壇紫菜多酚抗氧化及抑制UVB致HSF細胞氧化損傷作用

李 鋒，李清仙，程志遠，郭養(yǎng)浩，石賢愛*

（福州大學生物科學與工程學院，福建 福州 350116）

壇紫菜多酚抗氧化及抑制UVB致HSF細胞氧化損傷作用

李 鋒，李清仙，程志遠，郭養(yǎng)浩，石賢愛*

（福州大學生物科學與工程學院，福建 福州 350116）

從壇紫菜中提取分離制備多酚組分，通過1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH）自由基清除能力、抑制β-胡蘿卜素褪色能力和鐵還原能力分析法評價壇紫菜多酚的體外抗氧化作用；以紫外線B（ultraviolet radiation B，UVB）致人表皮成纖維細胞（human skin fi broblast cells，HSFs）損傷模型評價壇紫菜多酚抑制紫外損傷表皮作用，考察其用于防護紫外損傷領(lǐng)域的可行性。體外實驗結(jié)果顯示，壇紫菜多酚具有較強的抗氧化作用，其DPPH自由基清除能力與同等質(zhì)量濃度的二丁基羥基甲苯（butylated hydroxytoluene，BHT）相當；但抑制β-胡蘿卜素亞油酸體系褪色能力和鐵還原能力弱于同等質(zhì)量濃度的BHT。細胞實驗結(jié)果顯示，壇紫菜多酚能有效降低UVB輻照所致HSFs的乳酸脫氫酶活力，維護細胞膜的完整性；降低受損細胞的活性氧類水平，增加超氧化物歧化酶、谷胱甘肽過氧化物酶活性，從而降低細胞的氧化應激狀態(tài)，提升內(nèi)皮細胞的抵抗氧化應激的能力，顯著抑制HSFs凋亡水平。壇紫菜多酚能在細胞水平有效保護HSFs免受UVB的氧化損傷，表明紫菜多酚具有用于紫外損傷防護領(lǐng)域的潛力。

壇紫菜多酚；抗氧化；紫外線B；氧化應激

壇紫菜（Porphyra haitanensis）系暖溫性海洋紅藻，是我國特有的傳統(tǒng)海水養(yǎng)殖大宗品種，主要分布于福建、浙江兩省?，F(xiàn)代研究發(fā)現(xiàn)，壇紫菜中富含多種海洋生物活性物質(zhì)：海藻多酚[1]、紅藻糖苷[2]、藻紅（藍）蛋白[3]以及海藻多糖等。多酚是一大類結(jié)構(gòu)不同、含有多個酚羥基化合物的總稱，廣泛存在于植物中。隨著現(xiàn)代分析和分離技術(shù)應用于海藻資源的開發(fā)以及對海藻的次級代謝產(chǎn)物研究的逐步深入，海藻多酚日益引起人們的關(guān)注。近年來研究表明，海藻多酚主要具有以下幾方面的生物活性：抗氧化活性[4-6]，可有效降低實驗動物血清和肝臟中丙二醛含量，提高超氧化物岐化酶（superoxide dismutase，SOD）等抗氧化酶活性，在體外具有較強的抑制自由基活性；抗腫瘤活性[7-8]，海藻多酚對多種腫瘤細胞株具有較強的抑制作用；調(diào)血脂降血糖活性[9-11]，可有效降低模型動物的空腹甘油三酯、膽固醇等血脂水平，有效降低糖尿病小鼠的空腹血糖值，提高實驗動物的葡萄糖耐受能力和對胰島素的敏感性。目前對于海藻多酚的研究主要集中在褐藻多酚方面，而對于紅藻多酚的研究相對較少。

隨著社會發(fā)展，人們有更多的時間從事戶外文體娛樂活動，這使得人體皮膚直接暴露于太陽紫外照射的時間大大延長。每年僅美國的新增非黑素瘤皮膚癌（non melanoma skin cancers，NMSCs）臨床病例數(shù)量就超過100萬，其發(fā)病率位居北美各類癌癥之首[12]。我國雖無詳細的流行病學及臨床統(tǒng)計資料，但紫外輻照所致皮膚損傷正日益引起重視。紫外線是波長范圍介于200～400 nm的電磁波[13]，可分為3 個波段：320～400nm的長波段，紫外線A（ultraviolet radiation A，UVA）；290～320 nm的中波段，UVB；200～290 nm的短波段，UVC[14]。受臭氧層的吸收作用，太陽光中的UVC不能穿透大氣層到達地面，在自然環(huán)境中幾乎不存在。UVB輻照是產(chǎn)生表皮損傷形成一系列皮膚疾病最普遍的環(huán)境致病因子，UVB能通過與表皮細胞中一系列組分發(fā)生反應而產(chǎn)生活性氧類（radical oxygen species，ROS）。生成的ROS主要為·OH，易與脂質(zhì)、蛋白質(zhì)和糖類等生物大分子發(fā)生過氧化反應，生成更有危害的過氧化物，破壞表皮細胞中酶性及非酶性抗氧化防御系統(tǒng)，使得皮膚受損，造成皮膚紅斑、光化角質(zhì)和NMSCs等病理狀態(tài)[15]。

為了減少在戶外時UVB對皮膚的損傷，人們常采用遮光劑和防曬乳來保護皮膚，這兩種主要是通過吸收和反射紫外線的方式來保護皮膚，但考慮到紫外皮膚病的高發(fā)病率，其所起的作用十分有限，故臨床亟需更為有效的基于新機制的皮膚保護制劑。目前，一些天然來源的小分子化合物表現(xiàn)出較好地抑制UVB致皮膚損傷的潛力[16-18]，引起了學界的極大關(guān)注，從天然植物化合物中開發(fā)皮膚光保護劑已成為該領(lǐng)域新的趨勢，這方面的研究方興未艾；也有較多的研究表明天然多酚類物質(zhì)能有效地抑制紫外線對于皮膚細胞的氧化損傷[19-21]，但主要集中于茶多酚等陸生植物的多酚類物質(zhì)，目前鮮見將海藻多酚用于抑制UVB致皮膚細胞損傷方面的研究報道。本實驗以新鮮壇紫菜為原料，提取分離其中多酚組分，通過1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH）自由基清除實驗、抑制β-胡蘿卜素褪色能力和鐵還原能力（ferric reducing antioxidant power，F(xiàn)RAP）分析法考察其體外抗氧化作用；以UVB致人表皮成纖維細胞（human skin fibroblast cells，HSFs）損傷模型考察壇紫菜多酚抑制紫外損傷表皮作用，探索壇紫菜多酚天然成分用于紫外防護的可行性。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

新鮮壇紫菜采自福建省平潭島。

DPPH、2,6-二叔丁基-4-甲基苯酚（butylated hydroxytoluene，BHT）、β-胡蘿卜素、三吡啶三吖嗪（tripyridyl-triazine，TPTZ）、Folin-Ciocaltea試劑 上海阿拉丁試劑公司；HSFs 鼎國生物技術(shù)有限公司；RPMI-1640培養(yǎng)基、胎牛血清（fetal bovine serum, FBS）、雙抗（青霉素-鏈霉素）溶液、胰蛋白酶等細胞培養(yǎng)相關(guān)試劑 美國HyClone公司；2 ,7 -二氯熒光黃雙乙酸鹽（dichlorodihydrofluorescein diacetate，DCFH-DA） 美國Sigma公司；Annexin V/PI雙染試劑盒 上海貝博生物技術(shù)公司；乳酸脫氫酶（lactic dehydrogenase，LDH）、SOD、谷胱甘肽過氧化物酶（glutathione peroxidase，GPx）測定試劑盒 南京建成生物工程研究所；其他試劑均為分析純。

1.2 儀器與設備

COULTER EPICS XL型流式細胞儀 美國Beckman公司；UV-1800紫外-可見分光光度計 日本島津公司；SHB-Ⅲ循環(huán)水式真空泵 鄭州長城科工貿(mào)公司；YRE-202A真空旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器 日本Eyela公司；二氧化碳培養(yǎng)箱 美國Thermo公司；倒置顯微鏡 重慶光電儀器公司；KN-4006B紫外光療儀 科諾醫(yī)學設備有限公司。

1.3 方法

1.3.1 壇紫菜多酚的提取及分離

在Wang Tao等[22]方法的基礎(chǔ)上加以修改。新鮮壇紫菜－80 ℃冷凍后進行冷凍干燥，粉碎；用乙醇按料液比1∶20（m/V）于35 ℃搖床200 r/min提取3 次，每次2 h，過濾收集提取液；合并濾液，減壓濃縮去除乙醇；濃縮液用等體積石油醚劇烈振蕩萃取以除去油脂，分液漏斗靜置分層，收集上層水相，重復萃取操作2 次；濃縮萃取分離后的水相。由于水相層提取物中含有較多的糖分，采用硅膠柱層析以去除糖分。硅膠柱高徑比25∶1濕法裝柱，上樣之后，采用乙酸乙酯-甲醇體系梯度洗脫，洗脫流速0.5 BV/h，部分收集器收集過柱液。每只試管取樣于微孔板中，減壓干燥去除有機溶劑，每孔加入同體積水，以消除有機溶劑對后續(xù)分析的干擾；硫酸-苯酚法測定糖分含量，采用Folin-Ciocaltea試劑分析多酚含量；繪制洗脫曲線，收集多酚洗脫峰；收集液減壓濃縮去除有機溶劑，冷凍干燥即得壇紫菜多酚（Porphyra haitanensis polyphenol，PP）樣品，－20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2 壇紫菜多酚DPPH自由基清除能力測定

采用Souza等[23]的方法略有改動。2 mL DPPH-甲醇或水溶液（1 mmol/L）與5 mL不同質(zhì)量濃度（0.125、0.250、0.500、1.000、2.000、4.000、8.000 mg/mL）的提取物溶液混合，振蕩搖勻，室溫避光放置30 min。用2 mL蒸餾水代替樣品作為陰性對照，相同方法處理。以BHT為陽性對照。于517 nm波長處測定吸光度，DPPH自由基清除率計算見式（1）。

式中：Α0為樣品與溶劑混合液的吸光度；Αi為DPPH自由基與樣品反應后的吸光度；Αj為DPPH自由基與溶劑混合后的吸光度。實驗重復3 次求平均值。

1.3.3 β-胡蘿卜素-亞油酸體系抗氧化分析

采用Shon等[24]的方法略做修改。將1 mg β-胡蘿卜素溶解于5 mL氯仿中，隨后加入100 μL亞油酸和1 mL吐溫-80，混合物室溫振蕩混合10 min。隨后，40 ℃減壓旋蒸去除氯仿，再加入100 mL氧飽和蒸餾水，劇烈搖晃1 min，形成乳化液（β-胡蘿卜素-亞油酸乳化液）。96 孔微孔板，每孔加入50 μL樣品溶液和200 μL的上述乳化液，搖床80 r/min混勻1 min，50 ℃孵育反應。在酶標儀上于470 nm波長處測定初始反應的吸光度以及反應120 min后的吸光度，分別記為Α0和Α120，ΔA=Α0－Α120，ΔA越大表明β-胡蘿卜素氧化程度越高、褪色越多。計算不同質(zhì)量濃度（0.125、0.250、0.500、1.000、2.000、4.000、8.000 mg/mL）的壇紫菜多酚樣品對β-胡蘿卜素-亞油酸乳化液褪色的抑制率，計算見式（2）。

式中：ΔA0表示不加樣品抑制時的褪色情況；ΔAi表示壇紫菜多酚樣品加入后產(chǎn)生抑制作用時的褪色情況。

1.3.4 鐵還原能力分析

FRAP抗氧化分析采用Benzie等[25]的方法。

配制FRAP工作液：取2.5mL 10 mmol/L的TPTZ，用40 mmol/L HCl配制）、2.5 mL 20 mmol/L的FeCl3和25 mL 0.3 mol/L的醋酸緩沖液（pH 3.6）混合均勻，即得FRAP工作液。

測定方法：取0.3 mL不同質(zhì)量濃度（0.125、0.250、0.500、1.00、2.000、4.000、8.000 mg/mL）的樣品，加入2.7 mL預熱至37 ℃的FRAP工作液，搖勻后放置10 min，于593 nm波長處測定吸光度，用空白溶劑作參比對照測定。根據(jù)反應后的吸光度，從FeSO4標準曲線上求得對應FeSO4濃度（μmol/L），根據(jù)樣品質(zhì)量濃度，換算成對應的當量“μmol FeSO4/g樣品”值，簡寫為“μmol/g”，定義為FRAP值。此值越大，表明抗氧化能力越強。

繪制FeSO4標準曲線：準確稱量6.08 mg FeSO4溶于適量水中，加入18 mol/L濃硫酸0.25 mL，再加水定容至50 mL，并放入一小鐵釘，作為貯液（濃度為800 μmol/L），將此貯液稀釋成25、50、100、200、400、800 μmol/L系列標準液濃度，各取0.3 mL按以上測定方法處理，測定吸光度，繪制標準曲線。

1.3.5 壇紫菜多酚抑制UVB致HSFs氧化損傷實驗

1.3.5.1 細胞培養(yǎng)

HSFs用RPMI-1640培養(yǎng)基（含10% FBS、100 U/mL鏈霉素、100 U/mL青霉素），置于5% CO2、37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每48 h換液一次。取對數(shù)生長期的細胞用0.25%胰酶消化，制備細胞懸液，密度調(diào)整至1×105個/mL，每孔100 μL接種于12 孔板，繼續(xù)培養(yǎng)24 h，隨后轉(zhuǎn)換無血清培養(yǎng)基培養(yǎng)4 h。

1.3.5.2 UVB輻照劑量、壇紫菜多酚安全劑量的確定及分組

輻照前將細胞用磷酸鹽緩沖液（phosphate buffer saline，PBS）清洗2 次后加入少量PBS覆蓋細胞，分別用10、25、50、75、100 mJ/cm2劑量的UVB（290～320 nm）輻照細胞，輻照后立即加入無血清培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)24 h，噻唑藍（methyl thiazolyl tetrazolium，MTT）法分析細胞活力以確定合適的輻照損傷劑量[26]。用含不同質(zhì)量濃度（5、20、50、100、500、1000 μg/mL）壇紫菜多酚的無血清培養(yǎng)基分別處理細胞24 h，參考文獻[27]采用MTT法分析細胞活力，以確定壇紫菜多酚對正常細胞不產(chǎn)生抑制作用的安全劑量范圍。

抑制UVB輻照實驗：細胞輻照前用藥物處理2 h，經(jīng)固定劑量UVB輻照后，立即加入含不同質(zhì)量濃度藥物（10、50、100 μg/mL PP；50 μg/mL BHT）的無血清培養(yǎng)基培養(yǎng)24 h，MTT法檢測細胞活性，考察藥物對UVB損傷的抑制 作用。將培養(yǎng)孔分成3組：空白對照組（不經(jīng)UVB輻照、不加壇紫菜多酚）；UVB輻照模型組（用50 mJ/cm2UVB輻照細胞，不加壇紫菜多酚）、藥物組（50 mJ/cm2UVB輻照，不同質(zhì)量濃度壇紫菜多酚無血清培養(yǎng)基處理）。

1.3.5.3 MTT法分析細胞活性

細胞按照1.3.5.2節(jié)方法，經(jīng)UVB輻照處理或藥物處理后，培養(yǎng)板吸去培養(yǎng)基，加入含5 mg/mL MTT的無血清無酚紅培養(yǎng)基，于37 ℃、5% CO2條件下繼續(xù)培養(yǎng)4 h，吸取MTT溶液，加入DMSO溶解所形成的甲簪晶體，570 nm波長處測定吸光度，按式（3）計算細胞活性。

1.3.5.4 細胞ROS水平、LDH活力及SOD、GPx活力測定

細胞ROS水平測定：采用黑壁底透96 孔板培養(yǎng)細胞，藥物處理方法同前。棄上清液，PBS清洗。每孔加入100 μL 10 μmol/L的DCFH-DA熒光染液，37 ℃避光染色30 min。PBS清洗2 次，用SpectraMax i3x型熒光酶標儀測定熒光強度，其激發(fā)光波長為480 nm，發(fā)射光波長為520 nm；以最高組熒光強度為100%，計算其他各組的相對熒光強度。

LDH活力測定：取細胞培養(yǎng)上清液，按照LDH試劑盒說明書操作，測定LDH活力（U/mL）。

SOD、GPx活力測定：收集6 孔培養(yǎng)板中細胞，冰浴超聲波破碎，收集蛋白，BCA試劑盒測定蛋白質(zhì)量濃度，樣品采用SOD和GPx試劑盒測定酶活力。

1.3.5.5 流式細胞術(shù)Annexin V/PI雙染分析細胞凋亡情況

將處于對數(shù)生長期的細胞接種于6 孔培養(yǎng)板中，接種密度為每孔5×105個細胞，組別設置及處理同1.3.5.2節(jié)，培養(yǎng)24 h。吸除培養(yǎng)基，胰蛋白酶消化貼壁細胞，收集106個細胞，PBS洗滌1 次，3 000 r/min離心2 min，棄上清液。按照Annexin V/PI雙染試劑盒說明書操作制備染色懸浮細胞，用于流式細胞法（flow cytometry，F(xiàn)CM）分析。200 目尼龍網(wǎng)過濾，流式細胞儀檢測分析，激發(fā)波長488 nm，發(fā)射波長530 nm，異硫氰酸熒光素（fluorescein isothiocyanate，F(xiàn)ITC）標記Annexin V的綠色熒光通過FITC通道（FL1）檢測，PI紅色熒光通過PI通道（FL3）檢測。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

采用Origin軟件單因素方差分析，P＜0.05表明差異顯著，P＜0.01表明差異極顯著。結(jié)果用±s表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 壇紫菜多酚的提取分離

圖 1 壇紫菜多酚硅膠柱層析洗脫圖譜Fig. 1 Chromatographic elution of PP on silica gel column

由圖1可知，壇紫菜多酚粗提物中還有部分的糖類物質(zhì)，主要為小分子碳水化合物類物質(zhì)（low molecularmass carbohydrates，LMMCs），在海藻體內(nèi)主要發(fā)揮維持滲透壓的作用[28]，較易溶于乙酸乙酯等中等極性溶劑。本實驗采用硅膠柱層析來實現(xiàn)LMMCs和多酚類物質(zhì)的分離。采用乙酸乙酯-甲醇體系進行梯度洗脫，流動相組成由100%乙酸乙酯逐漸過渡到100%甲醇，可得如圖1所示洗脫效果，壇紫菜多酚與小分子糖分（小分子質(zhì)量的寡糖、糖苷可溶于有機溶劑，而較大分子質(zhì)量的多糖則不溶于有機溶劑）可基本分離。單獨收集多酚洗脫峰作為純化的組分壇紫菜多酚，減壓濃縮，凍干樣品，－20 ℃保存，用于后續(xù)實驗。壇紫菜多酚樣品采用Folin-Ciocaltea法測定總酚含量為47.82%。

2.2 壇紫菜多酚的DPPH自由基清除能力

圖 2 壇紫菜多酚的DPPH自由基清除能力Fig. 2 DPPH radical scavenging effect of PP

由圖2可知，壇紫菜多酚具有較強的DPPH自由基清除能力，在質(zhì)量濃度1、2、4、8 mg/mL時清除率都接近100%，在最低質(zhì)量濃度0.125 mg/mL時清除率也超過60%。其DPPH自由基清除能力與同等質(zhì)量濃度的BHT相當，甚至略優(yōu)于BHT。

2.3 壇紫菜多酚的鐵還原能力

FRAP實驗結(jié)果如圖3所示。BHT的FRAP較強，在0.25 mg/mL時可達838.3 μmol/g，但隨著質(zhì)量濃度的增加，其FRAP值增加幅度并不明顯，8 mg/mL時FRAP值為1 213.4 μmol/g。而壇紫菜多酚在同等質(zhì)量濃度條件下，與BHT的FRAP值有一定差距，在較低質(zhì)量濃度下差距較大，0.25 mg/mL時FRAP值為70.3 μmol/g，而在較高質(zhì)量濃度下差距則不太明顯，8 mg/mL時FRAP值為1 038.8 μmol/g。說明壇紫菜多酚也具有較強的FRAP值，但其活性弱于同等質(zhì)量濃度的BHT。

圖 3 壇紫菜多酚FRAP分析Fig. 3 FRAP analysis of PP

2.4 壇紫菜多酚的β-胡蘿卜素-亞油酸體系抗氧化能力

圖 4 壇紫菜酚體對β-胡蘿卜素-亞油酸體系抗氧化分析Fig. 4 Antioxidant effect of PP on β-carotene-linoleic acid system

由于體系中亞油酸氧化產(chǎn)生過氧化氫自由基，使得β-胡蘿卜素漂白褪色，如果體系中同時存在抗氧化劑，則會對抗過氧化氫自由基，對該漂白褪色產(chǎn)生抑制作用。β-胡蘿卜素漂白實驗結(jié)果如圖4所示。與FRAP實驗結(jié)果相類似，BHT同樣具有較強的抑制β-胡蘿卜素褪色能力，其在質(zhì)量濃度1、2、4、8 mg/mL時抑制率均超過90%；壇紫菜多酚在8 mg/mL時的抑制率為90.5%，與BHT差距較小，而在0.125 mg/mL時的抑制率為21.4%，與BHT差距較大，推測BHT抗氧化的線性范圍較小，在較低質(zhì)量濃度范圍內(nèi)具有較強的抗氧化活性，但其質(zhì)量濃度超過1 mg/mL褪色抑制率提升的幅度不及壇紫菜多酚。

2.5 壇紫菜多酚對正常HSFs活性的影響

圖 5 壇紫菜多酚對正常HSFs活性的影響Fig. 5 Effect of PP on HSFs viability

由圖5可知，通過MTT法分析各組細胞活性，在0～100 μg/mL范圍內(nèi)，壇紫菜多酚對實驗細胞株無毒性作用，細胞活性都接近100%，當質(zhì)量濃度增加到500 μg/mL時，細胞活性還可達到87.6%，當質(zhì)量濃度達到1 000 μg/mL時細胞活性才明顯降低到約75%。與壇紫菜多酚相比，BHT的安全無毒劑量范圍較小，0～50 μg/mL范圍內(nèi)無明顯抑制作用，當質(zhì)量濃度為100 μg/mL及以上時，細胞活性降低明顯，小于80%。因此，后續(xù)實驗選擇的安全無毒性的劑量壇紫菜多酚為0～100 μg/mL，BHT為50 μg/mL。

2.6 UVB輻照對HSFs活性的影響

圖 6 UVB輻照強度對HSFs活性的影響（n=3）Fig. 6 Effect of UVB intensity on HSFs viability (n = 3)

由圖6可知，在10～100 mJ/cm2UVB輻照劑量范圍內(nèi)，同樣培養(yǎng)24 h條件下，隨著輻照劑量的增加，細胞活性逐漸呈降低趨勢，10 mJ/cm2時與對照組相比雖有下降但無顯著差異（P0.05），25 mJ/cm2及以上劑量時與對照相比具有顯著性差異（P＜0.05）。輻照劑量50 mJ/cm2時，HSFs活性抑制率約35%，處于合適的水平，后續(xù)研究統(tǒng)一選擇50 mJ/cm2作為制造UVB損傷細胞模型的標準輻照劑量。

2.7 壇紫菜多酚對UVB損傷細胞的LDH活力、ROS水平及SOD、GPx活力影響

表 1 壇紫菜多酚對UVB致HSFs損傷細胞LDH活力、ROS相對含量、SOD及GPx活力的影響（n= 3）Table 1 Effect of PP on LDH, ROS, SOD and GPx in HSFs treated by UVB (n= 3)

通過分析培養(yǎng)基中LDH活性來測定細胞LDH的漏出量，從而間接反映出細胞膜所受氧化損傷程度，結(jié)果如表1所示。與空白對照組相比，50 mJ/cm2UVB輻照模型組培養(yǎng)基中HSFs的LDH活力顯著增加到51.7 U/L，說明HSFs細胞膜受損傷嚴重，而壇紫菜多酚能有效保護細胞膜而降低細胞LDH活力，呈劑量依賴性。細胞ROS水平反映了細胞氧化應激的程度，由表1可知，壇紫菜多酚也能顯著抑制UVB輻照所致HSFs的ROS相對水平增加，在10 μg/mL時與UVB對照相比，ROS相對水平顯著降至83.4%（P＜0.05），且隨著劑量增加，進一步極顯著降低至54.6%（P＜0.01），表明壇紫菜多酚能有效減輕損傷細胞的胞內(nèi)氧化應激水平。SOD和GPx是機體重要的抗氧化酶，其活力反映細胞的抗氧化應激狀態(tài)，本實驗結(jié)果表明壇紫菜多酚同樣能提高UVB所致?lián)p傷細胞的SOD、GPx活力，提升細胞的抵抗氧化應激能力。

2.8 壇紫菜多酚抑制UVB輻照所致HSFs凋亡作用

圖 7 AnnexinV/PI雙染法檢測壇紫菜多酚抑制UVB誘導HSFs凋亡作用Fig. 7 Inhibitory effect of PP on HSFs apoptosis induced by UVBevaluated by AnnexinV/PI dual staining assay

Annexin V/PI雙染法利用細胞凋亡早期磷脂酰絲氨酸外翻的特征，配合PI進行細胞通透性檢測，可同時區(qū)分正常細胞（AV/PI）、早期凋亡細胞（AV＋/PI）、晚期凋亡細胞或壞死細胞（AV＋/PI＋）等處于不同病理狀態(tài)的細胞[29]。從圖7a1、a2和圖7b可知，50 mJ/cm2UVB輻照劑量可使HSFs的凋亡比例從正常細胞的約8.9%顯著增加到約75.0%（P＜0.01），正常細胞比例下降到8.7%（P＜0.01），表明UVB輻照誘導凋亡作用明顯。從圖7a3～a5和圖7b中可知，壇紫菜多酚在10 μg/mL時，細胞凋亡比例有所降低，但不呈顯著性；50 μg/mL時，可極顯著降低至55%（P＜0.01），100 μg/mL時進一步降低至40%左右（P＜0.01）。結(jié)果表明，壇紫菜多酚能顯著抑制UVB輻照所致的HSFs凋亡，呈劑量依賴性，但抑制作用略遜于同等質(zhì)量濃度的BHT（圖7a6）。

3 討 論

本實驗以新鮮壇紫菜原料，經(jīng)乙醇提取，硅膠樹脂柱層析乙酸乙酯/甲醇體系洗脫除去小分子糖類物質(zhì)等雜質(zhì)而分離得到了壇紫菜多酚，具有較強的體外抗氧化活性。

BHT是廣泛使用的通用型酚類抗氧化劑，具有較強的抑制ROS活性作用，常用作考察抗氧化作用的陽性對照物；紫外輻射是一種重要的氧化應激因素，UVB能通過與水、含半胱氨酸蛋白等發(fā)生光分解反應而產(chǎn)生ROS對細胞產(chǎn)生氧化損傷；故本實驗以BHT作為考察紫菜多酚抗氧化及抑制UVB氧化損傷HSFs的陽性對照物。DPPH作為一種較穩(wěn)定的自由基供體，廣泛用于天然抗氧化劑自由基清除能力的評估，化合物對DPPH自由基的清除能力主要取決于其對未成對電子的配對能力，壇紫菜多酚的DPPH自由基清除能力與同等質(zhì)量濃度的BHT相當甚至略優(yōu)于BHT；FRAP分析反映了抗氧化劑通過電子轉(zhuǎn)移將氧化態(tài)的Fe3＋還原為Fe2＋復合物的 能力，也間接反映還原機體活性氧的能力，實驗結(jié)果顯示壇紫菜多酚也具有較強的FRAP，但其活性弱于同質(zhì)量濃 度的BHT；β-胡蘿卜素-亞油酸體系用于抗氧化分析是由于體系中亞油酸氧化產(chǎn)生過氧化氫自由基，使得β-胡蘿卜素漂白褪色，如果體系中同時存在抗氧化劑，則會對抗過氧化氫自由基，對該漂白褪色過程產(chǎn)生抑制作用，壇紫菜多酚同樣具有較強的抑制β-胡蘿卜素褪色作用，但弱于BHT的效果，在8 mg/mL時的抑制率為90.5%，與BHT差距較小，而在0.125 mg/mL時的抑制率為21.4%，與BHT差距較大。

UVB輻照會打破細胞的氧化/抗氧化平衡狀態(tài)，導致氧化應激增強，抗氧化系統(tǒng)嚴重受損，對細胞產(chǎn)生氧化損傷，破壞細胞膜結(jié)構(gòu)，使細胞產(chǎn)生凋亡等[30]。SOD、GPx是機體重要的抗氧化酶，對維持細胞氧化還原平衡具有重要作用。LDH是較為穩(wěn)定的蛋白質(zhì)，存在于絕大多數(shù)正常細胞的胞質(zhì)中，不能分泌到胞外，而一旦細胞膜受損，LDH即被釋放到細胞外[31]；通過檢測細胞培養(yǎng)液中的LDH活性（即LDH的漏出量），可判斷細胞受損的程度。本研究結(jié)果表明，在一定質(zhì)量濃度范圍內(nèi)（0～100 μg/mL），壇紫菜多酚能有效降低UVB輻照所致HSFs的LDH活力，維護細胞膜的完整性；增加受損細胞的SOD、GPx活力，從而提升內(nèi)皮細胞的抵抗氧化應激的能力；顯著抑制UVB輻照所致的HSFs凋亡情況。

綜上，壇紫菜多酚具有較強的體外抗氧化作用；保護HSFs免受UVB輻照所致的氧化損傷，降低損傷細胞ROS水平，降低細胞的凋亡程度，維護細胞結(jié)構(gòu)的完整性。其機制有可能是通過增加細胞中諸如SOD、GPx等抗氧化酶而實現(xiàn)，具體的分子機理還需進一步深入研究。本實驗的結(jié)果表明，壇紫菜多酚有望應用于防護紫外照射損傷領(lǐng)域，為紫菜資源的有效利用提供了科學依據(jù)。

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Antioxidant and Protective Effect of Porphyra haitanensis Polyphenols against Oxidative Damage Induced by UVB in HSF Cells

LI Feng, LI Qingxian, CHENG Zhiyuan, GUO Yanghao, SHI Xian’ai*
(College of Biological Science and Engineering, Fuzhou University, Fuzhou 350116, China)

In the present study, polyphenols from Porphyra haitanensis (PP) were extracted and separated, and their in vitro antioxidant activity was investigated by 1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl (DPPH) ra dical scavenging capacity, the ability to inhibit the color fading of β-carotene and ferric reducing antioxidant power (FRAP), as well as their protective effect against oxidative damage induced by ultraviolet radiation B (UVB) in human skin fi broblast cells (HSFs). The aim of this investigation was to ascertain the applicability of PP to protect the skin against UV damage. In vitro tests demonstrated that PP had strong antioxidant activity, whose DPPH radical scavenging capacity was equivalent to that of BHT at the same concentration but whose ability to inhibit the color fading of β-carotene in the presence of linoleic acid and FRAP were weaker. The cellular experiment showed that PP significantly reduced lactic dehydrogenase (LDH) leakage from HSFs induced by UVB irradiation, maintained cell membrane integrity, decreased reactive oxygen species (ROS) level, enhanced the activity of antioxidant enzymes such as superoxide dismutase (SOD) and glutathione peroxidase (GPx), therefore attenuating cellular oxidative stress, enhancing the oxidative stress resistance of endothelial cells and signifi cantly inhibiting the apoptosis of HSFs. These fi ndings led us to conclude that PP can protect HSFs against UVB-induced oxidative damage and has potential for protection against UV-induced skin damage.

Porphyra haitanensis polyphenol; antioxidant; ultraviolet radiation B (UVB); oxidative stress

10.7506/spkx1002-6630-201717031

TS201.4

A

1002-6630（2017）17-0190-08

李鋒, 李清仙, 程志遠, 等. 壇紫菜多酚抗氧化及抑制UVB致HSF細胞氧化損傷作用[J]. 食品科學, 2017, 38(17): 190-197.

DOI:10.7506/spkx1002-6630-201717031. http://www.spkx.net.cn

LI Feng, LI Qingxian, CHENG Zhiyuan, et al. Antioxidant and protective effect of Porphyra haitanensis polyphenols against oxidative damage induced by UVB in HSF cells[J]. Food Science, 2017, 38(17): 190-197. (in Chinese with English abstract) DOI:10.7506/spkx1002-6630-201717031. http://www.spkx.net.cn

2016-07-02

國家海洋公益性行業(yè)科研專項（201205022）；福建省教育廳科技項目（JA13045）

李鋒（1976—），男，助理研究員，碩士，主要從事天然成分生物活性研究。E-mail：lifeng9676@aliyun.com *通信作者：石賢愛（1971—），男，教授，博士，主要從事海洋生物工程研究。E-mail：shixa@fzu.edu.cn