舒血寧注射液不良反應(yīng)及其致敏物質(zhì)篩選研究

易艷++李春英++張宇實(shí)++趙雍++王連嵋++潘辰++劉素彥

[摘要]該研究通過(guò)豚鼠主動(dòng)全身過(guò)敏試驗(yàn)和大鼠被動(dòng)皮膚過(guò)敏試驗(yàn)及小鼠類(lèi)過(guò)敏試驗(yàn)初步判定舒血寧注射液（Shuxuening injection，SXNI） 的“過(guò)敏反應(yīng)”可能不一定是IgE介導(dǎo)的真正的過(guò)敏反應(yīng)，而是以類(lèi)過(guò)敏反應(yīng)為主，并進(jìn)一步證明SXNI的類(lèi)過(guò)敏反應(yīng)有一定的批間差異和劑量依賴性，建議建立SXNI類(lèi)過(guò)敏反應(yīng)檢測(cè)法，對(duì)每批生產(chǎn)的產(chǎn)品進(jìn)行類(lèi)過(guò)敏反應(yīng)檢測(cè)，及時(shí)發(fā)現(xiàn)并控制產(chǎn)品風(fēng)險(xiǎn)，另外臨床使用時(shí)應(yīng)嚴(yán)格控制劑量濃度。接著又對(duì)舒血寧注射液中的主要單體成分及銀杏提取物的不同流分進(jìn)行了小鼠類(lèi)過(guò)敏反應(yīng)檢測(cè)，結(jié)果證明舒血寧注射液中致敏物質(zhì)可能主要存在于主要含黃酮醇苷的YXY3流分中，最后對(duì)YXY3進(jìn)行了進(jìn)一步化學(xué)分離得到4個(gè)化學(xué)組分，小鼠類(lèi)過(guò)敏試驗(yàn)證明其中YXY31和YXY32是舒血寧注射液中的主要致敏成分，但其具體化學(xué)成分還有待后續(xù)試驗(yàn)進(jìn)行深入研究。

[關(guān)鍵詞]舒血寧注射液；過(guò)敏反應(yīng)；類(lèi)過(guò)敏反應(yīng)；致敏物質(zhì)

Adverse reaction and screening of sensitizing substance of

Shuxuening injection

YI Yan， LI Chunying， ZHANG Yushi， ZHAO Yong， WANG Lianmei， PAN Chen， LIU Suyan，

TIAN Jingzhuo， HAN Jiayin， LIANG Aihua*

（Key Laboratory of Beijing for Identification and Safety of Chinese Medicine， Institute of Chinese Materia Medica，

China Academy of Chinese Medical Sciences， Beijing 100700， China）

[Abstract]In this study， by the means of the active systemic allergy test in guinea pigs， passive skin allergy test in rats and pseudoallergic test in mice， it was determined that the "allergic reaction" of Shuxuening injection（SXNI） may not be a true IgEmediated allergic reactions， but mainly of pseudoallergic reaction Further pseudoallergic test proved that the pseudoallergic reactions of SXNI had difference between batches and showed dose dependence， so it was recommended to establish SXNI pseudoallergic reaction detection method for timely detecting and controlling the product risk of each batch products In addition， as the pseudoallergic reactions of SXNI were dosedependent， the dose and concentration of SXNI should be strictly controlled in clinical use Then the main pseudoallergenic reaction test was conducted for the main monomer components in SXNI and the different fractions of Ginkgo biloba extract in mice， and the results showed that the sensitizing substances may mainly exist in YXY3 fractions containing flavonol glycosides By further chemically separating YXY3， we got four chemical components Among these four components， YXY31 and YXY32 were testified as the main allergenic components in SXNI through pseudoallergic test in mice To make sure the specific chemical constituent that is responsible for the pseudoallergic reaction， indepth study in followup experiments should be needed

[Key words]Shuxuening injection； allergic reactions； pseudoallergic reactions； pseudoallergenic substances

舒血寧注射液（Shuxuening injection，SXNI） 是銀杏葉或銀杏葉提取物經(jīng)加工制成的滅菌水溶液，有效成分是黃酮和內(nèi)酯，其主要功效為擴(kuò)張血管，改善微循環(huán)，臨床上主要用于缺血性心腦血管疾病，冠心病，心絞痛，腦栓塞，腦血管痙攣等疾病[13]。SXNI目前屬于內(nèi)科使用量第一的中藥注射劑，國(guó)內(nèi)有9家獲批企業(yè)生產(chǎn)SXNI，年銷(xiāo)售量逾25億元，使用人次250余萬(wàn)人，SXNI治療疾病數(shù)量也由2010年138個(gè)，增加至2011年154個(gè)。隨著SXNI在臨床的廣泛使用，其不良反應(yīng)發(fā)生率也呈上升趨勢(shì)，國(guó)家藥品不良反應(yīng)年度監(jiān)測(cè)報(bào)告顯示在有不良反應(yīng)報(bào)道的中藥注射劑中SXNI的不良反應(yīng)發(fā)生率連續(xù)3年排名前十（2013—2015年），2016年達(dá)到第5，國(guó)家食品藥品監(jiān)督管理總局2013年曾根據(jù)監(jiān)測(cè)評(píng)價(jià)結(jié)果對(duì)舒血寧注射液的說(shuō)明書(shū)進(jìn)行修訂，藥品說(shuō)明書(shū)中介紹的不良反應(yīng)（adverse drug reaction，ADR）臨床表現(xiàn)主要為過(guò)敏樣反應(yīng)，包括皮膚附件損害（潮紅、皮疹，皮下出血，過(guò)敏性皮炎等），全身性損害（寒戰(zhàn)、高熱、疼痛、血管神經(jīng)性水腫等），呼吸系統(tǒng)損害（呼吸困難、哮喘等），心血管系統(tǒng)損害（心悸、血壓下降等），消化系統(tǒng)損害（胃腸道不適、嘔吐等），另外還有可能出現(xiàn)精神及神經(jīng)系統(tǒng)損害等，嚴(yán)重者會(huì)出現(xiàn)過(guò)敏性休克。當(dāng)前對(duì)于SXNI引發(fā)的ADR的主要類(lèi)型、機(jī)制及其中的可能致敏物質(zhì)還沒(méi)有明確報(bào)道[48]，本研究從過(guò)敏反應(yīng)和類(lèi)過(guò)敏反應(yīng)兩個(gè)方面對(duì)SXNI注射液誘發(fā)的ADR反應(yīng)進(jìn)行判別，并對(duì)其主要致敏物質(zhì)進(jìn)行初步篩選，從而為SXNI的ADR預(yù)防及臨床安全使用，提高用藥安全性提供科學(xué)依據(jù)。endprint

1材料

11供試品及試劑

SXNI批號(hào)150402C2，150403C1，150404C1；銀杏提取物YXY1，YXY2，YXY3，YXY4，YXY5，YXY6，YXY31，YXY32，YXY33，YXY34均由國(guó)內(nèi)某藥企生產(chǎn)；蘆?。ㄅ?hào)20150303）、白果內(nèi)酯（批號(hào)150614）、異鼠李素3O蕓香糖苷（批號(hào)150126）、白果新酸（批號(hào)14092902）、銀杏內(nèi)酯A（批號(hào)150514）、銀杏內(nèi)酯B（批號(hào)150513）、銀杏內(nèi)酯C（批號(hào)150610）、銀杏內(nèi)酯J（批號(hào)150614）均購(gòu)自深圳海瑞特生物科技有限公司；伊文思藍(lán)（Evans blue， EB，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，批號(hào)20140228）；5%葡萄糖注射液（山東齊都藥業(yè)有限公司，批號(hào)8B16011903）；甲酰胺（天津光復(fù)精細(xì)化工研究所，批號(hào)20150723）；組胺（國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，批號(hào)F20111109）；弗氏完全佐劑（Sigma公司，批號(hào)SLBH7316V）；弗式不完全佐劑（Sigma公司，批號(hào)011M8710）；卵清蛋白（Sigma公司）。

12動(dòng)物

Hartley豚鼠，體質(zhì)量350～400 g，Wistar大鼠，體質(zhì)量220～260 g，BN大鼠，體質(zhì)量200～240 g，ICR小鼠，體質(zhì)量23～25 g，均購(gòu)于北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司，許可證號(hào)SCXK（京）20120001。所有動(dòng)物于實(shí)驗(yàn)前適應(yīng)性飼養(yǎng)2 d，溫度20～23 ℃，相對(duì)濕度為40%～70%，12 h明暗周期照明。動(dòng)物自由飲食飲水，使用由北京市科奧協(xié)力飼料有限公司提供的小鼠顆粒飼料，水則為純凈水。

2方法

21SXNI豚鼠主動(dòng)過(guò)敏試驗(yàn)（active anaphylaxis test，ASA）

211劑量設(shè)置根據(jù)說(shuō)明書(shū)，60 kg成人靜脈滴注每日20 mL，則劑量為033 mL·kg-1人，換算成豚鼠等效劑量約為186 mL·kg-1（033×565=186 mL·kg-1），而腹腔致敏體積約為4 mL·kg-1。為了增強(qiáng)舒血寧注射液的致敏性，加入了佐劑和藥物混合，即將原液與佐劑按1∶1的比例研磨均勻后對(duì)豚鼠進(jìn)行腹腔注射致敏。

212致敏及激發(fā)方法根據(jù)指導(dǎo)原則[9]，各組于試驗(yàn)第1， 3， 5天分別進(jìn)行腹腔注射致敏，對(duì)照組腹腔注射5%葡萄糖注射液；佐劑對(duì)照組第1天注射弗氏完全佐劑與5%葡萄糖注射液均勻混合液，第3， 5天則注射弗氏不完全佐劑與5%葡萄糖注射液的混合研磨液；SXNI高劑量和低劑量組第1天則腹腔分別注射05，025 mL·mL-1SXNI葡萄糖注射液與弗氏完全佐劑混合研磨液，第3， 5天則腹腔注射上述濃度的SXNI與弗式不完全佐劑混合研磨液。 陽(yáng)性藥組腹腔注射05 mg/只的卵清蛋白（OVA）。末次致敏后14 d和21 d，各組豚鼠1次性靜脈激發(fā)對(duì)應(yīng)致敏2倍劑量的藥物。靜脈注射后30 min，詳細(xì)觀察每只動(dòng)物的反應(yīng)癥狀出現(xiàn)和消失的時(shí)間。

213結(jié)果評(píng)價(jià)[9] 按表1判斷過(guò)敏反應(yīng)發(fā)生程度，計(jì)算過(guò)敏反應(yīng)發(fā)生率。根據(jù)過(guò)敏反應(yīng)發(fā)生率和發(fā)生程度進(jìn)行綜合判斷，0（）：過(guò)敏反應(yīng)陰性；1～4癥狀（+）：過(guò)敏反應(yīng)弱陽(yáng)性；5～10癥狀（）：過(guò)敏反應(yīng)陽(yáng)性；11～19癥狀（）：過(guò)敏反應(yīng)強(qiáng)陽(yáng)性；20（）：過(guò)敏反應(yīng)極強(qiáng)陽(yáng)性。

22SXNI大鼠被動(dòng)皮膚過(guò)敏試驗(yàn)（passive cutaneous anaphylaxis，PCA）

221劑量設(shè)置SXNI臨床人擬用量為033 mL·kg-1，換算成大鼠等效劑量約為21 mL·kg-1（033×65=21 mL·kg-1），所以本試驗(yàn)選用致敏低劑量組為10 mL·kg-1，致敏高劑量組為20 mL·kg-1（相當(dāng)于臨床劑量）。為了更好的誘發(fā)出SXNI致大鼠過(guò)敏產(chǎn)生的抗體，將注射液與佐劑按1∶1的比例研磨均勻后對(duì)BN大鼠進(jìn)行腹腔注射致敏，注射體積為4 mL·kg-1。

222試驗(yàn)方法大鼠抗血清制備：致敏首日，加佐劑組將SXNI與弗氏完全佐劑混合均勻?qū)N大鼠進(jìn)行腹腔注射，無(wú)佐劑致敏組直接腹腔注射舒血寧注射液，陽(yáng)性藥組則腹腔注射卵清蛋白3 mg/只，佐劑對(duì)照組注射弗氏完全佐劑與5%葡萄糖注射液研磨的混合液。試驗(yàn)第3天和第5天進(jìn)行加強(qiáng)致敏：除將弗氏完全佐劑換成弗氏不完全佐劑外，其他試劑配制及注射同首次致敏。末次致敏后第14天進(jìn)行腹主動(dòng)脈取血[10%水合氯醛，03 mL·（100 g）-1進(jìn)行麻醉]，分離血清，進(jìn)行后續(xù)PCA試驗(yàn)。

PCA試驗(yàn)：上述各組抗血清及正常血清用5%葡萄糖注射液稀釋成原液，1∶2，1∶4，1∶8 4個(gè)濃度。在Wistar大鼠背部預(yù)先脫毛的皮內(nèi)注射各對(duì)應(yīng)組的抗血清01 mL，每只大鼠背上脊柱兩側(cè)各注射2個(gè)點(diǎn)，共注射4個(gè)點(diǎn)。每只大鼠對(duì)應(yīng)1個(gè)致敏大鼠血清，4個(gè)點(diǎn)分別為不同稀釋度的血清，24 h后，各組靜脈注射與致敏劑量相同的含06%伊文思藍(lán)的激發(fā)抗原（藥物終濃度低、高劑量組分別為025，05 mL·mL-1），注射體積為4 mL·kg-1。靜脈注射后30 min，處死各組動(dòng)物，剪取背部皮膚藍(lán)斑，進(jìn)行藍(lán)斑測(cè)定： 1/2藍(lán)斑的長(zhǎng)短徑之和，并計(jì)算藍(lán)斑陽(yáng)性率。

23不同批號(hào)SXNI小鼠類(lèi)過(guò)敏反應(yīng)評(píng)價(jià)

231劑量和濃度選擇SXNI臨床劑量換算成小鼠等效劑量3 mL·kg-1；臨床使用時(shí)稀釋到250～500 mL 5%葡萄糖注射液中進(jìn)行滴注，則注射濃度為004～008 mL·mL-1。本試驗(yàn)中，選取臨床最大濃度的等倍、2倍和4倍作為試驗(yàn)濃度，因?yàn)樾∈笞⑸潴w積為20 mL·kg-1，所以此濃度下注射劑量為16，32，64 mL·kg-1，劑量分別相當(dāng)于臨床劑量的1/2、等倍和2倍劑量。

232類(lèi)過(guò)敏評(píng)價(jià)方法具體步驟可參見(jiàn)本實(shí)驗(yàn)室已建立的小鼠類(lèi)過(guò)敏檢測(cè)模型[1011]，各組小鼠經(jīng)尾靜脈緩慢推注相應(yīng)濃度的受試物（陰性對(duì)照液、陽(yáng)性對(duì)照液、不同濃度SXNI）與08%EB溶液1∶1混合溶液，給藥后30 min，觀察動(dòng)物的一般反應(yīng)、耳廓藍(lán)染的動(dòng)物數(shù)計(jì)算反應(yīng)率（%）（耳廓藍(lán)染動(dòng)物數(shù)/組內(nèi)總動(dòng)物數(shù)×100%）；對(duì)耳藍(lán)染面積進(jìn)行評(píng)分，見(jiàn)表2。然后，脫頸椎處死小鼠，沿耳根剪下雙耳，剪碎，用甲酰胺溶液室溫避光浸泡48 h后，用200目鋼篩網(wǎng)過(guò)濾浸泡液，將濾液加入48孔培養(yǎng)板中，用酶標(biāo)儀（波長(zhǎng)610 nm）檢測(cè)吸光度。以EB作標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算樣本中EB含量。endprint

24SXNI不同單體成分類(lèi)過(guò)敏物質(zhì)篩選研究

241劑量和濃度選擇已知SXNI臨床劑量換算成小鼠等效劑量為3 mL·kg-1，根據(jù)說(shuō)明書(shū)，SXNI中銀杏提取物為35 g·L-1，其中含總黃酮醇苷084 g·L-1，而蘆丁、異鼠李素3O蕓香糖苷均屬總黃酮苷類(lèi)，其中異鼠李素3O蕓香糖苷約占

總黃酮苷的22%，所以異鼠李素3O蕓香糖苷換算成小鼠等效劑量為055 mg·kg-1（084×022×3）；又連翹酯苷A 006 g·L-1，白果內(nèi)酯、銀杏內(nèi)酯A～J均屬銀杏內(nèi)酯類(lèi)，均以006 g·L-1為基礎(chǔ)值，換算成小鼠等效劑量為018 mg·kg-1（006×3）；白果新酸為銀杏酸類(lèi)，銀杏酸為有害物質(zhì)，其注射液中含量占總含量應(yīng)小于百萬(wàn)分之一，按百萬(wàn)分之一含量算，則其注射液中小鼠等效劑量為0000 01 mg·kg-1（35×3/106），由于上述物質(zhì)成分小鼠等效劑量都較低，為了方便操作及最大程度暴露可能的致類(lèi)過(guò)敏作用，本研究將各成分試驗(yàn)劑量設(shè)為小鼠等效劑量的2～10倍，白果新酸劑量設(shè)為3 000倍以上。

242類(lèi)過(guò)敏檢測(cè)方法首先稱(chēng)取上述各成分藥物溶解后再與08%EB溶液按1∶1等體積混合，分別得到各組注射所需藥物的終濃度后，根據(jù)各只動(dòng)物體質(zhì)量，將上述濃度的受試物藥液按照20 mL·kg-1對(duì)ICR小鼠進(jìn)行尾靜脈注射。給藥后觀察30 min內(nèi)動(dòng)物的耳廓藍(lán)染情況，記錄每組出現(xiàn)耳廓藍(lán)染發(fā)生率，耳廓藍(lán)染面積評(píng)分方法、耳廓內(nèi)EB含量檢測(cè)方法同232。

25銀杏葉提取物類(lèi)過(guò)敏物質(zhì)篩選研究

251提取物制備稱(chēng)取一定銀杏提取物，溶于95%乙醇中，先真空抽濾2次，再過(guò)微孔濾膜，然后在50 mm工業(yè)制備色譜系統(tǒng)，進(jìn)行4針制備圖譜，4針重復(fù)性很好，按照?qǐng)D譜分6段接取流分，合并相同流分，進(jìn)行旋蒸濃縮處理，得到固體樣品YXY1，YXY2，YXY3，YXY4，YXY5和YXY6。分析得知，YXY1以內(nèi)酯化合物為主，銀杏內(nèi)酯A，B，C、白果內(nèi)酯總質(zhì)量分?jǐn)?shù)約為42%；YXY3以黃酮醇苷類(lèi)化合物為主，主要是17個(gè)指紋峰化合物，黃酮醇苷類(lèi)化合物質(zhì)量分?jǐn)?shù)約為55%；YXY2，YXY4，YXY5和YXY6則主要是雜質(zhì)。

252劑量設(shè)置已知每克銀杏提取物中約分離出008 g YXY1，007 g YXY2，017 g YXY3，001 g YXY4，003 g YXY5和0007 g YXY6，而每克提取物可制備286 mL注射液（SNXI中含銀杏提取物35 g·L-1），所以小鼠臨床等效劑量（3 mL）注射液中約含有YXY1 084 mg（008/286×3×1 000），YXY2 073 mg（007/286×3×1 000），YXY3 178 mg（017/286×3×1 000），YXY4 01 mg（017/286×3×1 000），YXY5 031 mg（003/286×3×1 000），YXY6 007 mg（0007/286×3×1 000）。試驗(yàn)中為了結(jié)果的可比性并最大程度暴露各部分可能的類(lèi)過(guò)敏反應(yīng)，所有提取物均選用相同劑量。

253類(lèi)過(guò)敏檢測(cè)方法同242項(xiàng)。

26YXY3樣品進(jìn)一步開(kāi)展類(lèi)過(guò)敏物質(zhì)研究

由25中試驗(yàn)結(jié)果知銀杏提取物中YXY3存在致敏物質(zhì)的可能性較大，所以對(duì)YXY3進(jìn)行化學(xué)細(xì)分，具體步驟同251，分4段接取流分，得到4個(gè)固體樣品：YXY31，YXY32，YXY33和YXY34。另外因64 mL·kg-1SXNI能導(dǎo)致小鼠發(fā)生明顯血管通透性增高反應(yīng)，所以推算224 mg·kg-1（64×35）及以上劑量時(shí)含有致敏物質(zhì)的銀杏葉提取物有誘發(fā)小鼠類(lèi)過(guò)敏反應(yīng)的可能。為了結(jié)果的可比性，不同化學(xué)成分群均選用相同劑量。類(lèi)過(guò)敏檢測(cè)方法同242。

27統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

豚鼠主動(dòng)全身過(guò)敏試驗(yàn)和大鼠被動(dòng)皮膚過(guò)敏試驗(yàn)中，各給藥組陽(yáng)性率分別與對(duì)照組進(jìn)行比較，用SPSS 160統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行非參數(shù)檢驗(yàn)；小鼠類(lèi)過(guò)敏試驗(yàn)中，耳藍(lán)染陽(yáng)性反應(yīng)率和耳藍(lán)染率采用卡方檢驗(yàn)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，耳廓藍(lán)染面積采用非參數(shù)檢驗(yàn)，EB滲出量數(shù)據(jù)用±s表示，用SPSS 160統(tǒng)計(jì)軟件ANOVA程序進(jìn)行方差分析。

3結(jié)果

31SXNI致豚鼠全身主動(dòng)過(guò)敏試驗(yàn)

對(duì)照組和佐劑對(duì)照組豚鼠多次致敏再激發(fā)后均沒(méi)有出現(xiàn)明顯過(guò)敏樣反應(yīng)。由于陽(yáng)性藥卵清蛋白是大分子蛋白物質(zhì)，致敏后首次激發(fā)即發(fā)生了明顯過(guò)敏反應(yīng)，所有動(dòng)物均死亡。SXNI不同方式腹腔致敏后，首次激發(fā)（末次致敏后14 d），所有致敏組豚鼠均沒(méi)有出現(xiàn)明顯過(guò)敏反應(yīng)癥狀，而再次激發(fā)（末次致敏后21 d），SXNI致敏組多數(shù)豚鼠均出現(xiàn)了搔鼻癥狀（+），數(shù)量見(jiàn)表3。另外3個(gè)SXNI組各有1只豚鼠出現(xiàn)了咳嗽癥狀（），以上觀察均持續(xù)到注射后4 h，上述陽(yáng)性反應(yīng)癥狀約2 h后恢復(fù)正常。

32SXNI致大鼠被動(dòng)皮膚過(guò)敏試驗(yàn)

對(duì)照組致敏血清沒(méi)有誘發(fā)藍(lán)斑，陽(yáng)性藥卵清蛋白組血清則誘發(fā)了明顯的藍(lán)斑，并且隨著血清濃度增大，藍(lán)斑陽(yáng)性率和藍(lán)斑面積逐漸增多增大，具有濃度相關(guān)性，各SXNI組血清則沒(méi)有誘發(fā)藍(lán)斑產(chǎn)生，見(jiàn)表4。

33不同批號(hào)SXNI小鼠類(lèi)過(guò)敏檢測(cè)

小鼠靜脈注射5%葡萄糖注射液后，均未見(jiàn)明顯耳廓藍(lán)染；陽(yáng)性對(duì)照組組胺10 mg·kg-1給小鼠靜脈注射后，100%的動(dòng)物均可見(jiàn)以血管通透性增高為表現(xiàn)的明顯類(lèi)過(guò)敏反應(yīng)。各批號(hào)SXNI 16 mL·kg-1（臨床1/2倍劑量，等倍濃度）均未導(dǎo)致小鼠發(fā)生明顯耳廓血管通透性增高反應(yīng)，不引起小鼠類(lèi)過(guò)敏反應(yīng)；當(dāng)劑量增加到32 mL·kg-1時(shí)，3個(gè)批號(hào)的SXNI都使小鼠發(fā)生血管通透性升高反應(yīng)；最后當(dāng)劑量增加到64 mL·kg-1，即相當(dāng)于臨床2倍劑量，4倍濃度時(shí)，所有批號(hào)的SXNI耳藍(lán)染程度進(jìn)一步加重，83%以上的小鼠發(fā)生耳藍(lán)染，EB滲出量也明顯增加。3個(gè)批號(hào)之間的SXNI誘發(fā)的類(lèi)過(guò)敏反應(yīng)沒(méi)有明顯差異，見(jiàn)圖1。endprint

34SXNI中主要成分單體致類(lèi)過(guò)敏反應(yīng)

小鼠靜脈注射5%葡萄糖注射液后，均未見(jiàn)明顯耳廓藍(lán)染；陽(yáng)性對(duì)照組組胺10 mg·kg-1給小鼠靜脈注射后，100%的動(dòng)物均可見(jiàn)以血管通透性增高為表現(xiàn)的明顯類(lèi)過(guò)敏反應(yīng)，與對(duì)照組相比，EB滲出明顯增加（P<001）。

除了白果新酸以外，其他成分均采用臨床劑量的10倍作為最高給藥劑量，臨床劑量的2倍作為低劑量。為了達(dá)到充分暴露劑量，白果新酸的高、低劑量給藥劑量則分別為臨床的6萬(wàn)倍和3 000倍。各受試單體成分藥物各劑量即使是最高劑量下均未導(dǎo)致小鼠發(fā)生明顯肉眼可見(jiàn)的耳廓血管通透性增高反應(yīng)；但EB滲出量都比對(duì)照組增高，且隨著各單體成分劑量增加，EB滲出有逐漸增高趨勢(shì)，見(jiàn)圖2。

35SXNI提取物中不同極性物質(zhì)類(lèi)過(guò)敏反應(yīng)

根據(jù)舒血寧注射液提取這6個(gè)流分的得率折算，YXY5和YXY6高劑量組即相當(dāng)于臨床劑量的355（110/031）和1 517（110/007）倍時(shí)，均沒(méi)有誘發(fā)小鼠發(fā)生明顯耳廓藍(lán)染反應(yīng)，EB滲出量與對(duì)照組相比，也沒(méi)有明顯增加；YXY2，YXY3和YXY4各極性成分藥物在劑量為21 mg·kg-1時(shí)均沒(méi)有誘發(fā)小鼠發(fā)生耳廓藍(lán)染反應(yīng)，當(dāng)劑量增加到110 mg·kg-1時(shí)，YXY2，YXY3和YXY4劑量水平分別相當(dāng)于各自臨床劑量的151（110/073），62（110/178），1 100（110/01）倍時(shí)，均誘發(fā)100%小鼠發(fā)生耳廓藍(lán)染，耳藍(lán)染評(píng)分和EB滲出量與對(duì)照相比，均明顯增加；而YXY1劑量此時(shí)相當(dāng)于臨床的131倍（110/084），雖然沒(méi)有誘發(fā)小鼠發(fā)生明顯的耳藍(lán)染，但其小鼠耳EB滲出量與對(duì)照相比也明顯增加。綜合劑量分析，YXY1，YXY2和YXY4出現(xiàn)類(lèi)過(guò)敏反應(yīng)的劑量倍數(shù)都大于100倍，而只有YXY3的劑量倍數(shù)相對(duì)較小，由此推測(cè)致敏物質(zhì)可能主要存在于YXY3流分中，見(jiàn)圖3。

36SXNI中致類(lèi)過(guò)敏物質(zhì)進(jìn)一步研究

由下述結(jié)果可知，YXY31和YXY32劑量為448 mg·kg-1，有50%的小鼠發(fā)生耳廓藍(lán)染，EB滲出量也比對(duì)照組明顯升高，二者在224 mg·kg-1劑量水平均未見(jiàn)類(lèi)過(guò)敏反應(yīng)。已知1 g YXY3約分離出022 g YXY31和025 g YXY32，根據(jù)劑量換算，448 mg·kg-1 YXY31和YXY32相當(dāng)于臨床劑量的112倍[448/（022×017）]。YXY33和YXY34即使在較高劑量情況下也未引發(fā)小鼠發(fā)生明顯耳廓藍(lán)染，見(jiàn)圖4。

4討論

本研究結(jié)果顯示，SXNI在豚鼠主動(dòng)全身過(guò)敏試驗(yàn)中顯示有過(guò)敏反應(yīng)弱陽(yáng)性，但考慮到嚙齒類(lèi)動(dòng)物有理毛搔鼻的生活習(xí)性，所有暫不排除假陽(yáng)性的可能，另外在大鼠被動(dòng)皮膚過(guò)敏試驗(yàn)中，大鼠反復(fù)致敏條件下并未誘導(dǎo)出IgE產(chǎn)生，提示SXNI的過(guò)敏反應(yīng)可能不是IgE介導(dǎo)的抗原抗體反應(yīng)。本研究組前期創(chuàng)建了檢測(cè)藥物類(lèi)過(guò)敏反應(yīng)的新方法——小鼠類(lèi)過(guò)敏反應(yīng)模型，已經(jīng)通過(guò)很多中藥注射劑和西藥注射劑試驗(yàn)，證明該模型可以敏感、可靠地檢測(cè)出注射劑的類(lèi)過(guò)敏反應(yīng)。本研究中小鼠首次靜脈注射SXNI后，可產(chǎn)生明顯的類(lèi)過(guò)敏反應(yīng)，發(fā)生迅速，在靜脈注射液5～10 min即可出現(xiàn)，約15～20 min基本達(dá)到最強(qiáng)，動(dòng)物反應(yīng)發(fā)生特點(diǎn)與臨床反應(yīng)很相似（在小鼠耳廓肉眼可見(jiàn)到明顯的血管通透性增高和血漿外滲癥狀，這種癥狀與臨床人發(fā)生藥物過(guò)敏時(shí)出現(xiàn)的皮疹以及皮膚紅腫癥狀相似）。綜合以上結(jié)果分析，SXNI的“過(guò)敏反應(yīng)”可能不一定是IgE介導(dǎo)的真正的過(guò)敏反應(yīng)，而是以類(lèi)過(guò)敏反應(yīng)為主。該模型適用于SXNI的類(lèi)過(guò)敏反應(yīng)檢測(cè)，通過(guò)血管滲出面積以及滲出物的量可評(píng)價(jià)類(lèi)過(guò)敏反應(yīng)的程度。故將來(lái)在臨床、生產(chǎn)中應(yīng)重點(diǎn)控制類(lèi)過(guò)敏反應(yīng)風(fēng)險(xiǎn)。

SXNI的類(lèi)過(guò)敏反應(yīng)一般在首次用藥時(shí)即可能發(fā)生，與劑量、用藥濃度有關(guān)。本研究結(jié)果也顯示，SXNI對(duì)小鼠產(chǎn)生的類(lèi)過(guò)敏反應(yīng)與劑量有密切關(guān)系，劑量越高反應(yīng)程度越強(qiáng)。因此提示臨床上應(yīng)用時(shí)應(yīng)注意用藥劑量（包括用藥濃度），滴速減慢，不宜加快滴注，在保證療效的前提下，應(yīng)盡量降低用藥劑量，以降低不良反應(yīng)發(fā)生的風(fēng)險(xiǎn)。不同SXNI的

類(lèi)過(guò)敏反應(yīng)有一定的批間差異，在本研究中150403C1的反應(yīng)強(qiáng)于其他2個(gè)批號(hào)，因此，建議將來(lái)在SXNI的生產(chǎn)中，除了要采用化學(xué)指紋圖譜、含量檢測(cè)等方法進(jìn)行質(zhì)量控制以外，還應(yīng)該采用生物學(xué)方法進(jìn)行質(zhì)量控制，例如：建立SXNI類(lèi)過(guò)敏反應(yīng)檢測(cè)法，對(duì)每批生產(chǎn)的產(chǎn)品進(jìn)行類(lèi)過(guò)敏反應(yīng)檢測(cè)，及時(shí)發(fā)現(xiàn)并控制產(chǎn)品風(fēng)險(xiǎn)。

根據(jù)SXNI的化學(xué)物質(zhì)基礎(chǔ)研究結(jié)果[1213]，該注射液中的主要單體成分有：蘆丁、白果內(nèi)酯、異鼠李素3O蕓香糖苷、白果新酸、銀杏內(nèi)酯A、銀杏內(nèi)酯B、銀杏內(nèi)酯C、銀杏內(nèi)酯J。為了搞清楚這些單體成分是否可能引起類(lèi)過(guò)敏反應(yīng)，作者對(duì)這些高度純化的單體成分進(jìn)行了小鼠類(lèi)過(guò)敏實(shí)驗(yàn)并根據(jù)這些成分在SXNI中平均含量范圍設(shè)計(jì)每種成分的給藥劑量。以往文獻(xiàn)推測(cè)白果新酸可能為一種致敏成分[1418]，但是該成分在SXNI中含量很低，為了達(dá)到充分暴露劑量，白果新酸的高、低劑量給藥劑量遠(yuǎn)高于其他組設(shè)定的最大10倍量。研究結(jié)果顯示，小鼠靜脈注射上述各成分后，即使是最高劑量下，各成分均沒(méi)有誘發(fā)小鼠耳廓出現(xiàn)明顯的肉眼可見(jiàn)的血管通透性增高癥狀，滲出評(píng)分均判定為陰性。因此，從本實(shí)驗(yàn)結(jié)果初步判斷，以上各單體成分可能不是SXNI致類(lèi)過(guò)敏反應(yīng)的主要物質(zhì)基礎(chǔ)。

已知舒血寧注射液主要由銀杏葉提取物制備，為了探討SXNI中致類(lèi)過(guò)敏反應(yīng)的主要組分，所以本研究又從銀杏葉提取物入手，YXY1，YXY2，YXY3，YXY4，YXY5，YXY6為銀杏提取物中根據(jù)色譜圖提取的不同流分，采用相同的劑量對(duì)以上流分進(jìn)行了初步篩選，結(jié)果顯示分別靜脈注射高劑量YXY2，YXY3和YXY4后，小鼠發(fā)生了不同程度的類(lèi)過(guò)敏反應(yīng)，并且YXY3在更低的劑量水平就引起了更強(qiáng)的反應(yīng)，因此初步推測(cè)YXY3可能是最主要的致類(lèi)過(guò)敏組分。已知YXY3中含55%黃酮苷類(lèi)化合物，故類(lèi)過(guò)敏物質(zhì)可能主要存在于黃酮醇苷類(lèi)化合物中。由于蘆丁、異鼠李素3O蕓香糖苷為其中含量較高的黃酮醇苷化合物，本研究中沒(méi)有發(fā)現(xiàn)這2種單體成分誘發(fā)小鼠類(lèi)過(guò)敏反應(yīng)，所以類(lèi)過(guò)敏物質(zhì)可能是存在于YXY3中的其他黃酮醇苷類(lèi)物質(zhì)或其他成分，因此有必要對(duì)YXY3流分進(jìn)行進(jìn)一步分離研究。隨后，作者從YXY3中分離YXY31，YXY32，YXY33，YXY34 4個(gè)組分再次進(jìn)行小鼠類(lèi)過(guò)敏試驗(yàn)，結(jié)果表明YXY31和YXY32在相當(dāng)于臨床112倍劑量時(shí)均可導(dǎo)致約一半動(dòng)物發(fā)生類(lèi)過(guò)敏反應(yīng)，YXY31和YXY32可能是舒血寧注射液的致類(lèi)過(guò)敏反應(yīng)的主要組分，但其中具體化學(xué)成分還有待后續(xù)試驗(yàn)進(jìn)行深入篩選研究。endprint

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[責(zé)任編輯張寧寧]endprint