自噬相關(guān)基因頻率分布特征與肺結(jié)核相關(guān)性研究*

李 穎,黃 秦,陳維賢,李升錦△

(1.重慶醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院呼吸內(nèi)科 400010；2.重慶醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院呼吸內(nèi)科 400016；3.重慶醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院檢驗科 400010)

論著·臨床研究

自噬相關(guān)基因頻率分布特征與肺結(jié)核相關(guān)性研究*

李 穎1,黃 秦2,陳維賢3,李升錦1△

(1.重慶醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院呼吸內(nèi)科 400010；2.重慶醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院呼吸內(nèi)科 400016；3.重慶醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院檢驗科 400010)

目的 根據(jù)肺結(jié)核患者自噬相關(guān)基因(ATG)頻率分布特征探討ATG位點多態(tài)性與肺結(jié)核易感相關(guān)性。方法 應(yīng)用SequenomMassArray質(zhì)譜陣列技術(shù)對202例肺結(jié)核患者(病例組)及222例健康體檢者(對照組)ATG的18個單核苷酸多態(tài)性(SNP)位點進行基因分型，統(tǒng)計分析各位點基因型與肺結(jié)核易感相關(guān)性。結(jié)果 在肺結(jié)核患者和對照組中,校正了性別、年齡等因素后,通過二元logistic回歸分析發(fā)現(xiàn)ATG4A基因rs807185和 rs5973822位點基因型和等位基因頻率分布差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。通過體質(zhì)量指數(shù)(BMI)分層分析,發(fā)現(xiàn)這一差異在高BMI人群中更為顯著，且均有病例組人群分布頻率低于對照組的表現(xiàn)，其余16個SNP位點差異均無統(tǒng)計學(xué)意義。結(jié)論 ATG4A基因rs5973822和rs807185位點多態(tài)性可能與肺結(jié)核易感性相關(guān)聯(lián)，且在高BMI群體中差異更顯著。

結(jié)核,肺；自噬；基因；多態(tài)性,單核苷酸

肺結(jié)核是由結(jié)核分枝桿菌持續(xù)感染導(dǎo)致的慢性傳染病，機體發(fā)病與否主要取決于宿主、自然環(huán)境和菌株三因素。近來眾多研究表明，基因多態(tài)性可能影響肺結(jié)核的患病風(fēng)險，暗示個體遺傳因素與結(jié)核病的發(fā)生與發(fā)展密切相關(guān)[1]。本課題組前期研究證實自噬相關(guān)基因(autophagy associated gene，ATG)4A基因單核苷酸多態(tài)性(single nucleotide polymorphism,SNP)位點rs807185的等位基因多態(tài)性與中國西南地區(qū)人群肺結(jié)核易感性呈負相關(guān)[2]；而自噬通路其他基因位點的遺傳變異可能同樣在結(jié)核病免疫中扮演重要角色。故本文應(yīng)用SequenomMassArray質(zhì)譜陣列技術(shù)對202例肺結(jié)核患者及222例健康者ATG的18個SNP位點進行基因分型，統(tǒng)計分析各位點基因型與肺結(jié)核易感相關(guān)性。

1 資料與方法

1.1 一般資料 本研究血液樣本由重慶醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院提供，共202例(男118例，女84例)肺結(jié)核患者(病例組)納入分析，平均(42±13)歲，同期在參加體檢的健康人群中挑選222例(男119例，女103例)進行對照研究,平均年齡(41±14)歲。個體之間均無血緣關(guān)系，為重慶市漢族人群；征得知情同意后簽署知情同意書并通過了重慶醫(yī)科大學(xué)倫理委員會的審批，符合醫(yī)學(xué)倫理學(xué)實驗標準。病例組均通過痰結(jié)核菌涂片或培養(yǎng)、影像學(xué)檢查并結(jié)合相應(yīng)的臨床癥狀確診為肺結(jié)核，對照組均除外糖尿病、嚴重免疫系統(tǒng)疾病、惡性腫瘤及HIV等合并癥。

1.2 SNP位點來源 基于課題組前期對ATG4A及ATG16L1基因多態(tài)性與肺結(jié)核相關(guān)性研究的基礎(chǔ)上，在Ensembl數(shù)據(jù)庫中進行檢索，收集和整理相關(guān)研究和已有報道中指示與肺結(jié)核密切相關(guān)的SNP功能位點，采用pairwise-tagging方法，根據(jù)重慶地區(qū)漢族人群基因型數(shù)據(jù)挑選單體標簽的SNP，高分辨率溶解(HRM)方法再次進行挑選，并對少數(shù)樣本測序，最終采集肺結(jié)核典型患者生物樣本對挑選的基因及具體基因型進行驗證。

1.3 實驗標本、試劑及儀器

1.3.1 研究對象標本 為肺結(jié)核確診患者和健康人群的加入EDTA的外周靜脈血。

表1 自噬相關(guān)基因SNP位點引物序列設(shè)計

表2 自噬相關(guān)基因SNP位點詳細信息

1.3.2 實驗試劑簡介 人淋巴細胞分離液(挪威Axis-shield公司)、血基因組DNA提取試劑盒(北京天恩生物技術(shù)公司)、多種DNA酶(日本TaKaRa公司)、PCR引物(北京奧科生物有限責(zé)任公司)等。

1.3.3 實驗儀器簡介 GeneAmp9700型PCR儀(美國Applied Biosystems公司)、臺式離心機(雷博爾離心機有限公司)、全自動凝膠成膠系統(tǒng)(ViberLounmat公司)、高速臺式冷凍離心機(Coulter Beckman公司)等。

1.4 實驗方法

1.4.1 SNP篩選及引物設(shè)計 所有研究對象均采集靜脈血，2 mL容量一式三份，分別用于實驗室檢測、復(fù)檢和備查，采用EDTA-K2抗凝，置于-80 ℃低溫保存。用血液基因組提取試劑盒(北京天根公司)提取外周血基因組DNA，測定DNA純度和濃度，見表1。

1.4.2 基因分型 利用SequenomMassArray質(zhì)譜陣列技術(shù)對ATG4A基因的18個SNP位點進行基因分型。聚合酶鏈式反應(yīng)(Polymerase chain reaction，PCR)用于擴增位于兩段已知序列之間的DNA區(qū)域，堿性磷酸酶(shrimp alkaline phosphatase，SAP)反應(yīng),去除未反應(yīng)完的dNTP，最后進行單堿基延伸PCR反應(yīng)和點樣及Mass ARRAY分析。

1.5 統(tǒng)計學(xué)處理 采用SPSS19.0進行分析。人口統(tǒng)計學(xué)中的年齡差異采用獨立樣本t檢驗進行分析，性別差異采用χ2檢驗。病例組與對照組的基因型、等位基因分布比較采用χ2檢驗，應(yīng)用二元Logistic回歸模型計算不同基因型相對風(fēng)險度的比值比(OR)及95%可信區(qū)間(CI)，檢驗水準α取值0.05，雙側(cè)概率。

2 結(jié) 果

2.1 調(diào)查對象基本情況 兩組人群在性別、年齡、吸煙史、飲酒史等一般資料上實行了適當?shù)钠ヅ?，保證研究對象一般資料基本一致。

2.2 ATG 18個SNP多態(tài)性位點具體位置 所有調(diào)查對象ATG的SNP多態(tài)性位點基因型頻率分布符合Hardy-Weinberg平衡定律，基因型頻率統(tǒng)計概率P>0.05。本次研究所檢測的ATG 18個SNP多態(tài)性位點具體位置見表2。

2.3 ATG的SNP多態(tài)性位點基因型和肺結(jié)核易感性的關(guān)系 分段比較兩組對象18個SNP位點等位基因及基因型的差異，結(jié)果顯示病例組rs5973822位點GG基因型(G等位基因)的頻率(3.5%)顯著低于對照組(8.6%)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.016)；病例組rs807185位點AT基因型(A等位基因)的頻率(24.8%)顯著低于對照組(35.6%),差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.009)。其他位點基因型及等位基因頻率分布在兩組對象中差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。見表3。

2.4 兩組對象中rs5973822和rs807185位點等位基因及基因型頻率在不同體質(zhì)量指數(shù)(BMI)對象中的分布 BMI<18.5 kg/m2的對象比較，rs807185和rs5973822基因位點頻率分布差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。BMI>18.5 kg/m2的人群rs807185基因位點的A等位基因(P=0.021，OR=0.580，95%CI0.365～0.922)和AT基因型(P=0.009，OR=0.434，95%CI0.230～0.816)差異有統(tǒng)計學(xué)意義，rs5973822基因位點的G等位基因(P=0.034，OR=0.606，95%CI0.381～0.965)和GG基因型(P=0.039，OR=0.302，95%CI0.092～0.989)差異有統(tǒng)計學(xué)意義。見表4。

表3 ATG的SNP位點等位基因及基因型在兩組對象中的頻率分布

NS:無意義

表4 兩組對象中rs5973822和rs807185位點等位基因及基因型頻率在不同BMI人群中的分布

續(xù)表4 兩組對象中rs5973822和rs807185位點等位基因及基因型頻率在不同BMI人群中的分布

-:表示無計算意義

3 討 論

自噬是真核細胞中普遍存在的防御機制[3]，能依賴溶酶體直接殺傷胞內(nèi)病原體，并協(xié)助抗原提呈，在天然免疫和特異性免疫中發(fā)揮重要作用[4]。自噬功能障礙繼發(fā)的免疫反應(yīng)和結(jié)核病的發(fā)生與發(fā)展密切相關(guān)[5]。自噬體的形成是自噬過程的關(guān)鍵環(huán)節(jié)，依賴眾多自噬基因協(xié)調(diào)配合，其中包括ATG12-ATG5和微管相關(guān)蛋白輕鏈-磷脂酰乙醇胺(ATG8-PE)兩套泛素化連接系統(tǒng)[6]。ATG4A是C-54家族中的一種半胱氨酸蛋白酶，通過控制ATG8的裂解進而調(diào)控其與ATG8-PE的共價結(jié)合與解離而影響自噬體的形成[7]。本課題組前期研究已證實，ATG4A基因rs807185位點多態(tài)性與肺結(jié)核易感性呈負相關(guān)，但自噬通路其他基因多態(tài)性與結(jié)核病的相關(guān)性仍少見報道。因此，筆者擴大研究，深入探討ATG頻率分布特征與肺結(jié)核易感相關(guān)性。

本次研究通過對比分析健康者與肺結(jié)核患者18個SNP位點等位基因及基因型頻率，發(fā)現(xiàn)ATG4A基因rs807185和rs5973822位點多態(tài)性與肺結(jié)核的發(fā)病風(fēng)險相關(guān)聯(lián)，其中rs5973822 SNP 位于3′-UTRs(非翻譯區(qū))， 其多態(tài)性可能影響基因表達水平， rs807185 SNP位于內(nèi)含子區(qū)域。目前有多項研究證實，內(nèi)含子可能涉及mRNA轉(zhuǎn)錄、翻譯及組織特異性表達[8-10]。因此，筆者推測rs807185和rs5973822位點多態(tài)性可能通過影響自噬功能進而影響細胞免疫反應(yīng)；其余16個SNP位點多態(tài)性與肺結(jié)核發(fā)病風(fēng)險無明顯相關(guān)性，考慮與樣本數(shù)量不足，檢測方法局限及種族地域性差異有關(guān)。

分層研究顯示，ATG4A基因rs807185和rs5973822位點多態(tài)性與高BMI人群結(jié)核病患病風(fēng)險關(guān)聯(lián)性更大。BMI是營養(yǎng)狀況的反映指標，高BMI人群日?？赡軘z取高能量和高蛋白，免疫功能增強，降低機體對結(jié)核病的易感性[11-12]。而BMI<18.5 kg/m2被認定為營養(yǎng)不良[13]，常伴隨常量營養(yǎng)素及微量營養(yǎng)素缺乏；通過加速胸腺、淋巴組織萎縮，擾亂單核巨噬細胞、T淋巴細胞和細胞因子的相互作用[14]，從而降低免疫應(yīng)答，增加宿主對結(jié)核桿菌的感染風(fēng)險，加快潛伏性感染進展為活動性肺結(jié)核進程[15]。

綜上所述，筆者考慮ATG4A rs807185和rs5973822位點多態(tài)性可能降低結(jié)核病發(fā)病風(fēng)險，且在高BMI群體中更為顯著。但本次研究仍有許多不足之處，后期筆者將會擴大樣本量，檢測更多的自噬相關(guān)基因，設(shè)計有效的功能試驗，為結(jié)核病的風(fēng)險預(yù)測、診斷及治療提供理論基礎(chǔ)。

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Research on correlation between autophagy related gene frequency distribution characteristics and pulmonary tuberculosis*

LiYing1，HuangQing2，ChenWeixian3，LiShengjing1△

(1.DepartmentofRespiration,SecondAffiliatedHospital,ChongqingMedicalUniversity,Chongqing400010,China;2.DepartmentofRespiration,FirstAffiliatedHospital,ChongqingMedicalUniversity,Chongqing400016,China;3.DepartmentofLaboratoryMedicine,SecondAffiliatedHospital,ChongqingMedicalUniversity,Chongqing400010,China)

Objective To investigate the correlation between autophagy related gene(ATG) locus polymorphism and the pulmonary tuberculosis(PTB) susceptibility according to the frequency distribution characteristics of autophagy related gene in the patients with PTB.Methods Eighteen single nucleotide polymorphism (SNP) loci of autophagy related genes in 202 patients with PTB as the case group and 222 healthy controls were genotyped by SequenomMassArray mass spectrometry array technology.The correlation between the each locus genotype and the PTB susceptibility was statistically analyzed.Results In the PTB patients group and healthy control group,after correcting the factors of sex and age,the binary Logistic regression analysis found that the frequency distribution of genotype and allele had statistical difference between rs5973822 and rs807185 sites in ATG4A gene (P<0.05).The stratified analysis by body mass index (BMI) found that this difference was more significant in the high BMI population，moreover the distribution frequency in the patient group was lower than that in the control group,and the other 16 SNP loci had no statistical difference.Conclusion ATG4A gene rs5973822 and rs807185 loci polymorphism may be negatively correlated with PTB susceptibility,moreover which is more significant in the high BMI group.

tuberculosis,pulmonary;autophagy;genes;polymorphism,single nucleotide

10.3969/j.issn.1671-8348.2017.22.007

國家自然科學(xué)基金資助項目(81171628)；重慶市衛(wèi)計委基金資助項目(2012-2-370)。作者簡介：李穎(1990-)，住院醫(yī)師，碩士，主要從事呼吸系統(tǒng)免疫防御機制研究?！?/p>

，E-mail：lsj1025@163.com。

A

1671-8348(2017)22-3046-04

2017-02-28

2017-04-16)