雙硒交聯(lián)智能納米膠束的制備及其藥物釋放研究

周 原，王金梅，張 寒

(武漢工程大學(xué)化工與制藥學(xué)院，湖北 武漢 430074)

雙硒交聯(lián)智能納米膠束的制備及其藥物釋放研究

周 原，王金梅，張 寒*

(武漢工程大學(xué)化工與制藥學(xué)院，湖北 武漢 430074)

以含有羥基的葡聚糖(Dex)和含有羧基的硒辛酸(SA)通過酯化反應(yīng)得到兩親性聚合物Dex-SA，然后在水中自組裝形成具有還原響應(yīng)性的交聯(lián)Dex-SA納米膠束。該納米膠束呈圓球形，平均粒徑為(161±10) nm，多分散指數(shù)為0.13，Zeta電位為(-20.3±1.4) mV，負(fù)載阿霉素(DOX)后的載藥率和包封率分別為10.4%和58.9%。藥物釋放實(shí)驗(yàn)表明，交聯(lián)Dex-SA載藥納米膠束在pH值7.4的10 mmol·L-1PBS溶液中的12 h累計(jì)釋放率為20.4%，添加10 mmol·L-1還原型谷胱甘肽(GSH)后的12 h累計(jì)釋放率可達(dá)85.2%。細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)表明，交聯(lián)Dex-SA載藥納米膠束不僅保留了DOX原藥本身的高細(xì)胞毒性，而且減少了對(duì)正常細(xì)胞的損傷。交聯(lián)Dex-SA納米膠束作為藥物載體具有潛在的應(yīng)用價(jià)值。

雙硒交聯(lián)；智能納米膠束；自組裝；還原響應(yīng)性；藥物釋放；細(xì)胞毒性

由兩親性聚合物在水中通過自組裝形成的納米膠束可以作為疏水性抗癌藥物的理想載體。相比其它藥物載體，納米膠束具有低毒、生物相容性好等優(yōu)點(diǎn)[1-2]，同時(shí)能夠利用腫瘤部位的高通透性和滯留效應(yīng)(EPR)將納米膠束被動(dòng)靶向腫瘤細(xì)胞，實(shí)現(xiàn)在腫瘤部位的有效聚集，提高藥物利用度[3]，但是無法在細(xì)胞內(nèi)完成快速釋放。

雙硒鍵在低濃度還原性物質(zhì)的作用下會(huì)發(fā)生斷裂，引起載體結(jié)構(gòu)的變化從而釋放藥物。這些還原性物質(zhì)主要是還原型谷胱甘肽(GSH)，細(xì)胞內(nèi)GSH濃度(2～10mmol·L-1)遠(yuǎn)高于細(xì)胞外GSH(2μmol·L-1)，癌細(xì)胞內(nèi)GSH濃度更高[4]，因此，可以利用雙硒鍵作為刺激因子釋放藥物。雙硒鍵鍵能(172kJ·mol-1)低于雙硫鍵(240kJ·mol-1)，因此含有雙硒鍵的藥物載體具有更靈敏的還原響應(yīng)性。此外，雙硒鍵還具有抗氧化[5]和催化[6]的功能，可用來清除人體內(nèi)的代謝廢物。葡聚糖是天然多糖，具有來源廣泛、水溶性好、生物相容性好、降解產(chǎn)物為內(nèi)源性[7-8]等特點(diǎn)，對(duì)其進(jìn)行疏水性修飾后可自組裝形成膠束，實(shí)現(xiàn)對(duì)難溶性抗腫瘤藥物的有效包裹。

作者在此以含有羥基的葡聚糖(Dex)和含有羧基的硒辛酸(SA)通過酯化反應(yīng)得到兩親性聚合物Dex-SA，然后在水中自組裝形成具有還原響應(yīng)性的交聯(lián)Dex-SA納米膠束，并將其用于負(fù)載阿霉素(DOX)進(jìn)行藥物釋放研究和細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)。

1 實(shí)驗(yàn)

1.1 試劑與儀器

葡聚糖(Dex，MW=20 kDa)、二環(huán)乙基碳酰亞胺(DCC，99%)、二甲氨基吡啶(DMAP，99%)、還原型谷胱甘肽(GSH，99%)、1，4-二硫代蘇糖醇(DTT，99%)，上海阿拉丁有限公司；阿霉素鹽酸鹽(DOX·HCl)，大連美侖生物技術(shù)有限公司；二甲基亞砜(DMSO)、二氯甲烷(DCM)、三乙胺(TEA)，分析純，國藥集團(tuán)上?；瘜W(xué)試劑有限公司。

SpectraMax M2e型多功能酶標(biāo)儀，美國分子儀器有限公司；7420070型冷凍干燥機(jī)，美國Labconco公司；JEN3690型激光粒度儀，英國馬爾文公司；TecnaiG2S型透射電鏡，荷蘭飛利浦公司；F-4600型熒光分光光度計(jì)，日本日立儀器公司；Mercury VX-300型核磁共振波譜儀，美國Varian技術(shù)公司。

1.2 葡聚糖-硒辛酸(Dex-SA)的合成

參照文獻(xiàn)[9]合成得到SA 10.10 g，產(chǎn)率67%。

將SA(0.30 g，1.00 mmol)溶解于10 mL DCM中，移至50 mL單口燒瓶中。將溶解在5 mL DCM中的DCC(0.30 g，1.46 mmol)也加到單口燒瓶中。在氮?dú)獗Ｗo(hù)下攪拌反應(yīng)20 h，維持溫度在30 ℃。過濾，旋蒸除去溶劑，真空干燥得到硒辛酸酸酐。取Dex(0.34 g，2.00 mmol)于50 mL單口燒瓶中，并用8 mL DMSO溶解；同時(shí)將DMAP(0.20 g，1.60 mmol)、硒辛酸酸酐(0.78 g，1.60 mmol)分別溶解在2 mL DMSO中，也加入到單口燒瓶中。在氮?dú)獗Ｗo(hù)下于30 ℃攪拌反應(yīng)48 h。加入大量冰乙醇攪拌，將得到的沉淀過濾，洗滌3次，真空干燥48 h，即得到兩親性聚合物Dex-SA。取代度60%，產(chǎn)率71%。

1.3 交聯(lián)Dex-SA納米膠束的制備

采用透析法制備交聯(lián)Dex-SA納米膠束：首先將20.0 mg Dex-SA完全溶解于10 mL DMSO后移至100 mL燒瓶中，在25 ℃磁力攪拌下將50 mL超純水用注射泵滴加到上述溶液中，放入透析袋(截留分子量7 000)中用pH值7.4的10 mmol·L-1磷酸鹽緩沖溶液(PBS)透析(透析袋外溶液至少更換5次)，24 h后取出，得到Dex-SA納米膠束。然后將Dex-SA納米膠束溶液用0.7 mol·L-1硼酸鹽緩沖溶液調(diào)pH值至8.5，通氮?dú)?5 min，加入DTT進(jìn)行交聯(lián)，交聯(lián)劑DTT用量為Dex-SA納米膠束中雙硒鍵摩爾數(shù)的10%，在氮?dú)獗Ｗo(hù)下于25 ℃攪拌反應(yīng)22 h后放入透析袋中，用10 mmol·L-1PBS透析24 h，除去未反應(yīng)的DTT，即得到交聯(lián)Dex-SA納米膠束。

1.4 交聯(lián)Dex-SA載藥納米膠束的制備

DOX·HCl的脫鹽處理：精確稱取30.0 mg(0.05 mmol)DOX·HCl溶于6 mL DMSO中，滴加24 μL(0.16 mmol)TEA，攪拌一晚上，吸走上層清液，得到5 mg·mL-1DOX溶液。

交聯(lián)Dex-SA載藥納米膠束的制備：先將0.8 mL DOX溶液與Dex-SA溶液混合，再按1.3方法加入超純水制備交聯(lián)Dex-SA載藥納米膠束(以下簡(jiǎn)稱載藥膠束)。

冷凍干燥除去載藥膠束溶液中的水，加入一定量的DMSO溶解，取50 μL，再加入4 mL DMSO，用連續(xù)光譜光密度儀測(cè)定其熒光值，依據(jù)DOX標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算載藥率和包封率。

1.5 載藥膠束的藥物釋放實(shí)驗(yàn)

采用2組實(shí)驗(yàn)進(jìn)行藥物釋放對(duì)比研究，每組做3個(gè)平行：第一組實(shí)驗(yàn)環(huán)境液為pH值7.4的10 mmol·L-1PBS；第二組實(shí)驗(yàn)環(huán)境液為pH值7.4的10 mmol·L-1PBS+10 mmol·L-1GSH。取5 mL載藥膠束溶液于透析袋中，分別置于裝有20 mL環(huán)境液的離心管中。將離心管置于恒溫(37.4 ℃)水浴振蕩器中振蕩一定時(shí)間后，取3 mL環(huán)境液作為測(cè)定液，同時(shí)補(bǔ)加同體積的新鮮環(huán)境液。用連續(xù)光譜光密度儀測(cè)定測(cè)定液中DOX的熒光強(qiáng)度，依據(jù)DOX標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算DOX的釋放量。

1.6 載藥膠束的細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)

分別以人類宮頸癌細(xì)胞(HeLa)、人類肝癌細(xì)胞(HepG2)和人類正常肝細(xì)胞(L02)為受試細(xì)胞，采用MTT法對(duì)載藥膠束的細(xì)胞毒性進(jìn)行測(cè)試。

以HeLa細(xì)胞為例，將其以每孔5 000～6 000個(gè)細(xì)胞的密度，用100 μL含10%胎牛血清(FBS)的RPMI-1640培養(yǎng)基接種于96孔板中，在37 ℃、5%CO2條件下用培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h。待細(xì)胞貼壁生長后，分別將100 μL用培養(yǎng)基稀釋好的不同濃度的載藥膠束和不同濃度的DOX溶液加入96孔板中，空白對(duì)照為100 μL含10% FBS的RPMI-1640培養(yǎng)基，培養(yǎng)48 h。然后將所有孔中的液體吸出，每孔加入100 μL培養(yǎng)基和20 μL MTT溶液(5 mg·mL-1)，培養(yǎng)4 h。最后將孔中的液體再次取出，每孔加入150 μL DMSO，待析出的甲臜晶體全部溶解后用酶標(biāo)儀于570 nm處測(cè)定吸光度(A)，計(jì)算細(xì)胞存活率。

2 結(jié)果與討論

2.1 Dex-SA的表征

2.1.1 核磁共振氫譜分析(圖1)

圖1 Dex和Dex-SA的核磁共振氫譜

從圖1可以看出，SA被成功修飾到Dex側(cè)鏈上。取代度(每100個(gè)糖單元上修飾的SA的數(shù)目)可以通過Dex中b(4.78 ppm)與SA五元環(huán)上次甲基特征峰j(1.86～1.92 ppm)的峰面積之比求得，本實(shí)驗(yàn)所制備的Dex-SA的取代度為60%。

2.1.2 拉曼光譜分析(圖2)

圖2 SA、Dex和Dex-SA的拉曼光譜

從圖2可以看出，Dex-SA在296 cm-1處有一明顯單峰，與雙硒鍵特征峰(290～330 cm-1)正好吻合，再次證明了SA被成功修飾到Dex的側(cè)鏈上。

2.2 交聯(lián)Dex-SA納米膠束的表征

2.2.1 粒徑分布

通過動(dòng)態(tài)光散射(DLS)對(duì)交聯(lián)Dex-SA納米膠束的粒徑進(jìn)行表征，結(jié)果如圖3所示。

圖3 交聯(lián)Dex-SA納米膠束的粒徑分布

從圖3可以看出，交聯(lián)Dex-SA納米膠束的平均粒徑為(161±10) nm，并且具有相當(dāng)?shù)偷亩喾稚⒅笖?shù)(PDI=0.13)，這對(duì)于藥物載體來說是非常理想的尺寸。與未交聯(lián)Dex-SA納米膠束相比，粒徑約減小20 nm，這表明交聯(lián)使得Dex-SA納米膠束結(jié)構(gòu)更加緊密，從而能夠提高Dex-SA納米膠束的穩(wěn)定性。

2.2.2 透射電鏡分析(圖4)

圖4 交聯(lián)Dex-SA納米膠束的TEM照片

從圖4可以看出，交聯(lián)Dex-SA納米膠束大小均一，呈圓球形，粒徑為130 nm左右，比DLS測(cè)出的數(shù)據(jù)要小30～40 nm，可能是因?yàn)檫M(jìn)行透射電鏡分析制樣時(shí)，失去水分造成粒徑變小。

Zeta電位分析表明，交聯(lián)Dex-SA納米膠束由于親水端的Dex提供了大量的負(fù)電荷和足夠的親水性，使得表面帶負(fù)電荷，Zeta電位為(-20.3±1.4) mV，保證了膠束在運(yùn)輸時(shí)不會(huì)被帶負(fù)電荷的蛋白吸附和網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)(RES)吞噬。

2.2.3 紫外光譜分析(圖5)

圖5 Dex-SA納米膠束的紫外光譜

從圖5可以看出，Dex-SA納米膠束在332 nm處有一個(gè)特征吸收峰，正好是側(cè)鏈SA五元環(huán)的特征吸收峰；而交聯(lián)Dex-SA納米膠束由于在DTT的作用下五元環(huán)開環(huán)，所以這個(gè)特征峰消失。表明DTT可以成功地使Dex-SA納米膠束通過雙硒鍵進(jìn)行交聯(lián)。

2.2.4 穩(wěn)定性分析

臨界膠束濃度(CMC)測(cè)試結(jié)果表明，交聯(lián)Dex-SA納米膠束具有極低的CMC值(10.7 mg·L-1)，這極大地保證了膠束的穩(wěn)定性，即使注射后被血液稀釋，也不會(huì)出現(xiàn)結(jié)構(gòu)被破壞的情況。

通過加入高濃度(最高2 mol·L-1)的氯化鈉溶液或高度稀釋(1 000倍)的方法來研究交聯(lián)Dex-SA納米膠束的鹽穩(wěn)定性，結(jié)果如圖6所示。

圖6 Dex-SA納米膠束的鹽穩(wěn)定性

從圖6可以看出，交聯(lián)Dex-SA納米膠束在0.2 mol·L-1氯化鈉溶液中，粒徑基本保持不變，在2 mol·L-1氯化鈉溶液中也保持很好的穩(wěn)定性，粒徑從130 nm左右增大到200 nm左右，但分布變化很??；而未交聯(lián)Dex-SA納米膠束在0.2 mol·L-1氯化鈉溶液中粒徑就已經(jīng)發(fā)生了很大變化，增大到800 nm以上。這主要是因?yàn)?，交?lián)Dex-SA納米膠束的結(jié)構(gòu)因?yàn)榻宦?lián)而被加固，所以十分穩(wěn)定，即使在高鹽、高度稀釋的情況下，這種結(jié)構(gòu)也能非常穩(wěn)定地存在；而未交聯(lián)Dex-SA納米膠束是通過自組裝形成的，膠束主要靠分子間的相互作用力維系，在高度稀釋和高鹽的情況下，分子間作用力被嚴(yán)重破壞，納米膠束發(fā)生了解離，導(dǎo)致部分團(tuán)聚使得粒徑變大。

交聯(lián)Dex-SA納米膠束在pH值7.4的PBS溶液中放置0 d、2 d、8 d、15 d時(shí)的粒徑變化如圖7所示。

圖7 交聯(lián)Dex-SA納米膠束的粒徑穩(wěn)定性

從圖7可以看出，交聯(lián)Dex-SA納米膠束在pH值7.4的PBS溶液中放置8 d，粒徑保持在175～210 nm，PDI基本無變化；15 d后粒徑增大到500 nm左右，分布變寬。表明交聯(lián)Dex-SA納米膠束具有較好的穩(wěn)定性。

2.3 藥物釋放研究

在pH值為7.4的條件下，通過控制環(huán)境中GSH濃度，分析載藥膠束在藥物累計(jì)釋放過程中的還原敏感性能。載藥膠束的藥物釋放曲線如圖8所示。

圖8 載藥膠束的藥物釋放曲線

從圖8可以看出，在無GSH的環(huán)境中，藥物釋放緩慢，12 h累計(jì)釋放率只有20.4%，34 h最終釋放率僅22.5%；而當(dāng)環(huán)境中加入少量的還原劑GSH后，2 h即可實(shí)現(xiàn)約47.1%的累計(jì)釋放率，釋放效率顯著提高。這是由于在GSH環(huán)境中，載藥膠束的雙硒鍵被部分打斷生成硒醇，膠束逐漸解體，藥物快速釋放，34 h最終釋放率高達(dá)90.6%?？梢?，即使在低濃度還原劑環(huán)境中，雙硒鍵依然有靈敏的響應(yīng)性，能夠?qū)崿F(xiàn)藥物的快速釋放。計(jì)算得到包封率為58.9%，載藥率為10.4%。

對(duì)載藥膠束在10 mmol·L-1GSH中的藥物釋放數(shù)據(jù)進(jìn)行擬合，根據(jù)擬合度(R2)來判定曲線擬合情況，結(jié)果見圖9。

a.零級(jí)動(dòng)力學(xué)方程 b.一級(jí)動(dòng)力學(xué)方程 c.Higuchi方程 d.雙相動(dòng)力學(xué)方程

從圖9可以看出，載藥膠束的藥物釋放行為用零級(jí)動(dòng)力學(xué)方程、一級(jí)動(dòng)力學(xué)方程以及Higuchi方程描述時(shí)，擬合度R2均不是很理想，而雙相動(dòng)力學(xué)方程的擬合度較好，達(dá)到0.996。載藥膠束在2 h內(nèi)有突釋行為，釋藥速率快，2 h累計(jì)釋放率達(dá)到48%，可能是因?yàn)檩d藥膠束表面吸附有少量DOX以及分子擴(kuò)散作用所致。之后再逐漸解體釋放剩余的DOX。基于此研制的抗癌藥物可以在載藥膠束到達(dá)病灶部位后迅速釋放出較多藥物，達(dá)到較高濃度，然后緩慢釋放出剩余藥物，維持一定的藥效。

2.4 細(xì)胞毒性研究

載藥膠束和DOX對(duì)HeLa細(xì)胞、HepG2細(xì)胞、L02細(xì)胞的細(xì)胞毒性如圖10所示。

圖10 載藥膠束和DOX對(duì)HeLa(a)、HepG2(b)和L02細(xì)胞(c)的細(xì)胞毒性

從圖10可以看出，載藥膠束對(duì)HeLa和HepG2細(xì)胞的IC50值分別為3.21 μg·mL-1和1.97 μg·mL-1，DOX對(duì)HeLa和HepG2細(xì)胞的IC50值分別為4.29 μg·mL-1和3.00 μg·mL-1，表明載藥膠束可以有效抑制HeLa和HepG2細(xì)胞的生長；載藥膠束對(duì)正常細(xì)胞L02的毒性明顯降低，在相同劑量(DOX濃度4.97 μg·mL-1)下，DOX對(duì)L02細(xì)胞的相對(duì)存活率是50%，而載藥膠束對(duì)L02細(xì)胞的相對(duì)存活率達(dá)70%，表明載藥膠束可有效降低藥物對(duì)正常細(xì)胞的毒副作用。

為更進(jìn)一步驗(yàn)證載藥膠束對(duì)3種細(xì)胞的細(xì)胞毒性，進(jìn)行了對(duì)比實(shí)驗(yàn)，考察未載藥交聯(lián)Dex-SA納米膠束對(duì)3種細(xì)胞的細(xì)胞毒性，結(jié)果見圖11。

圖11 未載藥交聯(lián)Dex-SA納米膠束對(duì)HeLa、HepG2和L02細(xì)胞的細(xì)胞毒性

從圖11可以看出，未載藥交聯(lián)Dex-SA納米膠束在濃度高達(dá)40 μg·mL-1時(shí)，對(duì)3種細(xì)胞的生長都沒有抑制作用，細(xì)胞相對(duì)存活率均高于100%。進(jìn)一步表明載藥膠束能夠有效抑制HeLa、HepG2、L02細(xì)胞的生長，且交聯(lián)Dex-SA納米膠束無毒性。

3 結(jié)論

制備了具有載藥性能的雙硒交聯(lián)的還原響應(yīng)性納米膠束Dex-SA，該納米膠束呈圓球形，平均粒徑為(161±10) nm，多分散指數(shù)為0.13，Zeta電位為(-20.3±1.4) mV。交聯(lián)Dex-SA納米膠束在2 mol·L-1氯化鈉溶液中穩(wěn)定性良好。將其負(fù)載DOX后的載藥率和包封率分別為10.4%和58.9%，在pH值為7.4的10 mmol·L-1PBS溶液中的12 h累計(jì)釋放率為20.4%，在10 mmol·L-1GSH存在下，12 h累計(jì)釋放率可達(dá)到85.2%。交聯(lián)Dex-SA納米膠束本身無毒性；而載藥膠束不僅保留了DOX原藥本身的高細(xì)胞毒性，而且減少了對(duì)正常細(xì)胞的損傷，呈現(xiàn)出良好的劑量依賴性。交聯(lián)Dex-SA納米膠束具有促進(jìn)DOX在腫瘤位點(diǎn)的累積釋放和提高藥物載藥性能的優(yōu)勢(shì)，是一種良好有效的化療方法，在腫瘤治療中有著廣闊的應(yīng)用前景。

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Preparation and Drug-Release Behavior of Diselenide-Crosslinked Smart Nanomicelle

ZHOU Yuan,WANG Jin-mei,ZHANG Han*

(SchoolofChemicalEngineeringandPharmacy,WuhanInstituteofTechnology,Wuhan430074,China)

Throughesterificationofhydroxyl-containingdextran(Dex)andcarboxyl-containingselenooctanoicacid(SA),wesynthesizedtheamphiphilicpolymerDex-SA,whichself-assembledtoformcrosslinkedDex-SAnanomicellewithreductionresponsivenessinaqueoussolution.Thenanomicellehadasphericalshapewithaverageparticlesizeof(161±10)nm,polydispersityindexof0.13,andZetapotentialof(-20.3±1.4)mV.Whendoxorubicin(DOX)wasloadedonthenanomicelle,thedrug-loadingratioandentrapmentefficiencywere10.4%and58.9%,respectively.Drug-releaseexperimentshowedthattheaccumulativereleaserateofDOX-loadednanomicellewas20.4%after12hin10mmol·L-1PBS(pHvalue7.4),whichreached85.2%afteradding10mmol·L-1glutathione.CytotoxicityexperimentshowedthatDOX-loadednanomicellenotonlyretainedthehighcytotoxicityofDOX,butalsoreducedthedamagetonormalcells.Therefore,asadrugcarrier,thecrosslinkedDex-SAnanomicellehasapotentialapplicationvalue.

diselenide-crosslinked;smartnanomicelle;self-assembly;reductionresponsiveness;drug-release;cytotoxicity

2017-04-05

周原(1992-)，女，湖北枝江人，碩士研究生，研究方向：生物醫(yī)用功能高分子材料，E-mail:1149356540@qq.com；通訊作者：張寒，實(shí)驗(yàn)員，E-mail:zhanghan891208@126.com。

10.3969/j.issn.1672-5425.2017.08.011

O648

A

1672-5425(2017)08-0053-06

周原，王金梅，張寒.雙硒交聯(lián)智能納米膠束的制備及其藥物釋放研究[J].化學(xué)與生物工程，2017，34(8)：53-58.