披針骨牌蕨總黃酮對(duì)高糖誘導(dǎo)血管內(nèi)皮細(xì)胞氧化損傷的保護(hù)作用

張 偉，羅 優(yōu)，李亞婷，胡曉峰，唐偉軍，彭梁杰

（湘南學(xué)院，湖南 郴州 423000）

·實(shí)驗(yàn)研究·

披針骨牌蕨總黃酮對(duì)高糖誘導(dǎo)血管內(nèi)皮細(xì)胞氧化損傷的保護(hù)作用

張 偉，羅 優(yōu)，李亞婷，胡曉峰，唐偉軍，彭梁杰

（湘南學(xué)院，湖南 郴州 423000）

目的 探討披針骨牌蕨總黃酮對(duì)血管內(nèi)皮細(xì)胞氧化損傷的保護(hù)作用。方法 建立高糖誘導(dǎo)的人臍靜脈血管內(nèi)皮細(xì)胞（HUVEC）氧化損傷模型進(jìn)行藥物試驗(yàn)，分為正常對(duì)照組(葡萄糖質(zhì)量濃度為5.5 mmol／L)、高糖損傷模型組（葡萄糖質(zhì)量濃度為40 mmol／L)、提取物組（披針骨牌蕨總黃酮質(zhì)量濃度分別為100，200，400 mg／L）、陽性對(duì)照組（維生素C質(zhì)量濃度為30 mg／L）。以四甲基偶氮唑藍(lán)(MTT)比色法測(cè)定細(xì)胞存活率，以試劑盒測(cè)定細(xì)胞中乳酸脫氫酶（LDH）、丙二醛（MDA）、超氧化物歧化酶（SOD）、一氧化氮（NO）、一氧化氮合酶（NOS）釋放量及活性的變化。結(jié)果 提取物組MDA釋放量明顯降低，LDH釋放量及活性下降，SOD的活性明顯增高，NO和NOS生成量及活性明顯增高，具有顯著性差異（P＜0.05），且在一定質(zhì)量濃度范圍內(nèi)與披針骨牌蕨總黃酮呈劑量依賴性關(guān)系。結(jié)論 披針骨牌蕨總黃酮對(duì)高糖誘導(dǎo)HUVEC氧化損傷具有一定的保護(hù)作用，其作用機(jī)制可能與機(jī)體抗氧化酶活性增加、自由基清除、抗氧化能力提高有關(guān)。

披針骨牌蕨總黃酮；人臍靜脈血管內(nèi)皮細(xì)胞；高糖；氧化應(yīng)激

披針骨牌蕨 Lepiologrammitis diversa Ching同為蕨類植物水龍骨科骨牌蕨屬披針骨牌蕨的全草，《新華本草綱要》記載，其味微苦、澀，性平，入肺、肝二經(jīng)，具有清熱除濕、收斂止血的功效，主要用于治療風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、小兒高熱、肺熱咳嗽、外傷出血。該藥用植物中含有黃酮類化合物、花青素、綠原酸等多種生物活性成分[1]，黃酮類化合物具有抗炎[2]、抗氧化[3]、抗凋亡[4]、抗腫瘤[5]、抗菌[6]、調(diào)血脂和降血糖[7]等多種生物活性。關(guān)于披針骨牌蕨提取物的藥效研究目前鮮有報(bào)道。本研究中采用體外培養(yǎng)人臍靜脈血管內(nèi)皮細(xì)胞（HUVEC）的方法，建立高糖誘導(dǎo)HUVEC的氧化損傷模型，進(jìn)一步探討披針骨牌蕨總黃酮對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞損傷的保護(hù)作用及其作用機(jī)制，為開發(fā)披針骨牌蕨總黃酮治療心血管疾病提供參考。現(xiàn)報(bào)道如下。

1 材料、儀器與方法

1.1 材料與儀器

主要材料：披針骨牌蕨總黃酮(本研究室自備)；四甲基偶氮唑藍(lán)（MTT，南京凱基生物科技有限公司）；Ⅱ型膠原酶，維生素 C（美國Sigma公司）；胰蛋白酶（美國Hyclone公司）；二甲基亞砜(DMSO，分析純，美國Amresco公司）；RPMI1640培養(yǎng)基（美國Hyclone公司）；胎牛血清（杭州四季青公司）。丙二醛（MDA，批號(hào)為20140101），乳酸脫氫酶（LDH，批號(hào)為20140211），超氧化物歧化酶（SOD，批號(hào)為20140131），一氧化氮（NO，批號(hào)為20140031），一氧化氮合酶（NOS，批號(hào)為20140125）試劑盒均購于南京建成生物工程研究所；其他試劑均為分析純。健康新生兒臍帶由湘南學(xué)院附屬醫(yī)院婦產(chǎn)科提供。

主要儀器：MCO－15A型CO2培養(yǎng)箱（日本三洋公司）；CKX41型熒光倒置顯微鏡（日本Olympus公司）；JHT－DDC型超凈工作臺(tái)（山東省濟(jì)南潔康設(shè)備廠）；MK3型酶標(biāo)儀（芬蘭雷勃公司）；TGL－16G－A型臺(tái)式低溫離心機(jī)（上海安亭科學(xué)儀器廠）；LS－B50L－1型立式壓力蒸汽滅菌器（江陰濱江醫(yī)療設(shè)備有限公司）；FA1604型電子分析天平（上海精密儀器公司）。

1.2 方法

藥液制備：藥材全草用水洗凈，55℃鼓風(fēng)干燥48 h，冷卻后粉碎過篩，石油醚脫脂2 h，藥渣真空干燥至恒重，備用。藥渣以60%乙醇12倍量浸泡90 min，45℃下超聲處理（功率為450 W），重復(fù)提取2次，每次45 min，合并濾液，經(jīng)HPD－600型大孔樹脂，乙醇洗脫，減壓濃縮后，超純水定容為披針骨牌蕨總黃酮溶液，以蘆丁為標(biāo)準(zhǔn)液繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，三氯化鋁法測(cè)定質(zhì)量濃度。

細(xì)胞培養(yǎng)：取正常分娩的健康胎兒的臍帶，用4℃PBS沖洗靜脈內(nèi)殘血，剪去鉗痕，灌注0.15%膠原酶，37℃溫育15 min。收集消化液，并用4℃ PBS沖洗靜脈，合并兩液，以1 000 r／min轉(zhuǎn)速離心10 min后棄上清液，用含20%胎牛血清RPMI－1640制成均勻的細(xì)胞混懸液，并接種細(xì)胞，37℃及5%CO2條件下培養(yǎng)。24 h后半量換液，待細(xì)胞生長融合至80%時(shí)，消化傳代。試驗(yàn)用2～3代的細(xì)胞。

模型建立：選擇對(duì)數(shù)期生長的細(xì)胞，0.25%胰蛋白酶消化后輕輕吹打，制成均勻的細(xì)胞混懸液，計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)后，調(diào)整細(xì)胞濃度為每1 mL 1×105個(gè)后，再接種于96孔板中，每孔接種200 μL，每組設(shè)4個(gè)復(fù)孔，待細(xì)胞貼壁達(dá)融合狀態(tài)后，對(duì)照組加200 μL無血清培養(yǎng)基，模型組分別各加入用無血清培養(yǎng)基將葡萄糖配置為終質(zhì)量濃度為10，20，30，40，50 mmol／L的培養(yǎng)液 200 μL，分別作用12，24，48，72，96 h后測(cè)定MTT，于490 nm波長處測(cè)定吸光度值（A），以 A計(jì)算細(xì)胞生長抑制率，用來確定造模的最終濃度和作用時(shí)間。

抑制率（%）＝（A對(duì)照組－A試驗(yàn)組）／A對(duì)照組×100%

影響試驗(yàn)：正常對(duì)照組只加培養(yǎng)液孵育；高糖損傷模型組在培養(yǎng)液中加40 mmol／L的葡萄糖誘導(dǎo)損傷48 h；提取物組預(yù)先在培養(yǎng)液中分別加入終質(zhì)量濃度為100，200，400 mg／L的提取物總黃酮孵育24 h，再加入40 mmol／L的葡萄糖誘導(dǎo)損傷48 h；陽性對(duì)照組于培養(yǎng)液中加入維生素C(終質(zhì)量濃度為30 mg／L)孵育24 h后，再加入40 mmol／L的葡萄糖應(yīng)激損傷48 h。吸取細(xì)胞培養(yǎng)的上清液，嚴(yán)格按照試劑盒說明書方法，分別測(cè)定釋放LDH，MDA，SOD，NO，NOS的含量及活性，試驗(yàn)重復(fù)3次，每次4個(gè)復(fù)孔，取均值，并判斷細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷狀況。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 模型評(píng)價(jià)

HUVEC分別在不同濃度的葡萄糖（10，20，30，40，50 mmol／L）中共同孵育不同的時(shí)間（6，12，24，48，72 h），于490 nm波長處檢測(cè)細(xì)胞活力（OD），結(jié)果見表1和表2。與正常對(duì)照組（葡萄糖濃度為5.5 mmol／L）相比，10 mmol／L的葡萄糖作用72 h，20 mmol／L的葡萄糖作用48 h，30 mmol／L的葡萄糖作用24 h，40 mmol／L和50 mmol／L的葡萄糖均作用12 h。提示對(duì) HUVEC的OD值具有明顯抑制作用，并呈一定的時(shí)間和濃度依賴關(guān)系。各組葡萄糖對(duì)HUVEC活力的抑制率隨著葡萄糖濃度的增加和作用時(shí)間的延長而持續(xù)升高。故選擇40 mmol／L的葡萄糖作用48 h，抑制率接近30%，作為本試驗(yàn)的最佳造模條件。

2.2 對(duì)細(xì)胞SOD，MDA，LDH含量及活性的影響

與正常對(duì)照相組比較，高糖損傷模型組細(xì)胞培養(yǎng)上清液中細(xì)胞內(nèi)SOD含量減少，活性顯著下降，MDA的含量明顯上升，LDH含量、活性增高，均有顯著性差異（P＜0.01）。與高糖損傷模型組比較，提取物組具有抑制高糖損傷所致細(xì)胞脂質(zhì)氧化損傷、清除機(jī)體產(chǎn)生的自由基的作用，表現(xiàn)為細(xì)胞抗氧化物酶SOD的活性升高，脂質(zhì)過氧化物MDA的生成量減少，LDH的含量、活性下降，并與披針骨牌蕨總黃酮呈濃度－劑量依賴性關(guān)系。其中與低劑量提取物組有差異（P＜0.05），與中劑量提取物組和高劑量提取物組有顯著性差異（P＜0.01）。詳見表3。

表1 不同濃度葡萄糖對(duì)HUVEC OD值的影響（±s，n＝5）

表1 不同濃度葡萄糖對(duì)HUVEC OD值的影響（±s，n＝5）

注：與正常對(duì)照組比較， P＜0.05， P＜0.01。

組別正常對(duì)照組高糖損傷模型組 10 mmol／L 20 mmol／L 30 mmol／L 40 mmol／L 50 mmol／L 6 h 0.574±0.005 0.576±0.002 0.567±0.003 0.563±0.002 0.545±0.006 0.507±0.008 12 h 0.579±0.002 0.573±0.003 0.562±0.006 0.531±0.006 0.514±0.002 0.501±0.002 24 h 0.583±0.003 0.574±0.007 0.518±0.004 0.483±0.004 0.416±0.002 0.393±0.006 48 h 0.586±0.004 0.504±0.002 0.505±0.003 0.458±0.002 0.402±0.006 0.385±0.002 72 h 0.585±0.006 0.502±0.005 0.478±0.005 0.421±0.005 0.393±0.006 0.371±0.003

表2 不同時(shí)間和濃度的葡萄糖作用下HUVEC的抑制率（%，n＝5）

表3 披針骨牌蕨總黃酮對(duì)高糖誘導(dǎo)損傷HUVEC的SOD，MDA，LDH含量及活性的影響（±s，n＝4）

表3 披針骨牌蕨總黃酮對(duì)高糖誘導(dǎo)損傷HUVEC的SOD，MDA，LDH含量及活性的影響（±s，n＝4）

注：與正常對(duì)照組比較，＃P＜0.01；與高糖損傷模型組比較， P＜0.05， P＜0.01。表4同。

組別正常對(duì)照組高糖損傷模型組陽性對(duì)照組低劑量提取物組（100 mg／L）中劑量提取物組（200 mg／L）高劑量提取物組（400 mg／L）SOD（U／mL）21.356±0.213 15.985±0.218＃19.284±0.138 16.450±0.162 17.042±0.213 17.930±0.138 MDA（nmol／mL）0.278±0.082 0.770±0.070＃0.321±0.082 0.598±0.070 0.471±0.049 0.363±0.043 LDH（U／L）223.235±7.781 371.298±7.781＃297.267±3.720 323.462±2.278 307.517±2.630 296.128±3.720

表4 披針骨牌蕨總黃酮對(duì)高糖誘導(dǎo)損傷HUVEC的NO和NOS含量及活性的影響（±s，n＝4）

表4 披針骨牌蕨總黃酮對(duì)高糖誘導(dǎo)損傷HUVEC的NO和NOS含量及活性的影響（±s，n＝4）

組別正常對(duì)照組高糖損傷模型組陽性對(duì)照組低劑量提取物組（100 mg／L）中劑量提取物組（200 mg／L）高劑量提取物組（400 mg／L）NO（ mol／L）56.766±1.704 19.802±0.762＃39.604±0.762 26.073±0.660 30.363±0.762 34.984±1.078 NOS（U／mL）6.622±0.223 4.486±0.223＃6.179±0.037 4.918±0.043 5.474±0.026 6.031±0.043

2.3 對(duì)細(xì)胞NO生成量和NOS含量及活性的影響

與正常對(duì)照組比較，高糖損傷模型組NO的生成量和NOS的活性均明顯降低（P＜0.01）。與高糖損傷模型組比較，不同質(zhì)量濃度的提取物組NO合成量和NOS的活性均明顯升高，且在一定濃度范圍內(nèi)與提取物呈劑量依賴性升高關(guān)系(P＜0.01)。詳見表4。

3 討論

心腦血管病變是糖尿病的主要并發(fā)癥[8]。血管內(nèi)皮細(xì)胞是保護(hù)血管通透性的重要屏障[9－10]，能合成、分泌多種細(xì)胞因子和調(diào)節(jié)保護(hù)血管活性物質(zhì)的功能，在清除機(jī)體有害物質(zhì)、對(duì)抗動(dòng)脈粥樣硬化、平衡血管張力、調(diào)節(jié)血液流變性起到了很好的保護(hù)作用。長期高血糖可引起內(nèi)皮細(xì)胞膜脂質(zhì)過氧化，血管內(nèi)皮細(xì)胞的自身抗氧化能力下降，從而導(dǎo)致內(nèi)皮細(xì)胞膜調(diào)節(jié)功能障礙和紊亂[11]。尋找保護(hù)血管內(nèi)皮細(xì)胞活性的藥物，是防治心腦血管疾病的靶點(diǎn)之一[12]。黃酮類化合物是植物代謝過程中產(chǎn)生的一類重要的天然有機(jī)化合物，其藥理活性廣泛，具有清除自由基、抗動(dòng)脈粥樣硬化、抗脂質(zhì)氧化、抗炎等作用[13]。

本試驗(yàn)中通過建立高糖誘導(dǎo)HUVEC氧化應(yīng)激損傷模型，初步探討披針骨牌蕨總黃酮對(duì)血管內(nèi)皮細(xì)胞的保護(hù)作用及可能的機(jī)制。MDA水平可以反映細(xì)胞膜發(fā)生脂質(zhì)過氧化反應(yīng)的強(qiáng)度，間接反映內(nèi)皮細(xì)胞發(fā)生氧化應(yīng)激后自身的損傷程度[14]；LDH是細(xì)胞損傷后的代謝產(chǎn)物，反映細(xì)胞膜的通透性和損傷程度；SOD則是細(xì)胞產(chǎn)生的一種抗氧化酶，是機(jī)體內(nèi)清除自由基的第一道防線[15]。本研究結(jié)果顯示，披針骨牌蕨總黃酮可使高糖損傷模型組的LDH和MDA釋放量減少，SOD的活性明顯增加，且均與披針骨牌蕨總黃酮呈濃度依賴性。說明披針骨牌蕨總黃酮可以改善氧化應(yīng)激損傷引起的細(xì)胞膜通透性增加，增強(qiáng)細(xì)胞對(duì)抗脂質(zhì)的氧化能力，保護(hù)內(nèi)皮細(xì)胞膜的結(jié)構(gòu)與功能的完整性，抵抗氧化應(yīng)激對(duì)血管內(nèi)皮細(xì)胞的損傷。

NO是反映細(xì)胞內(nèi)皮功能的重要指標(biāo)，經(jīng)NOS催化由血管內(nèi)皮細(xì)胞合成并分泌，具有調(diào)節(jié)內(nèi)皮細(xì)胞舒張、抵抗平滑肌細(xì)胞增殖、抗血小板聚集等作用[16]，是心血管系統(tǒng)功能重要的調(diào)節(jié)因子，其水平的升高或降低均可導(dǎo)致血管功能紊亂[17]。高糖損傷模型組NO含量和NOS活性均顯著降低。加入披針骨牌蕨總黃酮保護(hù)后，NO生成量和NOS活性均明顯增高（P＜0.01），且與披針骨牌蕨總黃酮呈劑量依賴性，提示披針骨牌蕨總黃酮可通過調(diào)節(jié)NO生成量來保護(hù)內(nèi)皮細(xì)胞免受氧化應(yīng)激的損傷，且與披針骨牌蕨總黃酮呈質(zhì)量濃度依賴性升高關(guān)系。

研究表明，披針骨牌蕨總黃酮對(duì)高糖誘導(dǎo)的HUVEC損傷模型具有明顯的保護(hù)作用，可能通過增強(qiáng)抗氧化物酶的活性而減少脂質(zhì)過氧化副產(chǎn)物的形成，從而減少HUVEC氧化應(yīng)激后自由基的產(chǎn)生，且與總黃酮質(zhì)量濃度成比例增強(qiáng)。初步作用機(jī)制可能與披針骨牌蕨總黃酮在對(duì)抑制脂質(zhì)的氧化、抗衰老、抗自由基、增強(qiáng)抗氧化酶（SOD，NOS）的活性及NO的釋放量有關(guān)。后續(xù)研究需進(jìn)一步探討披針骨牌蕨總黃酮對(duì)血管內(nèi)皮細(xì)胞應(yīng)激損傷的保護(hù)作用及作用機(jī)制，可對(duì)未來開發(fā)新型治療心血管疾病的天然中藥材提供理論支持。

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Protective Effect of Total Flavonoids from Lepiologrammitis Diversa on High Glucose－Induced Oxidative Damage in Vascular Endothelial Cells

Zhang Wei,Luo You,Li Yating,Hu Xiaofeng,Tang Weijun,Peng Liangjie
(Xiangnan University,Chenzhou,Hunan,China 423000)

Objective To investigate the protective effect of total flavonoids from Lepiologrammitis Diversa on high glucose－induced oxidative damage in vascular endothelial cells.Methods To establish oxidative damage models of human umbilical vein endothelial cells (HUVEC)induced by high glucose and to carry out drug test.The models were divided into the normal control group(the mass concentration of glucose was 5.5 mmol／L),high glucose injury group(the mass concentration of glucose was 40 mmol／L),extract group (the mass concentration of total flavonoids from Lepiologrammitis Diversa were 100,200,400 mg／L)and positive control group(the mass concentration of vitamin C was 30 mg／L).The cell survival rate was measured by MTT assay,the changes of release and activity of LDH,MDA,SOD,NO and NOS in cells were determined by diagnostic reagent kit.Results In the extract group,the release amount of MDA was decreased significantly,the release amount and activity of LDH was decreased significantly,the activity of SOD was increased significantly,and the quantity and activity of NO and NOS were increased significantly(P＜0.05),in a certain concentration range,and the totalflavonoidsfrom Lepiologrammitis Diversa showed dose dependentrelationship in a certain massconcentration range.Conclusion Total flavonoids from Lepiologrammitis Diversa have protective effect on oxidative damage induced by high glucose in HUVEC.The preliminary mechanism may be related to the increase of antioxidase activity,the scavenging of free radicals and the increase of antioxidant capacity.

total flavonoids from Lepiologrammitis Diversa;human umbilical vein endothelial cells;high glucose;oxidative stress

2017－05－09；

2017－05－31)

10.3969／j.issn.1006－4931.2017.15.001

湖南省衛(wèi)生計(jì)生委科研計(jì)劃項(xiàng)目[C2016047]；湖南省教育廳科學(xué)研究項(xiàng)目[16C1495]；湘南學(xué)院校級(jí)科研課題立項(xiàng)資助項(xiàng)目[2015XB10]；湖南省大學(xué)生研究性學(xué)習(xí)和創(chuàng)新性實(shí)驗(yàn)計(jì)劃項(xiàng)目[湘教通〔2014〕248號(hào)－489]。

張偉（1980－），男，碩士研究生，講師，研究方向?yàn)樾难苌?，（電子信箱?23489839＠qq.com。

彭梁杰（1981－），男，碩士研究生，研究方向?yàn)樾难懿±砩韺W(xué)，（電子信箱）23859771＠qq.com。

R285.5；R282.71

A

1006－4931(2017)15－0001－04