異紫堇堿及其類似物的抗癌活性研究

閆倩 李如霞 辛愛一 +柳軍璽 李文廣

[摘要]采用天然產(chǎn)物化學(xué)研究手段，從禿瘡花和云南地不容中分離得到部分異紫堇堿類生物堿，并對(duì)異紫堇堿進(jìn)行化學(xué)結(jié)構(gòu)修飾得到異紫堇堿類似物，采用MTT法考察了異紫堇堿類似物對(duì)3種人癌細(xì)胞株的細(xì)胞生長(zhǎng)抑制活性。結(jié)果表明異紫堇堿及其類似物均具有一定的抗癌活性，結(jié)合異紫堇堿及其類似物的單晶衍射結(jié)構(gòu)與EGFR分子對(duì)接模擬，從立體化學(xué)結(jié)構(gòu)、化合物不同取代基位置以及芳香環(huán)電子云密度等角度探討了該類化合物具有抗癌活性的構(gòu)效關(guān)系。

[關(guān)鍵詞]阿樸啡類生物堿； 抗癌活性； 構(gòu)效關(guān)系； 異紫堇堿

Research on anticancer activity of isocorydine and its derivatives

YAN Qian1，2， LI Ruxia1，3， XIN Aiyi1，2， LIU Junxi1*， LI Wenguang2， DI Duolong1

（1Key Laboratory of Chemistry of Northwestern Plant Resources and Key Laboratory for Natural Medicine of

Gansu Province， Lanzhou Insititute of Chemical Physics， Chinese Academy of Science， Lanzhou 730000， China；

2 School of Basic Medical Sciences， Lanzhou University， Lanzhou 730000， China；

3 University of Chinese Academy of Sciences， Beijing 100049， China）

[Abstract]Isocorydine and its analogs were extracted from Dicranostigma leptopodum and Stephania yunnanensis through the method of natural products chemistry Its derivatives were prepared by chemical structure modifications from isocorydine MTT method was used to study the inhibitory effect of those compounds on the growth of HepG2， HeLa and MGC803 cancer cell lines in vitro The results showed that isocorydine and its analogs all have the growth inhibition for those cancer cell lines This paper investigated the structureactivity relationship of isocorydine and its derivatives with anticancer activity in the aspect of stereochemical structure， functional groups positions of the compounds and the electron density of aromatic rings based on the single crystal diffraction structure and the molecular docking of EGFR and isocorydine

[Key words]aporphine alkaloids； anticancer activity； SAR； isocorydine

天然產(chǎn)物是多種重要疾病治療藥物的關(guān)鍵先導(dǎo)化合物[1]，通過考察天然產(chǎn)物的生物學(xué)活性與取代基、官能團(tuán)之間的構(gòu)效關(guān)系，結(jié)合藥物結(jié)構(gòu)設(shè)計(jì)對(duì)化合物進(jìn)行結(jié)構(gòu)修飾，提高其活性是新藥開發(fā)的一條非常重要的途徑。阿樸啡類生物堿（aporphine alkaloids）分布于20個(gè)科100多屬的植物中[2]，是異喹啉類生物堿的一種，為一類重要的植物次生代謝產(chǎn)物。該類生物堿具有多種藥理活性，包括抗氧化、抗驚厥、抗痙攣、抗血小板凝聚、細(xì)胞毒性等，其中最能引起廣泛關(guān)注的是此類生物堿具有良好的抗腫瘤活性。

異紫堇堿（isocorydine，音譯名：異可利定，國藥準(zhǔn)字H53021713，屬解痙鎮(zhèn)痛藥）是典型的天然阿樸啡類生物堿，廣泛分布于禿瘡花Dicranostigma leptopodum（Maxim） Fedde、千金藤Stephania japonica（Thunb） Miers、紫金龍Dactylicapnos scandens（D Don） Hutch、云南地不容S yunnanensis Lo等植物中，研究表明異紫堇堿能夠通過誘導(dǎo)G2/M細(xì)胞周期阻滯和細(xì)胞凋亡，抑制肝細(xì)胞癌的增殖，降低CD133+標(biāo)志干細(xì)胞的致瘤能力，具有干細(xì)胞靶向性和選擇性[3]；聯(lián)合用藥顯示異紫堇堿可以增強(qiáng)肝癌細(xì)胞株對(duì)多柔比星，順鉑等一線抗癌藥物的敏感性，起到耐藥逆轉(zhuǎn)作用，是一種很有潛力的針對(duì)肝癌的化學(xué)治療藥物[4]。阿樸啡類的另一重要化合物波爾定能夠選擇性和劑量依賴性抑制腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞系的生長(zhǎng)，誘導(dǎo)細(xì)胞G2/M期抑制，且對(duì)正常細(xì)胞沒有毒性[5]。

導(dǎo)致腫瘤的發(fā)生和發(fā)展的一個(gè)重要原因是表皮生細(xì)胞長(zhǎng)因子受體（EGFR）在腫瘤細(xì)胞中的過表達(dá)和（或）突變[6]，此外，EGFR的異常表達(dá)還與新生血管生成、腫瘤的轉(zhuǎn)移、腫瘤的多藥耐藥等密切相關(guān)[7]。以EGFR為靶點(diǎn)進(jìn)行藥物設(shè)計(jì)與研發(fā)成為抗腫瘤藥物研發(fā)的熱點(diǎn)。已有研究表明阿樸啡類生物堿的荷包牡丹堿選擇性作用于EGFR超表達(dá)的腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞系，通過激活BRCA1介導(dǎo)的DNA損傷反應(yīng)，P53信號(hào)通路等發(fā)揮抑制腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)作用[8]。endprint

本研究從西北特色植物禿瘡花和云南道地藥材云南地不容中提取分離純化得到紫堇塊莖堿（corytuberine）、stepharine、紫堇堿（corydine）、異紫堇堿、異紫堇塊莖堿（isocorytuberine）5種阿樸啡類生物堿。通過結(jié)構(gòu)修飾得到異紫堇二酮（isocorydione）、8氨基異紫堇堿（8aminoisocorydine，NICD），采用MTT考察以上化合物對(duì)人宮頸癌細(xì)胞株HeLa、人肝癌細(xì)胞株HepG2、人胃癌細(xì)胞株MGC803的細(xì)胞生長(zhǎng)抑制活性，通過單晶衍射結(jié)構(gòu)分析、EGFR的分子對(duì)接模擬，對(duì)抗癌活性的異紫堇堿及其類似物的構(gòu)效關(guān)系進(jìn)行初步探索，為基于天然阿樸啡類生物堿的高效抗癌活性藥物研究提供依據(jù)。

1材料

禿瘡花采自甘肅省平?jīng)鍪谐缧趴h，云南地不容采自云南省個(gè)舊市，2種植物經(jīng)蘭州大學(xué)馬志剛教授鑒定，植物標(biāo)本存放于中科院西北特色植物資源化學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室。人宮頸癌細(xì)胞株HeLa、人肝癌細(xì)胞株HepG2、人胃癌細(xì)胞株MGC803由蘭州大學(xué)臨床前藥理研究室提供，本實(shí)驗(yàn)室凍存使用；DMEM、RPMI1640培養(yǎng)基、PBS磷酸鹽緩沖液、胎牛血清購自Hyclone公司；胰蛋白酶、MTT購自Biosharp公司；柱色譜硅膠（青島海洋化工有限公司）；DMSO分析純（利安隆博華醫(yī)藥化學(xué)有限公司）；其他試劑均為市售分析純。

Bruker AVANCE HD 400 MHz 超導(dǎo)核磁共振譜儀；Bruker micro TOFQ 高分辨四級(jí)桿飛行時(shí)間質(zhì)譜儀；Bruker Smart APEX Xray單晶衍射儀：DF101S 集熱式恒溫加熱磁力攪拌器（河南鞏義市予華儀器責(zé)任有限公司）；SWCJ2FD型超凈工作臺(tái)（蘇州凈化設(shè)備有限公司）；HH·CP7W型CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱（上海博訊實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠）；DNM9602G型酶標(biāo)分析儀（北京普朗新技術(shù)有限公司）；XD30RFL型倒置顯微鏡（舜宇光學(xué)科技有限公司）；THZ312 臺(tái)式恒溫振蕩器（上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司）。

2方法與結(jié)果

21化合物制備與結(jié)構(gòu)鑒定

211天然生物堿的提取分離參考本實(shí)驗(yàn)室研究提取分離純化生物堿的工藝[9]，從云南地不容中分離得到紫堇塊莖堿，stepharine，異紫堇堿，紫堇堿等生物堿。從禿瘡花中分離得到異紫堇塊莖堿、異紫堇堿、紫堇堿等生物堿。在天然產(chǎn)物化學(xué)的研究中發(fā)現(xiàn)，禿瘡花中含有大量的異紫堇堿（含量大于05%），且已有分離制備工藝[10]，便于工業(yè)制備，為結(jié)構(gòu)修飾提供充足的原料。

212異紫堇二酮的制備參照實(shí)驗(yàn)室已優(yōu)化過的合成工藝[11]，采用弗瑞米自由基將異紫堇堿的酚羥基氧化成酮羰基，成功制備異紫堇二酮。取25 g磷酸氫二鈉置于圓底燒瓶，加入750 mL蒸餾水，攪拌至完全溶解后加入120 g新鮮制備的弗瑞米自由基，混合均勻，溶液呈紫色，加入50 g異紫堇堿，室溫下磁力攪拌，反應(yīng)12 h，混合液用氯仿萃?。?00 mL×3），萃取液干燥，減壓蒸餾回收溶劑，殘留物以石油醚（60～90 ℃）丙酮（3∶1） 為流動(dòng)相進(jìn)行硅膠柱色譜純化，得紫黑色化合物24 g，得率為49%，見圖1。

2138氨基異紫堇堿（NICD）的制備采用苯環(huán)活潑氫的硝化加氫還原2步反應(yīng)，在異紫堇堿的酚羥基對(duì)位成功引入氨基，制備8氨基異紫堇堿。取異紫堇堿30 g置于圓底燒瓶中，加入200 mL二氯甲烷攪拌至完全溶解，將燒瓶置于-30 ℃的冷阱中，機(jī)械攪拌下緩慢加入由發(fā)煙硝酸（074 mL）和濃硫酸（98%，074 mL）組成的硝化試劑。15 h后，將反應(yīng)混合物倒入冰水中，用氨水堿化至pH 8，減壓濃縮回收溶劑，殘余物以氯仿甲醇（20

∶1）為流動(dòng)相進(jìn)行硅膠柱色譜純化，得到鮮黃色產(chǎn)物8硝基異紫堇堿18 g，得率為32%。

取10 g上述產(chǎn)物置于高壓反應(yīng)釜，加入400 mL無水乙醇至完全溶解，加入Pd/C氫化催化劑（10%，05 g），高壓釜中將氫氣壓力保持在03 MPa，攪拌2 h。過濾，濾液減壓濃縮回收溶劑，殘余物以氯仿甲醇（5∶1）為流動(dòng)相進(jìn)行硅膠柱色譜純化，得到棕色無定形粉末07 g，得率為78%，見圖2。

22腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)抑制活性

以Sorafenib為陽性對(duì)照品，采用四甲基偶氮唑鹽比色法（MTT）測(cè)試目標(biāo)化合物對(duì)人宮頸癌細(xì)胞株HeLa、人肝癌細(xì)胞株HepG2、人胃癌細(xì)胞株MGC803的體外細(xì)胞毒性。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的測(cè)試細(xì)胞株懸浮于含10%胎牛血清的培養(yǎng)基中，接種至96孔細(xì)胞培養(yǎng)板（3孔重復(fù)），過夜貼壁培養(yǎng)。將細(xì)胞分為陰性對(duì)照組、溶劑對(duì)照組、給藥組3組。貼壁24 h后，棄完全培養(yǎng)基，加入100 μL不同濃度的待測(cè)樣品溶液按照濃度梯度依次加入96孔板中，在培養(yǎng)箱中繼續(xù)孵育24 h。棄去原培養(yǎng)液，每孔加入10 μL 質(zhì)量濃度為05 g·L-1的MTT工作液，在培養(yǎng)箱中孵育4 h。棄去原培養(yǎng)液，加入100 μL的DMSO，放于搖床低速震蕩10 min后，用酶標(biāo)儀在490 nm波長(zhǎng)處測(cè)定各孔吸光度（A）。增殖抑制率=（1-A實(shí)驗(yàn)/A對(duì)照）×100%。采用SPSS 190計(jì)算藥物對(duì)細(xì)胞的抑制濃度IC50，重復(fù)3次實(shí)驗(yàn)，實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表1。

從表1可以看出，異紫堇堿及其類似物對(duì)3株腫瘤細(xì)胞均具有一定的抑制作用，但其抗癌活性的強(qiáng)弱各個(gè)化合物之間存在顯著差異，異紫堇堿的抗癌活性與已有的研究結(jié)果幾乎一致[18]，顯示異紫堇堿本身抗癌活性較弱。同樣來自天然的阿樸啡類生物堿紫堇塊莖堿和紫堇堿的腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)抑制活性也較差；通過結(jié)構(gòu)衍生產(chǎn)生的異紫堇二酮和NICD具有相對(duì)較強(qiáng)的腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)抑制活性；原阿樸啡類生物堿stepharine的抗癌活性明顯比阿樸啡類生物堿的活性強(qiáng)，但相對(duì)于通過結(jié)構(gòu)修飾產(chǎn)生的衍生物，其抗癌活性較弱。以上研究結(jié)果表明通過化學(xué)結(jié)構(gòu)修飾提高異紫堇堿類化合物的抗癌活性空間很大。endprint

23立體化學(xué)結(jié)構(gòu)

為充分理解該類化合物的立體空間化學(xué)結(jié)構(gòu)，本研究通過不同的培養(yǎng)條件，生長(zhǎng)了相關(guān)化合物的單晶用于XRay衍射分析，見圖3。

通過化合物單晶衍射結(jié)構(gòu)分析，發(fā)現(xiàn)阿樸啡類化合物的基本結(jié)構(gòu)母核中含有A環(huán)和D環(huán)為聯(lián)苯型四元環(huán)結(jié)構(gòu)組成，A環(huán)和D環(huán)2個(gè)芳香環(huán)組成的二面角在30～40 °，見表2，由于B環(huán)和C環(huán)的存在、牽制和四元環(huán)結(jié)構(gòu)的限制，使得A環(huán)和D環(huán)幾乎共平面，化合物整體具有較強(qiáng)的剛性，原子自由旋轉(zhuǎn)和振動(dòng)的空間有限，含氮的雜環(huán)（B環(huán)）和C環(huán)沒有不飽和鍵存在，部分化學(xué)鍵單鍵自由旋轉(zhuǎn)，降低自由能形成半椅式結(jié)構(gòu)，使得C6位的立體構(gòu)型均為S構(gòu)型。異紫堇二酮由于結(jié)構(gòu)中D環(huán)酚羥基的氧化和C6a與C7位脫氫形成A，C和D環(huán)的超共軛體系，化合物結(jié)構(gòu)更加穩(wěn)定，A環(huán)和D環(huán)的二面角在15～30 °。Stepharine為原阿樸啡類生物堿，C環(huán)形成五元環(huán)，在C7a位與D環(huán)形成螺環(huán)結(jié)構(gòu)，A環(huán)和D環(huán)的二面角在80～100 °，幾乎互相垂直，化合物分子結(jié)構(gòu)整體比較穩(wěn)定，自由能比較低。本研究中所選阿樸啡類生物堿的取代基主要以甲氧基和羥基取代為主，不同的化合物在C1，C2，C10和11位具有不同的甲氧基或羥基取代。但這些不同位置的取代基由于空間位阻、氫鍵形成以及空間范德華力的不同對(duì)于化合物整體的穩(wěn)定性，電子云密度以及化合物物化常數(shù)產(chǎn)生顯著的影響。紫堇塊莖堿中C1位和C11位均為羥基，存在電子云的空間相斥作用，不易形成氫鍵，紫堇堿分子中D環(huán)中的2個(gè)甲氧基取代和C8位對(duì)位氫原子的存在，增加了芳香化的電子云密度，見表2。

24分子對(duì)接

分子對(duì)接采用SurflexDock受體配體對(duì)接自動(dòng)軟件，以EGFR受體和伊洛替尼的復(fù)合體（PDB code： 1M17）為目標(biāo)配體和受體理想構(gòu)型，在ATP絡(luò)氨酸激酶競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合口袋中剔除伊洛替尼的蛋白理想構(gòu)象，將異紫堇堿衍生物接入到ATP結(jié)合口袋底部，自由旋轉(zhuǎn)配體分子，搜索優(yōu)勢(shì)構(gòu)象和最佳結(jié)合位點(diǎn)，結(jié)合靜電勢(shì)表面圖，三維等高線圖，探索異紫堇堿及其類似物與關(guān)鍵絡(luò)氨酸激酶受體表皮生長(zhǎng)因子受體（EGFR）的立體空間結(jié)合情況及匹配度，見圖4。

對(duì)接結(jié)果顯示異紫堇堿的得分常數(shù)為-09，異紫堇二酮為592，NICD的得分為475，這與異紫堇二酮、NICD、異紫堇堿的體外抗腫瘤活性數(shù)據(jù)相一致，表明通過化學(xué)結(jié)構(gòu)修飾可以提高該類化合物與EGFR的結(jié)合度，對(duì)接分析中發(fā)現(xiàn)，C8位引入羰基和氨基后，可以和EGFR的相應(yīng)氨基酸形成氫鍵，增強(qiáng)其對(duì)于EGFR的結(jié)合度，但相對(duì)于經(jīng)典的EGFR靶向藥物吉非替尼等，其結(jié)合常數(shù)相對(duì)較低（8～10）。

25構(gòu)效關(guān)系分析

異紫堇堿類生物堿具有一定的抗癌活性，鑒于其分子結(jié)構(gòu)中固有的聯(lián)苯型共平面的四元環(huán)結(jié)構(gòu)所固有的剛性分子結(jié)構(gòu)，該類化合物的抗癌活性與其取代基的種類和位置具有一定的關(guān)系[19]，同分異構(gòu)體的紫堇塊莖堿和異紫堇塊莖堿，都含有2個(gè)羥基和2個(gè)甲氧基取代，后者的抗癌活性強(qiáng)于前者3倍以上，原因在于紫堇塊莖堿2個(gè)羥基的空間位置較近，互相排斥致使分子靜電勢(shì)顯著降低，化合物的溶解度顯著降低，致使紫堇塊莖堿的抗癌活性較弱。異紫堇塊莖堿中的D環(huán)中酚羥基的存在有效降低了芳香環(huán)的電子云密度，相應(yīng)增加了分子的靜電勢(shì)。2個(gè)羥基在分子識(shí)別和分子對(duì)接中形成氫鍵作用，有助于增強(qiáng)其抗癌活性。同屬同分異構(gòu)體的紫堇堿和異紫堇堿，由于分子中只含有1個(gè)羥基，雖然對(duì)于化合物靜電勢(shì)和溶解性等理化常數(shù)的影響也比較大，但整體對(duì)于抗癌活性的影響并不大。異紫堇堿類生物堿的C8位化學(xué)結(jié)構(gòu)修飾對(duì)于化合物抗癌活性的提高是非常關(guān)鍵的。不同于異紫堇堿母體結(jié)構(gòu)的原阿樸啡類生物堿具有較好的抗癌活性，與其形成的螺環(huán)結(jié)構(gòu)具有緊密關(guān)系。N甲基對(duì)于阿樸啡類和原阿樸啡類生物堿的抗癌活性影響并不是關(guān)鍵因素。

3討論

阿樸啡類生物堿廣泛分布于多種植物中，具有多種藥理活性，是一類重要的植物次生代謝產(chǎn)物，但其臨床應(yīng)用有限，為開發(fā)該類化合物的臨床價(jià)值，鑒于通過化學(xué)結(jié)構(gòu)修飾可以顯著提高該類化合物的抗癌活性，有必要對(duì)該類化合物的抗癌活性及其構(gòu)效關(guān)系進(jìn)行深入研究，通過進(jìn)一步的結(jié)構(gòu)優(yōu)化，發(fā)展抗癌活性化合物。

天然產(chǎn)物在植物長(zhǎng)期的進(jìn)化過程中要與外界生物進(jìn)行生存競(jìng)爭(zhēng)，其顯性遺傳的積累使得化合物趨于穩(wěn)定，天然產(chǎn)物是一個(gè)相對(duì)平衡、化學(xué)結(jié)構(gòu)穩(wěn)定的有機(jī)體，一旦打破這種平衡，就會(huì)產(chǎn)生意想不到的效果。本研究表明，化學(xué)結(jié)構(gòu)修飾可以顯著提高該類化合物的抗癌活性，尤其C8位的化學(xué)結(jié)構(gòu)衍生。

對(duì)阿樸啡類生物堿進(jìn)行進(jìn)一步的化學(xué)結(jié)構(gòu)優(yōu)化和抗癌活性篩選研究，預(yù)期可以發(fā)現(xiàn)活性較好的抗癌藥物，為天然阿樸啡類生物堿的有效利用提供依據(jù)。

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[責(zé)任編輯丁廣治]endprint