不同酸劑誘導(dǎo)人工沉香的分析與評價

周欣 陳麗燕 陳曉東 鐘兆健

[摘要]該研究按照《中國藥典》（2015年版）要求測定樣品醇溶性浸出物含量，同時建立GCMS指紋圖譜，使用《中藥指紋圖譜相似度評價（2012年版）》計算指紋圖譜相似度，峰面積歸一化法計算170～270 min與0～100 min 2區(qū)間總峰面積的比值，自動質(zhì)譜退卷積定性系統(tǒng)（AMDIS）結(jié)合保留指數(shù)（RI）鑒定共有組分和差異組分，OPLSDA結(jié)合相關(guān)系數(shù)P（corr）和變量權(quán)重（VIP）篩選差異組分，灰色關(guān)聯(lián)度和TOPSIS分析法綜合評價人工沉香品質(zhì)。結(jié)果顯示18批人工沉香中15批浸出物含量符合要求，指紋圖譜相似度在0439～0779，2區(qū)間總峰面積比值在0307～13254，共鑒定出9個共有組分和8個差異組分，綜合上述20個指標(biāo)進(jìn)行灰色關(guān)聯(lián)度和TOPSIS分析得到2%水楊酸誘導(dǎo)的人工沉香品質(zhì)最優(yōu)。建立的灰色關(guān)聯(lián)度結(jié)合TOPSIS分析法可快速判斷不同酸性誘導(dǎo)劑生產(chǎn)的人工沉香品質(zhì)，為人工沉香的全面質(zhì)量評價提供參考依據(jù)。

[關(guān)鍵詞]人工沉香； 酸性誘導(dǎo)劑； 氣相質(zhì)譜； 灰色關(guān)聯(lián)度； TOPSIS

Analysis and evaluation of chemically induced artificial agarwood

ZHOU Xin1， CHEN Liyan 1， CHEN Xiaodong1，3， ZHONG Zhaojian1，

LI Haohua2， ZHANG Weimin2*， GAO Xiaoxia1*

（1. School of Pharmacy， Guangdong Pharmaceutical University， Guangzhou 510006， China；

2. State Key Laboratory of Applied Microbiology Southern China， Guangdong Provincial Key Laboratory of

Microbial Culture Collection and Application， Guangdong Open Laboratory of Applied Microbiology， Guangdong Institute of Microbiology， Guangzhou 510070， China；

3. Sirio Pharm Co.， Ltd.， Shantou 515041， China）

[Abstract]In this study，the content of ethanol extraction of agarwood were performed following the method of Chinese Pharmacopoeia（ChP 2015 edition） The chromatographic fingerprints were established by GCMS Similarity Evaluation System for Chromatographic Fingerprint of traditional Chinese medicine（TCM）（version 2012） was employed to calculate the similarity of each chromatogram of agarwood The ratios of sum peak area in the range of 170270 min and 0100 min of individual chromatogram were calculated using square peaks to normalization AMDIS and RI were employed to identify the common and different peaks Correlation coefficient P（corr） combined with Variable important in projection（VIP） value was employed to screen the different representative components based on OPLSDA analysis Grey related degree and TOPSIS were used to evaluate the quality of artificial agarwoods The results showed that more than 100% of the ethanol extract content was found in 15 batches of artificial agarwoods among the total 18 The similarity of 18 batches artificial agarwoods was 04390779 The peak area ratios of two intervals were in the range of 030713254 The 9 common components and 8 different components were identified Meanwhile， 2% salicylic acid is the best inducer based on grey related degree and TOPSIS Grey related degree and TOPSIS can be used to evaluate the quality of artificial agarwoods rapidly These results provide a reference data to evaluate the qualityof artificial agarwoodendprint

[Key words]artificial agarwood； acid inducer； GCMS； grey related degree； TOPSIS

《中國藥典》（2015年版）收載的沉香Aqilariae Ligum Resinatum為瑞香科植物白木香Aquilaria sinensis（Lour） Gilg含樹脂的木材[1]。作為“十大廣藥”之一的沉香藥用價值高，亦可用于制造香精油和高檔香水[2]，也是極具價值的收藏品。白木香是我國生產(chǎn)沉香的唯一正品植物來源，現(xiàn)已被列為國家珍稀瀕危二級保護(hù)植物，并載入《中國植物紅皮書》[3]。

白木香是典型傷害誘導(dǎo)型植物，健康的白木香樹是不產(chǎn)沉香的，只有受到外界傷害時才會誘導(dǎo)白木香樹防御性反應(yīng)從而產(chǎn)生沉香[4]。與健康的白木香相比，沉香化學(xué)組成主要是倍半萜類、2（2苯乙基）色酮類衍生物和芳香族類物質(zhì)[5]，其獨特的香氣主要來源于倍半萜類化合物。白木香天然結(jié)香產(chǎn)量低、需時長，使得沉香長期處于供不應(yīng)求的狀況，為滿足市場需求，人們嘗試采用多樣的人工誘導(dǎo)方式生產(chǎn)沉香。于是砍傷法、鑿洞法、鉆孔灼燒法等物理傷害誘導(dǎo)法；注射硫酸、甲酸等化學(xué)傷害誘導(dǎo)法；接菌法等生物誘導(dǎo)法相繼問世[67]。不同人工誘導(dǎo)方法所形成的沉香化學(xué)組成差異顯著，林峰等[8]采用GCMS分析出3種物理結(jié)香法（打釘法、砍傷法和鑿洞法）所產(chǎn)沉香均是以倍半萜、芳香族化合物及脂肪酸為主，認(rèn)為刀砍物理法更接近天然結(jié)香方法；陳曉穎等[9]發(fā)現(xiàn)人工誘導(dǎo)沉香的2（2苯乙基）色酮類化合物種類較多、含量較高，其中化學(xué)試劑刺激法更具有優(yōu)勢；雷胄熙等[10]分析以生物誘導(dǎo)結(jié)香技術(shù)所產(chǎn)人工沉香可檢出大量倍半萜類成分及芐基丙酮，并無檢出2（2苯乙基）色酮類成分，而色酮類成分主要為1（芐氧基）8萘酚，表明生物誘導(dǎo)法與傳統(tǒng)結(jié)香法在結(jié)香機制上可能存在差異。

目前，灰色關(guān)聯(lián)度和TOPSIS分析法是應(yīng)用較廣的決策評判方法，灰色關(guān)聯(lián)度分析是構(gòu)建一個理想?yún)⒖紨?shù)列，通過對不同樣品和理想品種的關(guān)聯(lián)度進(jìn)行排序，關(guān)聯(lián)度越大的樣品與理想品種越接近，品質(zhì)越好；TOPSIS分析法則是借助每個樣品的各個指標(biāo)轉(zhuǎn)化為可比較的規(guī)范指標(biāo)，然后比較每個樣品的綜合性狀與理想狀態(tài)的接近程度，越接近則表現(xiàn)越好[1113]。本文采用化學(xué)傷害誘導(dǎo)法進(jìn)行人工誘導(dǎo)，以不同酸劑作為誘導(dǎo)劑[14]，生產(chǎn)的人工沉香按照《中國藥典》（2015年版）規(guī)定測定醇溶性浸出物含量，并以天然沉香為參比物構(gòu)建GCMS指紋圖譜，應(yīng)用灰色關(guān)聯(lián)度和TOPSIS分析法對人工沉香進(jìn)行綜合分析，為酸劑誘導(dǎo)的人工沉香藥材的全面質(zhì)量評價提供參考依據(jù)。

1材料

11人工造香試驗和樣品收集

天然沉香10批（1～10號）由廣東省信宜市珍稀沉香發(fā)展有限公司提供（來源及收集時間見表1），并由廣東藥科大學(xué)中藥學(xué)院藥用植物教研室嚴(yán)寒靜教授鑒定為瑞香科植物白木香A sinensis含有樹脂的木材，通過經(jīng)驗鑒別、性狀鑒別、理化鑒別以及醇溶性浸出物含量測定和GCMS結(jié)合多元統(tǒng)計分析，鑒定為天然沉香[5] 。

人工沉香18批（11～28號）按王磊等[15]專利方法，選取6年生的健康白木香進(jìn)行誘導(dǎo)試驗，白木香樹經(jīng)嚴(yán)寒靜教授鑒定為A sinensis。人工造香12個月后，砍伐樹干，人工割取含樹脂的心材，陰干，制成人工沉香。樣品誘導(dǎo)方法、時長、采集時間等詳見表1。

12儀器和試劑

GCMS QP 2010 E氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀（日本島津公司），Rtx5 MS毛細(xì)管柱025 μm×025 mm×30 m），BS124S電子分析天平（德國Sartorius），HH6數(shù)顯電子恒溫水浴鍋（江蘇金壇市宏華儀器廠）。

水楊酸購于Aladdin公司（純度大于995%），乙烯利購于Aladdin公司（純度大于900%），C7～C40正構(gòu)烷烴（編號DRH008SR2，美國AccuStandard公司，三氯甲烷中500 mg·L-1），三氯甲烷（AR，廣州化學(xué)試劑廠）。

2方法

21醇溶性浸出物的測定

按《中國藥典》（2015年版）一部中沉香[1]醇溶性浸出物測定法進(jìn)行測定。

22GCMS指紋圖譜的建立

221供試品溶液的制備本品粉碎成細(xì)粉（4號篩），取細(xì)粉約05 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入三氯甲烷10 mL，密塞，搖勻，稱定質(zhì)量，冷浸過夜。再稱定質(zhì)量，用三氯甲烷補足減失的質(zhì)量，搖勻，濾過，取續(xù)濾液。置70 ℃水浴上蒸干，殘渣加三氯甲烷使溶解并轉(zhuǎn)移至1 mL量瓶中，加三氯甲烷至刻度，搖勻，用045 μm微孔濾膜濾過，取續(xù)濾液，即得。

222色譜及質(zhì)譜條件色譜條件采用Rtx5 MS毛細(xì)管色譜柱（025 μm×025 mm ×30 m），進(jìn)樣口溫度260 ℃，載氣為高純氦氣，程序升溫（初始溫度90 ℃保持4 min，以25 ℃·min-1升至160 ℃，保持5 min，再以03 ℃·min-1升至180 ℃，保持5 min，然后以2 ℃·min-1升至200 ℃，最后以1 ℃·min-1升至230 ℃，保持120 min），流速10 mL·min-1；分流比1/30，進(jìn)樣量為1 μL。

質(zhì)譜條件電子轟擊（EI）離子源；電子能量70 eV，電離電壓1 kV，離子源溫度230 ℃，接口溫度250 ℃，溶劑延時5 min，質(zhì)量掃描范圍m/z 50～500。

223方法學(xué)考察精密度試驗：取11號樣品1份，按221項制備供試品溶液，按222項色譜及質(zhì)譜條件進(jìn)行GCMS分析，連續(xù)進(jìn)樣6次，《中藥指紋圖譜相似度評價（2012130723版本）》計算相似度均大于0993，表明儀器精密度良好。

重復(fù)性試驗：取11號樣品6份，分別按221項制備供試品溶液，按222項色譜及質(zhì)譜條件進(jìn)行GCMS分析，《中藥指紋圖譜相似度評價（2012130723版本）》計算相似度均大于0992，表明方法重復(fù)性良好。endprint

穩(wěn)定性試驗：取上述同一供試品溶液，分別在0，5，10，15，20 h，按221項色譜及質(zhì)譜條件進(jìn)行GCMS分析，《中藥指紋圖譜相似度評價（2012130723版本）》計算相似度均大于0992，表明供試品溶液在20 h內(nèi)穩(wěn)定。

224樣品測定對28批沉香樣本每批取3份進(jìn)行測定，取相似度均在0990以上的3個譜圖中的1個代表該沉香樣本的圖譜進(jìn)行分析。

23數(shù)據(jù)處理

應(yīng)用《中藥指紋圖譜相似度評價（2012年版）》軟件處理樣品總離子流圖，分別構(gòu)建天然沉香指紋圖譜，并以天然沉香生成的對照圖譜作為參考圖譜，分析人工沉香指紋圖譜。

自動質(zhì)譜退卷積定性系統(tǒng)（automated mass spectral deconvolution and identification system，AMDIS）處理樣品的總離子流圖，去除噪音和圖譜重疊的干擾[1618]，結(jié)合NIST05數(shù)據(jù)庫標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)譜信息比對和保留指數(shù)（retention indices，RI）校正進(jìn)行共有組分和差異組分的鑒定。Rgui（310）環(huán)境下，XCMS數(shù)據(jù)包對GCMS數(shù)據(jù)文件進(jìn)行反褶積和對齊，以全譜碎片信息為變量導(dǎo)入SIMCAP 120軟件中進(jìn)行全譜碎片信息的有監(jiān)督模式識別正交偏最小二乘法分析（OPLSDA）。

醇溶性浸出物含量、指紋圖譜相似度、2區(qū)間峰面積比值、9組共有成分和8組差異成分相對峰面積，共20個指標(biāo)進(jìn)行灰色關(guān)聯(lián)度和TOPSIS分析，尋找到與理想樣品最接近的誘導(dǎo)方法；并根據(jù)歸一化后的原始數(shù)據(jù)矩陣，確定出不同酸性誘導(dǎo)劑的最佳方案和最差方案，通過求出各被評方案與最佳方案和最差方案之間的距離，最終尋找到最優(yōu)的酸劑誘導(dǎo)方式。

3結(jié)果與分析

31浸出物含量

28批沉香浸出物含量結(jié)果見表1，除3批人工沉香外，均符合《中國藥典》（2015年版）要求。10批天然沉香的浸出物含量均在100%以上；18批人工沉香中，僅4%水楊酸和4%乙烯利誘導(dǎo)的3批人工沉香浸出物含量低于100%，其余15批浸出物均符合要求。

32GCMS指紋圖譜相似度與2區(qū)間總峰面積比值分析以及共有組分鑒定

經(jīng)多點校正后自動匹配，得到10批天然沉香的指紋圖譜，見表2，圖1A（圖中S1～S10與表1中N1～N10相對應(yīng)），相似度在0821～0888，見表1；以10批天然沉香生成的對照圖譜作為參考圖譜分析18批人工沉香的指紋圖譜，相似度在0439～0779，見圖1B，表1；圖1C為人工沉香共有峰。

AMDIS結(jié)合NIST05數(shù)據(jù)庫和RI鑒定18批人工沉香共有組分，包括倍半萜類3個，色酮類3個和其他類3個，見表2。

前期工作中發(fā)現(xiàn)，170～270 min 的總峰面積[主要代表化合物為2（2苯乙基）色酮類]與0～100 min 的總峰面積（主要代表化合物為倍半萜類）的比值[5]可作為判斷沉香質(zhì)量的評價依據(jù)，即是說沉香GCMS總離子流圖的表觀豐度可作為評價沉香質(zhì)量的指標(biāo)之一[19]，本文中10批天然沉香2區(qū)間峰面積比值均小于1，18批人工沉香的比值在0307～13254，見表1。

33差異組分的鑒定

在Rgui環(huán)境下應(yīng)用XCMS數(shù)據(jù)包提取10批天然沉香和18批人工沉香的三維數(shù)據(jù)矩陣，包括樣本名稱、離子強度和碎片信息（保留時間質(zhì)荷比），對數(shù)據(jù)矩陣進(jìn)行歸一化處理后導(dǎo)入SIMCAP 120軟件進(jìn)行OPLSDA判別分析，28批樣品被分為3大類，天然沉香為第一類（組1），人工沉香分為2類（組2和組3）。在建立的OPLSDA模型中，在變量X上的總貢獻(xiàn)率為838%（R2X=0838），在變量Y上的總貢獻(xiàn)率為835%（R2Y=0835），同時交叉驗證預(yù)測能力為691%[Q2（cum）=0691]，見圖2。

由相關(guān)系數(shù)P（corr）結(jié)合變量權(quán)重（VIP）值的評價方法來篩選出對OPLSDA分組有貢獻(xiàn)的差異組分。P（corr）用于解釋各組分對樣品分類的貢獻(xiàn)大小，VIP>1時變量具有統(tǒng)計學(xué)意義。本文選擇P（corr）大于08且VIP值大于15的變量為顯著性差異組分，共篩選出8個差異組分，鑒定結(jié)果見表3。

34灰色關(guān)聯(lián)度分析

灰色關(guān)聯(lián)度中對不同酸劑誘導(dǎo)的18批人工沉香的浸出物含量、指紋圖譜相似度、2區(qū)間總峰面積比值、9個共有組分和8個差異組分的相對峰面積，共20個指標(biāo)進(jìn)行分析，各指標(biāo)的具體數(shù)據(jù)見表4。

341理想樣品的選擇在18個不同酸劑誘導(dǎo)的人工沉香樣品中選出各項指標(biāo)的最優(yōu)值作為理想樣品X，其對應(yīng)的理想數(shù)值按照表4的順序依次為：3240，0799，078，1325，252，429，683，1023，409，3631，465，831，014，1023，245，907，2130，465，348，442。

342兩級最大差和最小差以選出的理想樣品指標(biāo)為基準(zhǔn)，根據(jù)公式計算人工沉香樣品與理想樣品序列間的絕對差別，從中得到最大差和最小差分別為3625和0。

minni=1minni=1|x（k）-xi（k）|

maxni=1maxni=1|x（k）-xi（k）|

343關(guān)聯(lián)系數(shù)和關(guān)聯(lián)度計算關(guān)聯(lián)系數(shù)反應(yīng)的是各指標(biāo)與理想值的吻合程度，關(guān)聯(lián)系數(shù)越大表明與理想值越接近，計算公式如下。

35TOPSIS分析

351歸一化處理上述醇溶性浸出物含量、指紋圖譜相似度、2區(qū)間總峰面積比值、9組共有組分和8組差異成分，代表了人工沉香成分的主要信息見

4討論

本文中28批樣品浸出物含量基本符合《中國藥典》（2015年版）要求；10批天然沉香指紋圖譜相似度較高，而18批人工沉香相較天然沉香的相似度偏低且差異較大；同時從指紋圖譜的表觀豐度來判

斷天然沉香2區(qū)間總峰面積比值均小于1，而人工沉香的比值則跨度較大，在0307～13254；指紋圖譜技術(shù)結(jié)合多元統(tǒng)計分析，快速篩選出酸性誘導(dǎo)劑生產(chǎn)的人工沉香主要化學(xué)組成為白木香醛（baimuxinal，A3）、2（2苯乙基）色酮[2（2phenylethyl）chromone，A7]、絨白乳菇醛（velleral，B2）等沉香特征性成分。endprint

研究表明，水楊酸可促進(jìn)植物的生長發(fā)育，增強植株的防御性反應(yīng)和抗脅迫能力，提高了植物的產(chǎn)量和營養(yǎng)，同時對植物連作障礙造成的脅迫亦具有一定的積極作用[20]，乙烯利作為外源植物生長調(diào)節(jié)物質(zhì)，在農(nóng)作物生產(chǎn)中也有廣泛應(yīng)用[21]；因此實驗選用不同濃度的兩種酸劑進(jìn)行化學(xué)誘導(dǎo)，通過綜合浸出物含量、指紋圖譜相似度、2區(qū)間峰面積比值以及9個共有組分和8個差異組分，共20個指標(biāo)進(jìn)行灰色關(guān)聯(lián)度和TOPSIS分析，期望優(yōu)選出最佳的誘導(dǎo)劑，結(jié)果顯示，盡管排序有差異，但2種分析手段得到F5，F(xiàn)6，F(xiàn)8，F(xiàn)9，G1，G3，H1 7個樣品的排名都靠前，其中F5，F(xiàn)6，F(xiàn)8，F(xiàn)9均由2%水楊酸誘導(dǎo)，G1和G3分別由2%和4%乙烯利誘導(dǎo)，盡管G3排名較靠前，但是其浸出物結(jié)果卻未達(dá)到藥典要求，H1采用混合誘導(dǎo)劑，操作相對較繁瑣。因此分析結(jié)果得出，5個采用2%水楊酸誘導(dǎo)的樣品綜合排名較前，品質(zhì)較優(yōu)。

本文通過對白木香木質(zhì)部注入適量的酸性誘導(dǎo)劑進(jìn)行化學(xué)傷害誘導(dǎo)，可產(chǎn)生沉香樹脂，該方法操作簡便快速、成本低廉，適用于大規(guī)模推廣應(yīng)用。

[參考文獻(xiàn)]

[1]中國藥典一部[S] 2015：185

[2]CITES Amendments to appendix Ⅰ and Ⅱ of CITES[C] Bangkok：in proceedings of thirteenth meeting of the conference of the parties，2004

[3]傅立國 中國植物紅皮書——稀有瀕危植物[M] 北京： 科學(xué)出版社，1992： 670

[4]張興麗 傷害誘導(dǎo)的白木香防御反應(yīng)與沉香形成的關(guān)系研究[D] 北京： 北京林業(yè)大學(xué)，2013

[5]Gao X X， Xie M R， Liu S F， et al Chromatographic fingerprint analysis of metabolites in natural and artificial agarwood using gas chromatographymass spectrometry combined with chemometric methods[J] J Chromatogr B， 2014， 967： 264

[6]林奇藝，蔡岳文，袁亮，等 外界刺激檀香“結(jié)香”試驗研究[J] 中藥材，2003，23（7）： 376

[7]劉軍民，徐鴻華 國產(chǎn)沉香研究進(jìn)展[J] 中藥材，2005，28（7）： 627

[8]林峰，梅文莉，吳嬌，等 人工結(jié)香法所產(chǎn)沉香揮發(fā)性成分的GCMS分析[J] 中藥材，2010，33（2）： 222

[9]陳曉穎，高英，李衛(wèi)民 不同結(jié)香方法與國產(chǎn)沉香揮發(fā)性化學(xué)成分的相關(guān)性研究[J] 中國藥房，2012，23（12）： 1017

[10]雷胄熙，吳澤青，林勵，等 生物誘導(dǎo)法所產(chǎn)不同部位沉香揮發(fā)油成分分析[J] 中藥新藥與臨床藥理，2016，27（1）： 106

[11]Yao R Y， Wang F， Zou Y F， et al Comprehensive germination quality evalution of bupleurumchinense seeds of different maturities from qingchuan county with the topsis approach[J] Bull Bot Res， 2014，34（1）：108

[12]孟杰，陳興福，楊文玨，等 基于灰色關(guān)聯(lián)度分析和DTOPSIS法綜合評價青川柴胡資源[J] 中國中藥雜志，2014，39（3）： 433

[13]王勝男，華愉教，鄒立思，等 浙玄參中多元功效成分動態(tài)積累的分析與評價[J] 藥物分析雜志，2016，36（11）： 1952

[14]何夢玲，何芳，孟京蘭，等 3種誘導(dǎo)子對白木香根懸浮培養(yǎng)細(xì)胞中2（2苯乙基）色酮化合物形成的影響[J] 中成藥，2013，35（7）： 1367

[15]王磊，章衛(wèi)民，高曉霞，等 一種人工誘導(dǎo)白木香產(chǎn)生沉香的方法： 中國， CN102302041A[P] 20120104

[16]黃盈煜，謝維平，歐陽燕玲 GC/MS/AMDIS系統(tǒng)在茶葉中17種有機氯和擬除蟲菊酯農(nóng)藥殘留檢測確證中的應(yīng)用[J] 中國衛(wèi)生檢驗雜志，2010，20（7）： 1606

[17]張偉國，雷宏洲，韓天祥，等 自動質(zhì)譜退卷積定性系統(tǒng)（AMDIS）用于重疊農(nóng)藥峰的GC/MS質(zhì)譜圖退卷積處理[J] 質(zhì)譜學(xué)報，2005，26（3）： 155

[18]蘇越，王呈仲，郭寅龍 基于準(zhǔn)確質(zhì)量測定和保留指數(shù)的GCMS分析薄荷揮發(fā)性成分[J] 化學(xué)學(xué)報，2009，67（6）： 546

[19]陳曉穎 沉香、檀香評價體系的優(yōu)化及對沉香結(jié)香方法的評價[D] 廣州： 廣州中醫(yī)藥大學(xué)，2012

[20]回振龍，王蒂，李宗國，等 外源水楊酸對連作馬鈴薯生長發(fā)育及抗性生理的影響[J]干旱地區(qū)農(nóng)業(yè)研究，2014，32（4）：1.

[21]謝陽姣，何志鵬 乙烯利對苦玄參生長的影響[J] 南方農(nóng)業(yè)學(xué)報，2013，44（7）： 1100

[責(zé)任編輯丁廣治]endprint