大豆蛋白肽-酪蛋白非磷酸肽組裝產(chǎn)物的熒光光譜分析及抗氧化性研究

張 娜，郭慶啟，黃文秀，石彥國,*

（1.哈爾濱商業(yè)大學食品工程學院，黑龍江省食品科學與工程重點實驗室，黑龍江 哈爾濱 150076；2.東北林業(yè)大學林學院，黑龍江 哈爾濱 150040；3.山東禹王生態(tài)食業(yè)有限公司，山東 德州 251200）

大豆蛋白肽-酪蛋白非磷酸肽組裝產(chǎn)物的熒光光譜分析及抗氧化性研究

張 娜1，郭慶啟2，黃文秀3，石彥國1,*

（1.哈爾濱商業(yè)大學食品工程學院，黑龍江省食品科學與工程重點實驗室，黑龍江 哈爾濱 150076；2.東北林業(yè)大學林學院，黑龍江 哈爾濱 150040；3.山東禹王生態(tài)食業(yè)有限公司，山東 德州 251200）

對不同pH值條件下制備的大豆蛋白肽-酪蛋白非磷酸肽組裝產(chǎn)物（casein non-phosphopeptides-soybean peptide complex，CNPSPC）的熒光光譜及抗氧化性進行分析。結果表明，隨著pH值增加，CNPSPC埋藏在疏水環(huán)境中的Trp殘基暴露到分子表面的強度逐漸低于組裝前的原料蛋白，且Trp殘基所處的微環(huán)境極性有所降低。硫磺素T熒光光譜分析表明，pH 6.0的制備條件下，CNPSPC熒光強度最大，此時CNPSPC的β-折疊結構含量可能最多。組裝改變了CNPSPC的Trp殘基在空間結構中所處的微環(huán)境，使CNPSPC的分子構象發(fā)生改變。與酪蛋白非磷酸肽（casein non-phosphopeptides，CNPP）和大豆蛋白肽（soybean peptide，SP）相比，CNPSPC的抗氧化能力有所提高，在pH 6.0時其清除1,1-二苯基-2-三硝基苯肼自由基、O2－·、·OH能力達到最大，分別提高到組裝前大豆蛋白的3.34、1.12 倍和1.08 倍。

大豆蛋白肽；酪蛋白非磷酸肽；組裝；熒光光譜；抗氧化性

張娜, 郭慶啟, 黃文秀, 等. 大豆蛋白肽-酪蛋白非磷酸肽組裝產(chǎn)物的熒光光譜分析及抗氧化性研究[J]. 食品科學, 2017, 38(17): 42-46. DOI:10.7506/spkx1002-6630-201717008. http://www.spkx.net.cn

ZHANG Na, GUO Qingqi, HUANG Wenxiu, et al. Fluorescence spectral analysis and antioxidant effect of soybean ploypeptide-casein non-phosphorylated peptide assembly[J]. Food Science, 2017, 38(17): 42-46. (in Chinese with English abstract) DOI:10.7506/spkx1002-6630-201717008. http://www.spkx.net.cn

酪蛋白是乳中含量極為豐富的蛋白質，其蛋氨酸的含量約占總酪蛋白的3.26%，這些蛋氨酸主要存在于酪蛋白非磷酸肽（casein non-phosphopeptides，CNPP）部分，每100 g CNPP含蛋氨酸約3.1 g[1]。CNPP是利用酪蛋白工業(yè)化生產(chǎn)酪蛋白磷酸肽（casein phosphopeptides，CPP）的副產(chǎn)物，以疏水性氨基酸為主，我國目前有近80%的CNPP沒有被合理利用，而是被作為飼料或廢物棄去[2]。為提高大豆蛋白的功能性質及抗氧化性，本課題組考慮利用CNPP同大豆蛋白的疏水區(qū)域進行溫和組裝，完善大豆蛋白的營養(yǎng)組成，同時確保其具有良好的功能性質。

熒光光譜通過蛋白質分子中熒光生色基團所處的微環(huán)境信息來獲得蛋白質結構變化的規(guī)律。利用檢測蛋白質結構中熒旋光性氨基酸峰位強度的變化，對蛋白質中熒旋光性物質進行定量及定性分析，進而了解蛋白質中重要的氨基酸殘基所處的微環(huán)境[3-4]。一般來說，天然蛋白質中能夠產(chǎn)生熒光的氨基酸殘基多分布于蛋白質分子的內(nèi)部，這種氨基酸殘基的極性小于其外部環(huán)境的極性。同一種熒光基團所處環(huán)境的極性發(fā)生改變時，其最大吸收波長也會發(fā)生變化[5]，由此推斷蛋白質分子在各種環(huán)境中或者與各種分子作用之后的構象變化，進而了解大分子的結構與功能的關系[6]。該方法具有靈敏度高、選擇性強、用樣量少、方法簡便等優(yōu)點，在蛋白質的相互作用研究中應用比較廣泛[7-8]。因此，通過熒光光譜分析技術對蛋白質或組裝產(chǎn)物進行結構分析的研究也日益增多。

目前，對于蛋白質的組裝過程、機理和特性表征更多側重于單一種類的蛋白質的組裝過程，僅有少數(shù)研究是針對兩種異源性蛋白質的自組裝[9-11]。組裝產(chǎn)物的結構和特性也根據(jù)原料的不同而存在明 顯差別。因此，本實驗利用大豆蛋白和酪蛋白這兩種異源性蛋白質制備形成大豆蛋白肽-酪蛋白非磷酸肽組裝產(chǎn)物（casein non-phosphopeptides-soybean peptide complex，CNPSPC），并通過研究不同pH值條件下制備的組裝體結構及抗氧化性的變化，進而研究pH值對組裝產(chǎn)物的影響，為異源蛋白的組裝及利用提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

酪蛋白 北京奧博星有限公司；大豆分離蛋白哈高科食品有限公司。

堿性蛋白酶（278 000 U/g）、胰凝乳酶（440 000 U/g）、

式中：As為樣品溶液的吸光度；Ab為蒸餾水的吸光度。

采用Tang Xueyan等[16]鄰苯三酚自氧化方法，在517 nm波長處測定樣品溶液吸光度，清除能力計算如式（2）所示。

1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH） 美國Sigma公司；其他試劑均為分析純 國藥集團化學試劑有限公司。

1.2 儀器與設備

LD4-2A低速離心機 北京醫(yī)用離心機廠；DHG-9123電熱恒溫轉風干燥箱、HWS24電子分析天平 上海恒科有限公司；UV5100B紫外-可見分光亮度計 上海元析儀器有限公司；XMTD-204數(shù)顯恒溫水浴鍋 天津市歐諾儀器儀表有限公司；F-4500熒光分光亮度計 日本日立公司。

1.3 方法

1.3.1 CNPSPC制備

參照黃文秀等[12]的方法進行制備。

1.3.2 CNPSPC熒光光譜分析

1.3.2.1 內(nèi)源性熒光光譜分析

參照Wang Haidong等[13]方法稍加修改。測定添加與不添加胰凝乳酶情況下，不同pH值（4.0、5.0、6.0、7.0、8.0）條件制備得到的CNPSPC熒光光譜。分別將制備得到的CNPSPC樣品溶解于磷酸鹽緩沖液（0.01 mol/L，pH 7.0）中，使其質量濃度為0.15 mg/mL。熒光光譜的激發(fā)波長為290 nm，發(fā)射光譜掃描范圍為300～400 nm，激發(fā)狹縫和發(fā)射狹縫為5 nm。

1.3.2.2 硫磺素T熒光光譜分析

根據(jù)Akkermans等[14]方法稍加修改，制備0.8 mg/mL（2.5 mmol/L）的硫磺素T（thioflavin T，ThT）熒光染料儲備液，避光保存不超過1 周。分析時將ThT儲備液稀釋成50 μmol/L的工作液。溶解不同pH值（4.0、5.0、6.0、7.0、8.0）條件下制備得到的CNPSPC樣品使其質量濃度為5 mg/mL，通過0.22 μm的濾膜，測定時將40 μL樣品溶液與4 mL的ThT工作液混合反應2 min后進行測量。設定儀器的激發(fā)波長為440 nm，發(fā)射波長掃描范圍為450～600 nm，激發(fā)狹縫和發(fā)射狹縫皆為5 nm。

1.3.3 CNPSPC抗氧化性測定

1.3.3.1 清除DPPH自由基能力測定

參照Nsimba等[15]方法，在517 nm波長處測定樣品溶液吸光度，DPPH自由基清除能力計算見式（1）。

式中：A1為樣品溶液的吸光度；A2為不加鄰苯三酚時溶液的吸光度；A3為不加樣品時溶液的吸光度。

1.3.3.3 清除·OH能力測定

參照申衍豪[17]的方法，在517 nm波長處測定樣品溶液吸光度，·OH清除能力計算公式如式（3）所示。

式中：A1為樣品溶液的吸光度；A2為無顯色劑時的吸光度；A3為不加樣品時的吸光度。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

采用Excel 2007和SPSS 17.0軟件對數(shù)據(jù)進行處理、繪圖，對結果進行統(tǒng)計、分析。所有實驗重復3 次（除另說明），結果表示為±s。對數(shù)據(jù)進行方差分析（ANOVA）分析和最小顯著差異（LSD）實驗。顯著性水平設定為P＜0.05。

2 結果與分析

2.1 熒光光譜結果分析

2.1.1 內(nèi)源性熒光光譜分析

圖 1 不同pH值下制備得到的CNPSPC熒光光譜圖Fig. 1 Fluorescence spectra of CNPSPC obtained at different pH values

熒光光譜中的最大發(fā)射波長（λmax）與蛋白中Trp殘基所處的微環(huán)境有關[18]，當λmax在330～332 nm范圍內(nèi)，Trp殘基埋藏在非極性區(qū)域內(nèi)；當λmax在340～342 nm范圍內(nèi)，Trp殘基固定在蛋白質分子表面，且限制了其與水的接觸；當λmax在350～352 nm范圍內(nèi)，Trp殘基徹底暴露于極性環(huán)境中。不同pH值環(huán)境下制備得到的CNPSPC樣品中Trp殘基熒光強度的變化情況由圖1可知，分析結果有兩個明顯的特征，即熒光強度的變化和λmax的偏移。在組裝過程中，不同pH值條件下制備得到的CNPSPC的熒光光譜的形狀幾乎沒有差異，但其λmax及熒光強度有顯著變化，隨著pH值的增加，最大熒光強度和λmax呈顯著逐漸降低趨勢。CNPSPC的λmax隨著制備pH值的增加而發(fā)生藍移，這表明CNPSPC的三級結構發(fā)生了一定變化，原來處于CNPSPC分子外部極性環(huán)境中的Trp殘基逐漸向其分子內(nèi)部非極性環(huán)境中轉移，且其所處的微環(huán)境極性有所降低，內(nèi)部擁有更多的疏水性官能團，使其的三級結構更加緊密[19-20]。熒光光譜表明組裝改變了芳香氨基酸殘基在空間結構中所處的微環(huán)境，使大豆分離蛋白的分子構象發(fā)生改變，且熒光光譜顯示酪蛋白與大豆分離蛋白中Trp殘基發(fā)生相互作用，使其周圍的疏水作用減少。劉薇等[21]也研究證實，蛋白質復合過程中Trp疏水性強弱的變化，可以直接反映微環(huán)境中蛋白高級結構的變化。鄒承魯[22]通過熒光光譜研究蛋白質分子構象的變化時發(fā)現(xiàn)，λmax的增加導致蛋白質結構進一步伸展，說明這時整體構象發(fā)生變化使蛋白質處于整體構象解體的狀態(tài)，Trp殘基逐漸向其分子內(nèi)部非極性環(huán)境中轉移，致使位于蛋白質分子表面的色氨酸殘基減少，其熒光強度降低。

2.1.2 ThT熒光光譜分析

ThT是一種陽離子的苯并噻唑，可以與蛋白質淀粉樣纖維（β-折疊結構）發(fā)生高度特異性結合，也是在480 nm波長處附近的熒光強度升高的熒光染料[23]。同時隨著β-折疊數(shù)量的增加，其熒光強度相應增加，被廣泛應用于檢測蛋白質聚集體的二級結構研究。通常情況下，ThT的熒光強度與蛋白中β-折疊結構的含量顯示出正相關，但其自身不會使蛋白構象發(fā)生改變。為考察不同pH值環(huán)境下制備得到的CNPSPC中的β-折疊結構含量的變化情況，本研究分別利用在pH 4.0、5.0、6.0、7.0、8.0環(huán)境下制備得到的CNPSPC同ThT發(fā)生高度特異性結合，并進行熒光光譜測定，結果如圖2所示。

圖 2 不同pH值下制備得到的CNPSPC的ThT熒光光譜圖Fig. 2 ThT fi uorescence spectra of CNPSPC prepared at different pH values

隨著制備pH值的增加，CNPSPC熒光強度出現(xiàn)先增強后減弱的變化規(guī)律。pH 6.0制得的CNPSPC熒光強度最大，此時進行CNPSPC組裝，得到的CNPSPC的β-折疊結構數(shù)量最多。在更高pH值環(huán)境下制備的CNPSPC，其熒光強度略有下降?？赡苁怯捎谥苽浣M裝體的pH值由4.0增大到6.0的過程中，CNPSPC聚集成線性纖維聚集體，當pH值由6.0增大到8.0時，CNPSPC由線性聚集向團狀聚集轉變，從而減小了熒光強度。Khurana等[24]也曾利用ThT熒光強度分析蛋白質纖維化聚集變化規(guī)律，發(fā)現(xiàn)ThT熒光強度與蛋白質纖維化聚集程度成正比。Akkermans等[14]發(fā)現(xiàn)，當pH值超過等電點并不斷升高會導致蛋白線性纖維聚集結構發(fā)生分裂，變成團狀結構，從而減小了與ThT染料的相互作用，導致熒光強度降低。張業(yè)輝[25]研究蕓豆蛋白纖維狀聚集及凝膠機理時，發(fā)現(xiàn)當把樣品的pH值由2.0調到7.0，其ThT相對熒光強度均發(fā)生不同程度的減小。

2.2 CNPSPC抗氧化性分析

圖 3 不同pH值環(huán)境下制備得到的CNPSPC的抗氧化能力Fig. 3 Antioxidant ability of CNPSPC prepared at different pH

由圖3可知，與SP相比，在pH值為6.0時進行組裝，得到的產(chǎn)物的DPPH自由基、O2－·、?OH清除能力均顯著增強（P＜0.05）。DPPH自由基、O2－·、?OH清除能力隨著pH值的增加，呈先增加后降低趨勢，在pH 4.0～6.0范圍內(nèi)，CNPSPC對3 種自由基清除能力升高，而在pH 6.0～8.0范圍內(nèi)則下降，且在pH 6.0時DPPH自由基、O2－·、?OH清除能力最強，分別達（61.70±1.10）%，（46.99±2.30）%和（97.86±1.59）%，清除3 種自由基的能力分別提高到SP的3.34、1.12 倍和1.08 倍。研究表明，蛋白質水解物的組裝反應，可以顯著改善水解物的抗氧化性質[26]。王晗欣等[27]發(fā)現(xiàn)類蛋白組裝反應可以顯著改善蛋白質水解物的抗氧化性質。Giménez等[28]發(fā)現(xiàn)，氨基酸的序列結果對蛋白質抗氧化活性影響較大。岳楠[29]研究了13 種酪蛋白水解物的類蛋白組裝反應修飾產(chǎn)物，測定了這些修飾產(chǎn)物的還原能力，?OH清除率和DPPH自由基清除率，并對樣品的抗氧化活性進行分析比較。結果表明，與水解物相比，不添加氨基酸的類蛋白修飾產(chǎn)物的DPPH自由基清除能力、還原能力、?OH清除率都得到提高。通過酶的催化作用得到的蛋白質水解物，擺脫不了原料蛋白一級結構的限制，導致其抗氧化活性提高程度受到限制。而組裝反應涉及到肽分子之間的縮合作用、轉肽作用，也就是可以在肽分子末端連接大片段或疏水性氨基酸殘基，所以反應的修飾產(chǎn)物，可以導致某些分子的氨基酸序列發(fā)生改變，產(chǎn)生新的肽分子，也就實現(xiàn)了肽分子的結構或氨基酸序列的重新組合，使其生物活性也隨之發(fā)生變化[29]。Wang Xiansheng等[30]研究顯示疏水性氨基酸對抗氧化活性有明顯的影響，其疏水性氨基酸含量較高的水解物其DPPH自由基清除率也比較高。本研究中，內(nèi)源性熒光分析發(fā)現(xiàn)，當λmax不斷增加時，Trp殘基由極性環(huán)境逐漸向內(nèi)部的非極性環(huán)境轉移。而且，經(jīng)ThT熒光光譜分析發(fā)現(xiàn)，pH 6.0時制備得到的CNPSPC的蛋白線性纖維聚集結構最穩(wěn)定，此時，CNPSPC清除DPPH自由基、O2－·、?OH能力也最強，這很可能是大豆分離蛋白與酪蛋白之間發(fā)生有序而穩(wěn)定的相互作用，從而引起構象發(fā)生改變，使抗氧化能力得到提升。

3 結 論

通過內(nèi)源熒光光譜結果分析表明，不同pH值條件下制備得到的CNPSPC的內(nèi)源熒光光譜的形狀幾乎沒有差異，但其λmax及熒光強度有顯著變化，隨著pH值的增加，最大熒光強度和λmax呈顯著逐漸降低趨勢。由于原來處于CNPSPC分子外部的極性環(huán)境中的Trp殘基逐漸向CNPSPC分子內(nèi)部非極性環(huán)境中轉移，所以Trp殘基所處的微環(huán)境極性有所降低。通過對ThT外源熒光測定結果表明：隨著制備pH值的增加，CNPSPC熒光強度出現(xiàn)先增強后減弱的變化趨勢，且在pH 6.0條件下制備的CNPSPC熒光強度最大，與CNPP和SP相比，CNPSPC的抗氧化能力都有所提高，說明組裝后得到的CNPSPC抗氧化能力較高，且隨著pH值的增加，其清除DPPH自由基、O2－·、·OH能力均呈現(xiàn)先增加后降低趨勢，且皆在

pH 6.0時達到最大。

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Fluorescence Spectral Analysis and Antioxidant Effect of Soybean Ploypeptide-Casein Non-Phosphorylated Peptide Assembly

ZHANG Na1, GUO Qingqi2, HUANG Wenxiu3, SHI Yanguo1,*
(1. Key Laboratory of Food Science and Engineering of Heilongjiang Province, School of Food Engineering, Harbin University of Commerce, Harbin 150076, China; 2. School of Forestry, Northeast Forestry University, Harbin 150040, China; 3. Shandong Yuwang Ecological Food Industry Co. Ltd., Dezhou 251200, China)

The fluorescence spectra and antioxidant properties of casein non-phosphopeptides-soybean peptide complex (CNPSPC) prepared under different pH conditions were analyzed. The results showed that with the increase of pH, the content of surface-exposed Trp residues buried in hydrophobic environment in CNPSPC was became lower than in the raw protein, and the microenvironment polarity of Trp residues was decreased. The results of thiofi avin T (ThT) fi uorescence assay showed that the fluorescence intensity of CNPSPC was maximum at pH 6.0, which represented β-sheet was the dominant secondary structure of CNPSPC. The microenvironment of Trp residues was changed by the assembly, thereby changing the molecular conformation of CNPSPC. Compared with casein non-phosphopeptides (CNPP) and soybean peptide (SP), the antioxidant capacity of CNPSPC was improved. The scavenging activities of CNPSPC against 1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl (DPPH), superoxide anion and hydrolxyl radicals were maximum at pH 6.0, which increased by 3.34, 1.12 and 1.08 times compared to soybean protein respectively.

soybean polypeptide; casein non-phosphorylated peptide; assembly; fi uorescence spectrum; antioxidant activity

10.7506/spkx1002-6630-201717008

TS 201.2

A

1002-6630（2017）17-0042-05引文格式：

2016-06-09

“十三五”國家重點研發(fā)計劃重點專項（2016YFD0400400）；黑龍江省博士后科研啟動項目（LBH-Q15073）；哈爾濱市科技局科技創(chuàng)新人才研究專項資金項目（2016RAQXJ146）；中國食品科學技術學會食品科技基金項目（2016-002）；國家自然科學基金青年科學基金項目（31301602）；黑龍江省應用技術研究與開發(fā)計劃項目（GC13B215；GA14B201）

張娜（1979—），女，教授，博士，研究方向為食品安全與食品化學。E-mail：foodzhangna@163.com

*通信作者：石彥國（1960—），男，教授，碩士，研究方向為大豆科學。E-mail：yanguosh@163.com