a Chinese population[J].Eur J Clin Microbiol Infect Dis,2010,29(10):1291-1295.

[8]Takeda A,Hamano S,Yamanaka A,et al.Cutting edge:role of IL-27/WSX-1 signaling for induction of T-bet through activation of STAT1 during initial Th1 commitment[J].J Immunol,2003,170(10):4886-4890.

[9]Yoshida H,Hamano S,Senaldi G,et al.WSX-1 is required for the initiation of Th1 responses and resistance to L.major infection[J].Immunity,2001,15(4):569-578.

[10]Chen Q,Ghilardi N,Wang H,et al.Development of Th1-type immune responses requires the type I cytokine receptor TCCR[J].Nature,2013,407(6806):916-920.

[11]Yoshida H,Nakaya M,Miyazaki Y.Interleukin 27:double-edged sword for offense and defense[J].J Leukoc Bio,2009,86(6):1295-1303.

[12]Lucas S,Ghilardi N,Li J,et al.IL-27 regulates IL-12 responsiveness of naive CD4+T cells through Stat 1-dependent and-independent mechanisms[J].Proc Nat1 Acad Sci USA,2003,100 (25):15047-15052.

[13]Apetoh L,Quintana FJ,Pot C,et al.The aryl hydrocarbon receptor interacts with c-Maf to promote the differentiation of type 1 regulatory T cells induced by IL-27[J].Nat Immunol,2010,11(9):854-861.

[14]McNab FW，Ewbank J，Howes A，et al.Type I IFN induces IL-10 production in an IL-27-independent manner and blocks responsiveness to IFN-γ for production of IL-12 and bacterial killing in Mycobacterium tuberculosis-infected macrophages[J].J Immunol,2014,193(7):3600-3612.

[15]Sun J,Dodd H,Moser EK,et al.CD4+T cell help and innate-derived IL-27 induce Blimp-1-dependent IL-10 production by antiviral CTLs[J].Nat Immunol,2011,12(4):327-334.

[16]Zhang Z,Zhou B,Wu Y,et al.Prognostic value of IL-27 polymorphisms and the susceptibility to epithelial ovarian cancer in a Chinese population[J].Immunogenetics,2014,66(2):85-92.

[17]Nematollahi Z,Hadinedoushan H,Aflatoonian A,et al.The association between single nucleotide polymorphism in interleukin-27 gene and recurrent pregnancy loss in Iranian women[J].Iran J Reprod Med,2015,13(4):209-214.

[18]Lu L,Xie KG,Wei GJ,et al.Single nucleotide polymorphisms of IL-12 gene in Zhuang populations in Guangxi[J].Tianjin Med,2015,43(8):848-892.

The distribution characteristics of interleukin-27 gene rs17855750 G/T and rs40837 A/G polymorphism of Zhuang populations in Guangxi*

HuRentong,WangJunli,WeiYesheng,LuLu,WeiGuijiang,HuangKe,LiaoPinhu,TangYujin△

(AffiliatedHospitalofYoujiangMedicalUniversityofNationalities,Baise,Guaqngxi533000,China)

Objective To investigate the distribution characteristics of interleukin-27 gene rs17855750 G/T,rs40837 A/G polymorphism in Zhuang populations of Guangxi,and to compare the distribution differences of genotype and allele frequencies of interleukin-27 gene rs17855750 G/T,rs40837 A/G polymorphisms among different races.Methods The interleukin-27 gene rs17855750 G/T,rs40837 A/G polymorphisms were detected by SNaPshot SNP genotyping technique on 168 persons in Zhuang populations of Guangxi,frequencies of genotype and allele of interleukin-27 gene rs17855750 G/T,rs40837 A/G polymorphisms were analyzed in Zhuang populations,and was compared with the other four populations (HapMap-HCB,HapMap-JPT,HapMap-YRI,HapMap-TSI) from HapMap database.Results The most common genotype and allele of interleukin-27 gene rs17855750 G/T polymorphysms were TT(70.2%) and G(50.3%) in Zhuang populations of Guangxi,and the most common genotype and allele of interleukin-27 gene rs40837 G/T polymorphysms were AC(35.7%) and C(52.1%).There were no significant differences in the genotype and allele frequencies of interleukin-27 gene rs17855750 G/T,rs40837 A/G polymorphysms between male and female gender in Zhuang populations of Guangxi(P>0.05).The frequencies of allele and genotype distribution of IL-27 gene rs17855750 G/T polymorphisms were not significantly different when compared with HapMap-HCB(P>0.05),but were significantly different when compared with HapMap-JPT,HapMap-TSI and HapMap-YRI(P<0.01);The frequencies of allele and genotype distribution of interleukin-27 gene rs40837 A/G polymorphisms were significantly different when compared with HapMap-HCB(P<0.05),and were significantly different when compared with HapMap-JPT,HapMap-YRI and HapMap-TSI(P<0.01).Conclusion There are significant differences in the frequencies of allele and genotype distribution of interleukin-27 gene rs17855750 G/T,rs40837 A/G between Zhuang populations and other ethnic populations,and this variation may lead to a variety of clinical manifestation and morbidity of some diseases.

interleukin-27；polymorphism,single nucleotide;distribution characteristics；Guangxi；race relations

國家自然科學(xué)基金資助項目(81260315、81541136)；廣西自然科學(xué)基金資助項目(2012GXNSFAA053169)；廣西衛(wèi)生廳自籌經(jīng)費科研課題項目(Z2014520);百色科技攻關(guān)項目(20160610)；廣西高校青年教師基礎(chǔ)能力提升項目(KY2016YB347)。

胡仁統(tǒng)(1988-)，檢驗技師，碩士，主要從事惡性腫瘤的臨床分子診斷研究。

△通信作者:E-mail:tanggujin@163.com。

10.3969/j.issn.1671-8348.2017.23.001

R440

A

1671-8348(2017)23-3169-04

2017-03-14

2017-04-15)