左歸降糖解郁方對糖尿病并發(fā)抑郁癥大鼠海馬星形膠質(zhì)細胞神經(jīng)營養(yǎng)的影響

楊蕙 王宇紅 杜青 韓遠山 孟盼 劉檢 劉林 趙洪慶

摘要：目的 研究左歸降糖解郁方對糖尿病并發(fā)抑郁癥模型大鼠海馬星形膠質(zhì)細胞神經(jīng)營養(yǎng)功能的保護作用。方法 采用復合方法建立糖尿病并發(fā)抑郁癥大鼠模型。實驗大鼠隨機分為模型組、陽性藥組和左歸降糖解郁方高、中、低劑量組，每組12只，另取12只SD大鼠作為正常組。各給藥組給予相應藥物灌胃，連續(xù)4周。曠場實驗檢測大鼠抑郁行為，免疫組化檢測大鼠海馬星形膠質(zhì)細胞標記物特異性蛋白膠質(zhì)纖維酸性蛋白（GFAP）及神經(jīng)元細胞標記物微管相關(guān)蛋白2（MAP2）的表達，Western blot和RT-PCR檢測大鼠海馬星形膠質(zhì)細胞營養(yǎng)分泌物腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子（BDNF）、膠質(zhì)細胞源性神經(jīng)營養(yǎng)因子（GDNF）、神經(jīng)生長因子（NGF）表達。結(jié)果 與正常組比較，模型組大鼠活動次數(shù)明顯減少，海馬GFAP表達明顯增加，MAP2、BDNF、GDNF、NGF表達明顯減少；左歸降糖解郁方干預后，模型大鼠抑郁行為明顯改善，大鼠海馬BDNF、GDNF、NGF、MAP2表達增加，GFAP表達明顯減少。結(jié)論 左歸降糖解郁方可有效改善大鼠海馬星形膠質(zhì)細胞的分泌功能，其可能通過增強星形膠質(zhì)細胞的營養(yǎng)作用保護神經(jīng)元，從而發(fā)揮抗抑郁作用。

關(guān)鍵詞：左歸降糖解郁方；糖尿病并發(fā)抑郁癥；星形膠質(zhì)細胞；神經(jīng)營養(yǎng)；大鼠

DOI：10.3969/j.issn.1005-5304.2017.09.011

中圖分類號：R285.5 文獻標識碼：A 文章編號：1005-5304（2017）09-0043-05

Effects of Zuogui Jiangtang Jieyu Prescription on Neurotrophic Effects of Astrocytes in Diabetes Mellitus Rats with Depression YANG Hui1， WANG Yu-hong2， DU Qing2， HAN Yuan-shan1， MENG Pan2， LIU Jian1， LIU Lin1， ZHAO Hong-qing1 （1. First Hospital of Hunan University of Chinese Medicine， Changsha 410007， China； 2. Training Bases， Hunan Key Laboratory of Chinese Materia Medica Powder and Innovative Drugs Established by Provincial and Ministry， Changsha 410007， China）

Abstract： Objective To investigate the effects of Zuogui Jiangtang Jieyu Prescription on neurotrophic effects of astrocytes in diabetes mellitus rats with depression. Methods The diabetes mellitus with depression rat models were established by composite method， and then were randomly divided into 5 groups： model group， positive group， Zuogui Jiangtang Jieyu Prescription high-， medium-， low-dose groups， with 12 rats in each group. 12 normal rats were set as control group. Each administration group was given relevenat medicine for gavage for continuous 4 weeks. Open-field test was used to evaluate the depression-like behavior. The expression of GFAP in astrocyte and MAP2 in neuron were tested by immunohistochemistry. The expression of protein and mRNA of BDNF， GDNF， and NGF were tested by Western blot and RT-PCR. Results Compared with the control group， the activities of rats in model group were significantly reduced. The expression of GFAP increased， while the expressions of MAP2， BDNF， GDNF and NGF decreased. Compared with the model group， the depression-like behavior of rats in model group were significantly improved. The expression of GFAP decreased， while the expressions of MAP2， BDNF， GDNF and NGF increased， and GFAP decrseaed significantly. Conclusion The secretion function of astrocyte can be improved by Zuogui Jiangtang Jieyu Prescription. Its anti-depression and neuron-protection function might be correlated with the enhancement of neurotrophic effects of astrocytes.

Key words： Zuogui Jiangtang Jieyu Prescription； diabetes mellitus with depression； astrocyte； neurotrophy； rats

基金項目：國家自然科學基金（81403379、81373578、81573965、81603604）；湖南省自然科學基金（2016JJ4064）

通訊作者：王宇紅，E-mail：philomena_yh@sina.com

研究發(fā)現(xiàn)，糖尿病并發(fā)抑郁癥占糖尿病患者比例高達38.35%，其中輕度抑郁癥為26%，中度為9.6%，中重度為2.9%，重度為0.7%[1]。目前治療用藥較少、研發(fā)滯后，與高患病率形成了鮮明對比。左歸降糖解郁方是在左歸丸基礎(chǔ)上加減而得，課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，其可有效降低糖尿病并發(fā)抑郁癥模型大鼠血糖，改善胰島素抵抗；行為學研究發(fā)現(xiàn)，其可增加大鼠的不動行為，增強學習記憶能力；形態(tài)學研究結(jié)果表明，模型大鼠海馬病理損傷在給藥后顯著減輕[2-4]。此外，課題組還發(fā)現(xiàn)，左歸降糖解郁方對糖尿病并發(fā)抑郁癥大鼠海馬星形膠質(zhì)細胞同樣具有保護作用[5]。星形膠質(zhì)細胞是中樞神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)比重較大的一類膠質(zhì)細胞，在神經(jīng)元的整個發(fā)育過程中起重要作用。目前針對糖尿病并發(fā)抑郁癥的研究多集中于對高糖、胰島素抵抗、神經(jīng)元功能可塑性等方面展開，較少有星形膠質(zhì)細胞在其中的重要作用的研究。左歸降糖解郁方是否通過影響星形膠質(zhì)細胞-神經(jīng)元相互作用保護神經(jīng)元，進而發(fā)揮抗抑郁的作用，尚未見報道。本實驗以星形膠質(zhì)細胞的神經(jīng)營養(yǎng)作用為主，采用免疫組化、Western blot、RT-PCR檢測星形膠質(zhì)細胞和神經(jīng)元的標記物及海馬星形膠質(zhì)細胞的3種分泌物腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子（BDNF）、膠質(zhì)細胞源性神經(jīng)營養(yǎng)因子（GDNF）、神經(jīng)生長因子（NGF）的表達，初步研究左歸降糖解郁方對星形膠質(zhì)細胞分泌功能的影響及對神經(jīng)元的保護作用。

1 實驗材料

1.1 動物

SPF級雄性SD大鼠72只，體質(zhì)量180～220 g，湖南斯萊克景達實驗動物有限公司，動物許可證號SCXK（湘）2013-0004。飼養(yǎng)于湖南中醫(yī)藥大學SPF級動物房，溫度20～24 ℃、相對濕度40%～60%，自由攝食飲水，實驗前適應性飼養(yǎng)3 d。

1.2 藥物

左歸降糖解郁方（黃芪18 g，貫葉連翹3 g，姜黃9 g，熟地黃15 g，山萸肉12 g，枸杞子12 g，菟絲子9 g，杜仲9 g，丹參12 g，牡丹皮6 g，牛膝9 g），上述飲片購自本院中藥房，由制劑室煎制；鹽酸二甲雙胍片，湖南湘雅制藥有限公司，批號150123；鹽酸氟西汀膠囊，法國Patheon，批號SS41A。

1.3 主要試劑與儀器

鏈脲佐菌素（STZ，Solarbio），膠質(zhì)纖維酸性蛋白（GFAP）、微管相關(guān)蛋白2（MAP2）兔抗大鼠多克隆抗體（武漢博士德有限公司），BDNF、GDNF、NGF兔抗大鼠多克隆抗體（abcom公司）；即用型SABC-AP試劑盒和Western用二抗IgG-HRP（武漢博士德有限公司）。Open-field敞箱（美國東樂自然基因生命科學公司），mini protean 3 cell型電泳儀（BIO-RAD公司），PS-9型電轉(zhuǎn)儀（大連競邁科技有限公司），PCR儀（BIO-RAD公司），Olympus生物顯微鏡（日本OLYMPUS公司），DVP-W7顯微鏡圖像處理系統(tǒng)（南京長城信息系統(tǒng)公司）。

2 實驗方法

2.1 造模、分組及給藥

采用高脂灌胃/STZ/慢性應激方法建立糖尿病并發(fā)抑郁癥動物模型[6]。實驗大鼠隨機分為模型組、陽性藥組（二甲雙胍0.18 g/kg+氟西汀1.8 mg/kg）和左歸降糖解郁方高、中、低劑量組（20.53、10.26、5.13 g/kg），每組12只，另取12只SD大鼠作為正常組。陽性藥組大鼠予二甲雙胍18 mg/mL和氟西汀0.18 mg/mL，左歸降糖解郁方高、中、低劑量組大鼠分別予2.053、1.026、5.13 g/mL左歸降糖解郁方水煎液，正常組和模型組給予等量蒸餾水。各組大鼠給藥體積均為10 mL/kg，連續(xù)28 d。

2.2 樣本采集與處理

各組大鼠采用水合氯醛麻醉后，取6只用于免疫組化實驗，另6只做PCR和Western blot實驗。免疫組化樣本處理方法：處死大鼠，打開胸腔，從心尖入針，剪開心耳，4%多聚甲醛進行灌注，用以固定蛋白及沖去腦中血液，取全腦并浸泡于4%多聚甲醛中。PCR和Western blot樣本處理方法：處死大鼠并于冰臺上迅速取出全腦，剝離海馬，一分為二，液氮凍存。

2.3 指標檢測

2.3.1 曠場實驗 長100 cm×寬100 cm敞箱底部劃分25個面積相等方格。實驗時保證環(huán)境光線昏暗，大鼠適應1.5 min后，記錄大鼠3 min內(nèi)敞箱中活動情況。四爪每次全部經(jīng)過方格則水平活動次數(shù)加1，前兩爪每次騰空或攀附在箱壁上則垂直活動次數(shù)加1。實驗結(jié)束后，分別對各組大鼠在水平和垂直方向上的得分進行統(tǒng)計。

2.3.2 免疫組化檢測 固定好的大鼠全腦沖洗后，采用梯度乙醇脫水，二甲苯透明，浸蠟并包埋形成蠟塊。切片后，脫蠟，水化，并做抗原修復，隨后染色。滴加正常山羊血清封閉液，室溫孵育20 min，甩去多余液體，分別滴加兔抗大鼠GFAP（1∶400）和MAP2抗體（1∶400），4 ℃孵育過夜。PBS洗3次，加入辣根酶標記羊抗兔IgG多聚體，室溫孵育后PBS漂洗。滴加SABC，室溫孵育30 min，PBS洗3次。DAB顯色，蘇木精復染，脫水，透明，封片。采用圖像分析系統(tǒng)采集圖像分析海馬MAP2和GFAP的染色平均光密度值。

2.3.3 Western blot檢測 取大鼠海馬加入預冷的裂解液并于冰上勻漿，4 ℃、12000 r/min離心20 min。測定總蛋白含量，并取等量蛋白質(zhì)電泳分離，分離后移至PVDF膜，封閉2 h，TTBS洗3次×5 min，4 ℃孵育過夜，TTBS洗3次×5 min，加入二抗孵育2 h。采用ECL化學發(fā)光法進行檢測。

2.3.4 RT-PCR檢測 取大鼠海馬按50～100 mg組織/1 mL Trizol加入Trizol，攪碎，靜置；按200 μL氯仿/1 mL Trizol比例加入氯仿，室溫放置5 min；低溫離心15 min取上清液，加入等體積異丙醇，低溫高速離心10 min，吸出上層液；按100 μL 75%乙醇/1 mL Trizol比例加入乙醇，懸浮沉淀，低溫高速離心5 min，棄上清液，重復1次。干燥5 min，10～25 μL RNasin- free H2O溶解得總RNA。反轉(zhuǎn)錄RNA成cDNA，在50 μL cDNA反應液內(nèi)分別加入2 μL引物（BDNF：5'-GAAACCGTCTAGAGCAATATC-3'，5'-GGTGGAA CTGGATGAAGTACTACC-3'，產(chǎn)物長度142 bp；NGF：5'-CTAAACTTCAGCATTCCCTTGAC-3'，5'-CCCAA CACCATCACCTCCTTG-3'，產(chǎn)物長度153 bp；GDNF：5'-ATTTTATTCAAGCCACCATCAAAAGACTG-3'，5'- CAATAAATATCTTCTCTATATCTCTGTATTTG-3'，產(chǎn)物長度163 bp），RT-PCR反應循環(huán)為95 ℃、30 s，95 ℃、5 s，持續(xù)40個循環(huán)和60 ℃、30 s。以β-actin基因（5'-GACTACCTCATGAAGATCCTCAC-3'，5'-CT CCTTGATGTCCCGCACG-3'）作為內(nèi)參，產(chǎn)物長度159 bp。采用2-ΔΔCt方法分析相對基因表達差異。

3 統(tǒng)計學方法

采用SPSS16.0統(tǒng)計軟件進行分析。計量資料以—x±s表示，組間各指標比較采用方差分析、t檢驗和雙側(cè)檢驗。P<0.05表示差異有統(tǒng)計學意義。

4 結(jié)果

4.1 曠場實驗結(jié)果

與正常組比較，模型組大鼠水平和垂直活動次數(shù)顯著減少（P<0.01）；與模型組比較，陽性藥組和左歸降糖解郁方高劑量組大鼠水平和垂直活動次數(shù)顯著增加（P<0.05，P<0.01）。結(jié)果見表1。

4.2 左歸降糖解郁方對模型大鼠膠質(zhì)纖維酸性蛋白和微管相關(guān)蛋白2表達的影響

正常大鼠海馬星形膠質(zhì)細胞胞體和樹突均呈MAP2和GFAP免疫陽性細胞，其胞質(zhì)呈均勻彌漫性染色，形態(tài)呈星形，突起為放射狀或星狀，長短不一。與正常組比較，模型組神經(jīng)元MAP2表達明顯減弱，GFAP表達顯著增加（P<0.01）；與模型組比較，陽性藥組和左歸降糖解郁方高劑量組大鼠海馬MAP2陽性表達顯著增加，GFAP表達顯著降低（P<0.05，P<0.01）。結(jié)果見表2、圖1、圖2。

4.3 左歸降糖解郁方對模型大鼠腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子、膠質(zhì)細胞源性神經(jīng)營養(yǎng)因子和神經(jīng)生長因子蛋白表達的影響

與正常組比較，模型組大鼠海馬BDNF、GDNF、NGF表達顯著降低（P<0.01）；與模型組比較，陽性藥組和左歸降糖解郁方中、高劑量組大鼠海馬BDNF、GDNF、NGF表達顯著升高（P<0.05，P<0.01））。結(jié)果見表3、圖3。

4.4 左歸降糖解郁方對模型大鼠腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子、膠質(zhì)細胞源性神經(jīng)營養(yǎng)因子、神經(jīng)生長因子基因表達的影響

與正常組比較，模型組大鼠海馬BDNF、GDNF、NGF mRNA表達顯著降低（P<0.01）；與模型組比較，左歸降糖解郁方高劑量組和陽性藥組大鼠BDNF、GDNF、NGF mRNA表達顯著升高（P<0.05，P<0.01），左歸降糖解郁方中劑量組BDNF mRNA表達顯著升高（P<0.05）。結(jié)果見表4。

5 討論

左歸丸用于治療糖尿病歷史悠久，課題組結(jié)合糖尿病并發(fā)抑郁癥的現(xiàn)代疾病特點，通過加減配伍，得到左歸降糖解郁方。實驗發(fā)現(xiàn)，其可通過降低海馬中皮質(zhì)酮的含量，保護海馬神經(jīng)元，喚醒負反饋調(diào)節(jié)機制，緩解模型大鼠下丘腦-垂體-腎上腺軸紊亂，進而對糖尿病并發(fā)抑郁癥大鼠實現(xiàn)整體治療[7]。

然而，皮質(zhì)酮不僅損傷海馬神經(jīng)元，同時還會損傷海馬星形膠質(zhì)細胞。糖尿病狀態(tài)下，皮質(zhì)酮含量異常升高可加重其對星形膠質(zhì)細胞的損傷。Moghaddam H K等[8]通過檢測星形膠質(zhì)細胞特異性蛋白GFAP發(fā)現(xiàn)，STZ誘導的糖尿病大鼠海馬星形膠質(zhì)細胞異常增生。星形膠質(zhì)細胞是神經(jīng)元的環(huán)境細胞，其對神經(jīng)元起到支持、穩(wěn)定、營養(yǎng)修復神經(jīng)元等多重作用，同時其還可通過調(diào)節(jié)神經(jīng)細胞內(nèi)、外離子濃度和傳遞第二信使，攝取、滅活和供給神經(jīng)遞質(zhì)等作用參與神經(jīng)元的功能發(fā)揮[9]。因此推測，糖尿病狀態(tài)下，體內(nèi)皮質(zhì)酮水平持續(xù)升高損傷海馬導致抑郁癥的發(fā)生，可能不僅只與神經(jīng)元有關(guān)，更可能通過損傷海馬星形膠質(zhì)細胞，影響神經(jīng)元的內(nèi)環(huán)境，導致神經(jīng)元更加脆弱，損傷亦進一步加重。本實驗以GFAP和MAP2分別作為星形膠質(zhì)細胞和神經(jīng)元細胞的標記物，免疫組化結(jié)果顯示，糖尿病并發(fā)抑郁癥大鼠海馬GFAP表達顯著增加，MAP2表達顯著減少，提示星形膠質(zhì)細胞存在明顯的增生，而海馬神經(jīng)元細胞存在一定程度的損傷。給予左歸降糖解郁方后，模型大鼠GFAP表達減少，MAP2表達增加，星形膠質(zhì)細胞和神經(jīng)元細胞損傷均有所減輕。

神經(jīng)營養(yǎng)是星形膠質(zhì)細胞對神經(jīng)元的多種作用中極為重要的一種。該作用與星形膠質(zhì)細胞的分泌功能密切相關(guān)。閏榮等[10]通過體外實驗發(fā)現(xiàn)，星形膠質(zhì)細胞可通過神經(jīng)營養(yǎng)作用促進神經(jīng)元樣細胞的分化。糖尿病皮質(zhì)酮升高是否可通過損傷海馬星形膠質(zhì)細胞影響其分泌功能，通過改變分泌物的含量影響神經(jīng)元的形態(tài)與功能，產(chǎn)生抑郁癥值得研究。星形膠質(zhì)細胞可分泌BDNF、GDNF、NGF等多種神經(jīng)營養(yǎng)因子。其中，BDNF是神經(jīng)營養(yǎng)因子家庭中的重要成員，其對神經(jīng)元具有分化、增殖、營養(yǎng)、成熟的作用，能增強突觸聯(lián)系，影響神經(jīng)元的可塑性和神經(jīng)遞質(zhì)、神經(jīng)營養(yǎng)因子的合成，且與長時程增強效應及學習記憶功能有關(guān)[11]。GDNF是轉(zhuǎn)化生長因子β超家族的成員之一，主要來源于星形膠質(zhì)細胞，對膽堿能神經(jīng)元、海馬神經(jīng)元存活有營養(yǎng)作用，同時可對抗神經(jīng)元凋亡，參與糖尿病腦病的發(fā)生[12]。而NGF是一類對神經(jīng)元的分化和突起的生長、存活及功能起支持促進作用的蛋白質(zhì)，具有促進神經(jīng)再生和修復的作用[13]。因此，本實驗采用BDNF、GDNF、NGF為代表，研究發(fā)現(xiàn)，糖尿病并發(fā)抑郁癥大鼠海馬中上述指標含量均明顯降低，而給予左歸降糖解郁方后含量均顯著升高。

綜上，本研究結(jié)果表明，左歸降糖解郁方可能通過有效改善模型大鼠海馬星形膠質(zhì)細胞的分泌功能，保證對神經(jīng)元的營養(yǎng)供應，保護神經(jīng)元損傷，進而發(fā)揮抗抑郁的作用。

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（收稿日期：2017-01-20）

（修回日期：2017-02-21；編輯：華強）