禽肉中銅綠假單胞菌的分離及其耐藥性

魏超+代曉航+郭靈安+雷欣宇+劉月悅

摘 要：采用GB 4789.4—2010《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品微生物學(xué)檢驗(yàn) 沙門(mén)氏菌檢驗(yàn)》中的選擇性前增菌方法從鮮鵝肉、鴨肉樣本中檢測(cè)到2 株疑似沙門(mén)氏菌的菌株，但經(jīng)ATB生化鑒定和基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時(shí)間質(zhì)譜（matrix-assisted laser desorption ionization-time of flight-mass spectrometry，MALDI-TOF-MS）鑒定為銅綠假單胞菌。比對(duì)2 株銅綠假單胞菌和沙門(mén)氏菌的生化圖譜，其中鳥(niǎo)氨酸脫羧酶、精氨酸雙水解酶和L-阿拉伯糖的實(shí)驗(yàn)結(jié)果同為陽(yáng)性，其余生化反應(yīng)結(jié)果差異較大；2 株銅綠假單胞菌的質(zhì)譜標(biāo)識(shí)峰足跡與腸炎沙門(mén)氏菌CICC21482有明顯不同。微生物耐藥實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：大部分抗生素對(duì)銅綠假單胞菌無(wú)抑制作用，只有喹諾酮類(lèi)抗生素環(huán)丙沙星、氨基糖苷類(lèi)抗生素慶大霉素和鏈霉素對(duì)其有一定的抑制作用。

關(guān)鍵詞：禽肉；銅綠假單胞菌；沙門(mén)氏菌；生化鑒定；基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時(shí)間質(zhì)譜

Isolation and Drug Resistance of Pseudomonas aeruginosa from Poultry Meat

WEI Chao1，2， DAI Xiaohang1，2， GUO Lingan1，2， LEI Xinyu1， LIU Yueyue1，*

（1.Analysis and Testing Center of Sichuan Academy of Agricultural Sciences， Chengdu 610066， China；

2.Agricultural Products Quality and Safety Risk Assessment Laboratory of Ministry of Agriculture （Chengdu）， Chengdu 610066， China）

Abstract： Two strains of suspected Salmonella spp were detected from fresh goose and duck samples by the selective

pre-enrichment method according to the GB 4789.4?2010. However， the microorganism was identified as Pseudomonas aeruginosa by ATB biochemical identification and matrix-assisted laser desorption-ionization time of flight mass spectrometry （MALDI-TOF-MS）. By analyzing the biochemical profiles of the two Pseudomonas aeruginosa strains and Salmonella spp， we found that the results of ornithine decarboxylase， arginine dihydrolase and L-arabinose tests were identically positive while the other biochemical results varied widely. Besides， the footprints of mass spectrometric peak of Pseudomonas aeruginosa and Salmonella enteritidis were significantly different. Drug resistance results showed that most of the antibiotics examined except ciprofloxacin， gentamicin and streptomycin could not inhibit Pseudomonas aeruginosa.

Key words： poultry meat； Pseudomonas aeruginosa； Salmonella； biochemical identification； matrix-assisted laser desorption-ionization time of flight mass spectrometry （MALDI-TOF-MS）

DOI：10.7506/rlyj1001-8123-201707002

中圖分類(lèi)號(hào)：TS251.1 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A 文章編號(hào)：1001-8123（2017）07-0007-04

引文格式：

魏超， 代曉航， 郭靈安， 等. 禽肉中銅綠假單胞菌的分離及其耐藥性[J]. 肉類(lèi)研究， 2017， 31（7）： 7-10. DOI：10.7506/rlyj1001-8123-201707002. http：//www.rlyj.pub

WEI Chao， DAI Xiaohang， GUO Lingan， et al. Isolation and drug resistance of Pseudomonas aeruginosa from poultry meat[J]. Meat Research， 2017， 31（7）： 7-10. DOI：10.7506/rlyj1001-8123-201707002. http：//www.rlyj.pub

銅綠假單胞菌（Pseudomonas aeruginosa）是革蘭氏陰性菌，專(zhuān)性需氧，菌體長(zhǎng)短不一，成對(duì)或呈短鏈狀排列，單鞭毛、無(wú)芽胞、無(wú)莢膜，在普通培養(yǎng)基上可以產(chǎn)生水溶性色素，如綠膿素（pyocynin）等，是一種常見(jiàn)的條件致病菌[1]。銅綠假單胞菌的生長(zhǎng)溫度范圍為25～42 ℃，該菌具有4 ℃不生長(zhǎng)而在42 ℃可以生長(zhǎng)的特點(diǎn)[2]。銅綠假單胞菌是醫(yī)院的主要污染菌，感染可發(fā)生于很多解剖部位，包括皮膚、骨、耳、眼、尿路和心臟瓣膜等，感染部位與細(xì)菌的感染程度及病人的易感性endprint

有關(guān)[3-6]。銅綠假單胞菌極易產(chǎn)生耐藥性，廣譜抗生素、激素以及免疫抑制劑的廣泛使用簇生銅綠假單胞菌進(jìn)化出多種耐藥菌株[7-14]。沙門(mén)氏菌（Salmonella）是公共衛(wèi)生學(xué)上具有重要意義的引發(fā)人畜共患病的致病菌之一，易引起食物中毒，導(dǎo)致胃腸炎、傷寒和副傷寒，是常見(jiàn)的腸道致病菌[15-16]。禽肉易受致病菌感染，其中沙門(mén)氏菌為檢出率較高的腸道致病菌[17-22]?；|(zhì)輔助激光解吸電離飛行時(shí)間質(zhì)譜（matrix-assisted laser desorption ionization-time of flight-mass spectrometry，MALDI-TOF-MS）是基于微生物外周蛋白和核糖體蛋白的特異性獲得蛋白質(zhì)指紋圖譜，并與數(shù)據(jù)庫(kù)中的特征峰比對(duì)從而進(jìn)行微生物鑒定的方法，可以用于研究微生物蛋白質(zhì)水平的差異性[23-24]。本研究采用

GB 4789.4—2010《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品微生物學(xué)檢驗(yàn) 沙門(mén)氏菌檢驗(yàn)》[25]中的選擇性前增菌方法，在鴨肉、鵝肉中分別檢測(cè)出2 株疑似沙門(mén)氏菌但經(jīng)鑒定為銅綠假單胞菌的菌株，并對(duì)此2 株銅綠假單胞菌進(jìn)行生化鑒定和質(zhì)譜分析，為銅綠假單胞菌檢測(cè)方法的開(kāi)發(fā)提供理論支持。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

新鮮鵝肉、鴨肉，均為市售。

血平板培養(yǎng)基 廣州博賽生物科技有限公司；沙門(mén)氏菌顯色培養(yǎng)基（chromogenic Salmonella agar，CHR） 上海中欣生物科技有限公司；緩沖蛋白胨水（buffered peptone water，BPW）、氯化鎂-孔雀綠增菌液（tetrathionate broth base，TTB）、營(yíng)養(yǎng)瓊脂 廣州環(huán)凱生物技術(shù)有限公司；ATB試劑條ID32E 法國(guó)梅里埃公司；乙腈、乙醇（色譜純） 美國(guó)Fisher Scientific公司；甲酸（色譜純） 美國(guó)Tedia公司；α-氰-4-羥基肉桂酸（α-cyano-4-hydroxycinnamic acid，α-CHCA）（色譜純） 美國(guó)Sigma公司；氯霉素、羅紅霉素、復(fù)方新諾明、鏈霉素、慶大霉素、環(huán)丙沙星、土霉素、卡那霉素、青霉素、氯霉素 英國(guó)Oxoid公司。

1.2 儀器與設(shè)備

ATB細(xì)菌鑒定儀 法國(guó)生物梅里埃公司；基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時(shí)間質(zhì)譜儀 日本島津公司；YM75Z高壓滅菌鍋 上海三申儀器設(shè)備有限公司；

HF-safe-1200生物安全柜 上海立申儀器設(shè)備有限公司。

1.3 方法

1.3.1 菌株分離與生化鑒定

參考GB 4789.4—2010《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品微生物學(xué)檢驗(yàn) 沙門(mén)氏菌檢驗(yàn)》[25]中的沙門(mén)氏菌檢測(cè)方法，稱(chēng)取25 g禽肉肌肉纖維中間部分樣品于無(wú)菌均質(zhì)袋中，加入225 g BPW浸泡2 min后均質(zhì)，（36±1） ℃培養(yǎng)18 h；取增菌液1 mL接種至9 mL TTB中，（42±1） ℃增菌培養(yǎng)24 h，取1 μL TTB增菌液接種到CHR培養(yǎng)基中，（36±1） ℃增菌培養(yǎng)24 h。

選取CHR培養(yǎng)基上光滑、濕潤(rùn)、呈紫紅色的陽(yáng)性菌落，采用血平板進(jìn)行2 次經(jīng)典純化，挑取血平板上的單菌落至生理鹽水比濁管中，調(diào)至0.5 麥?zhǔn)蠞岫?，用移液器移?5 μL至ID32E試劑條樣杯中，36 ℃培養(yǎng)24 h后由ATB系統(tǒng)讀出鑒定結(jié)果。

1.3.2 菌株的質(zhì)譜鑒定及比對(duì)

選取血平板上的菌落，挑取適量，加入75%的乙醇水溶液，振蕩1 min，4 000 r/min條件下離心1 min，去上清液，加入0.75 mL 75%的乙酸水溶液，振蕩1 min，加入0.75 mL乙腈，振蕩混勻，4 000 r/min條件下離心1 min，取1 μL點(diǎn)至靶板，加入1 μL基質(zhì)α-CHCA，晾干。

質(zhì)譜條件：正離子模式；能量：75 Hz；質(zhì)荷比（m/z）范圍：2 000～20 000；將每個(gè)樣品的200 個(gè)收集峰疊加。

1.3.3 抗生素抑菌實(shí)驗(yàn)

移取1.3.1節(jié)中的0.5 麥?zhǔn)蠞岫染?0 μL于空白培養(yǎng)皿中，傾注45～50 ℃的營(yíng)養(yǎng)瓊脂，振蕩混勻，待帶菌培養(yǎng)基凝固，將藥敏紙片貼于培養(yǎng)基表面，每皿4 片，36 ℃培養(yǎng)24 h，觀(guān)察并計(jì)算結(jié)果。

1.4 數(shù)據(jù)處理

將獲得的微生物蛋白圖譜在Myla數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行比對(duì)，獲得鑒定結(jié)果，采用SARAMIS Premium軟件的Maches in graphical view程序進(jìn)行標(biāo)記峰足跡圖繪制。

2 結(jié)果與分析

2.1 菌株的生化鑒定

鑒定百分率（ID）是根據(jù)被鑒定菌株的生化反應(yīng)模式得出的菌株屬于數(shù)據(jù)庫(kù)中哪一分類(lèi)單位的鑒定結(jié)果的可信度，其值越大，結(jié)果的可信度越高；T值表示菌株的生化反應(yīng)結(jié)果與該菌最典型生化圖譜的接近程度，二者能夠給予微生物鑒定結(jié)果可信性評(píng)價(jià)。用1.3.1節(jié)的分離與純化方法在鵝肉和鴨肉樣品中分別分離、純化得到2 株在沙門(mén)氏菌選擇性培養(yǎng)基上表現(xiàn)為陽(yáng)性的菌株，但經(jīng)生化鑒定，2 株菌均為銅綠假單胞菌，分別為銅綠假單胞菌1

（ID=99.7%，T=0.43）和銅綠假單胞菌2（ID=95.3%，T=0.36）。由表1可知，沙門(mén)氏菌的生化反應(yīng)結(jié)果與分離得到的2 株銅綠假單胞菌有很大差異，只有鳥(niǎo)氨酸脫羧酶、精氨酸雙水解酶和L-阿拉伯糖同時(shí)表現(xiàn)為陽(yáng)性，沙門(mén)氏菌在賴(lài)氨酸脫羧酶、酚紅等實(shí)驗(yàn)反應(yīng)中更多表現(xiàn)為陽(yáng)性。

2.2 質(zhì)譜鑒定與比對(duì)

由圖1可知，MALDI-TOF-MS可有效鑒定2 株銅綠假單胞菌，但由圖2的蛋白標(biāo)志峰足跡圖（圖2中的足跡點(diǎn)均對(duì)應(yīng)圖1中的蛋白質(zhì)標(biāo)識(shí)峰（包含小于0.08的相對(duì)偏差））可知，分離得到的銅綠假單胞菌與沙門(mén)氏菌在質(zhì)荷比10 000內(nèi)相交的共同標(biāo)識(shí)峰足跡較多，但在質(zhì)荷比10 000以后共同標(biāo)識(shí)峰的足跡差異較明顯，表明銅綠假單胞菌和沙門(mén)氏菌雖然有一定的相似性，但總體差異明顯。endprint

2.3 菌株耐藥性分析

本研究采用9 種抗生素進(jìn)行耐藥性實(shí)驗(yàn)，其中包括7 種不同類(lèi)型的抗生素，分別為大環(huán)內(nèi)酯類(lèi)、磺胺類(lèi)、氯霉素類(lèi)、四環(huán)素類(lèi)、β-內(nèi)酰胺類(lèi)、喹諾酮類(lèi)、氨基糖苷類(lèi)，其中卡那霉素、鏈霉素、慶大霉素均為氨基糖苷類(lèi)抗生素，7 類(lèi)抗生素均為畜禽養(yǎng)殖中的常見(jiàn)抗生素[26-31]。由表3可知，大部分抗生素對(duì)2 種銅綠假單胞菌均無(wú)抑制作用，僅有2 種類(lèi)型的3 種抗生素具有一定的抑制作用，分別為喹諾酮類(lèi)抗生素環(huán)丙沙星以及氨基糖苷類(lèi)抗生素慶大霉素和鏈霉素。

3 討 論

3.1 檢測(cè)方法分析

本研究用標(biāo)準(zhǔn)沙門(mén)氏菌的前增菌方法對(duì)鴨肉和鵝肉樣本進(jìn)行檢測(cè)，在顯色培養(yǎng)基中分離的疑似沙門(mén)氏菌菌株經(jīng)鑒定均為銅綠假單胞菌，綜合分析沙門(mén)氏菌的前增菌部分，其中BPW為弱營(yíng)養(yǎng)廣泛增菌液，對(duì)營(yíng)養(yǎng)要求不高的銅綠假單胞菌可以在其中實(shí)現(xiàn)擴(kuò)增，氯化鎂-孔雀綠培養(yǎng)基能夠增加滲透壓，孔雀綠有一定的抑制非沙門(mén)氏菌菌株的效果[32]，在42 ℃條件下可以抑制大多數(shù)細(xì)菌的生長(zhǎng)，但銅綠假單胞菌也具有42 ℃可生長(zhǎng)的特性；在沙門(mén)氏菌顯色培養(yǎng)基上，銅綠假單胞菌也表現(xiàn)為陽(yáng)性菌落，可能其代謝產(chǎn)物與沙門(mén)氏菌有一定的相似性，但其后的32 個(gè)生化反應(yīng)中，銅綠假單胞菌與沙門(mén)氏菌的反應(yīng)結(jié)果表現(xiàn)出明顯的不同，對(duì)其蛋白質(zhì)的質(zhì)譜圖進(jìn)行分析也可以看到明顯的差異，因此對(duì)銅綠假單胞菌的快速特異性檢測(cè)可以參考沙門(mén)氏菌增菌的部分方法，并添加針對(duì)銅綠假單胞菌特異性生化特點(diǎn)設(shè)計(jì)的選擇培養(yǎng)基。

3.2 禽肉中微生物的控制

銅綠假單胞菌雖然為條件致病微生物，但其耐抗生素特性使得在肉制品中很難被去除，其對(duì)生長(zhǎng)環(huán)境的營(yíng)養(yǎng)要求不高且很容易在肉制品中占據(jù)主要生態(tài)位。本研究采用沙門(mén)氏菌選擇性增菌方法檢測(cè)出疑似沙門(mén)氏菌、但經(jīng)鑒定為銅綠假單胞菌的菌株，表明即使樣品中有致病微生物存在也可能因其弱生態(tài)位而不能被檢測(cè)出，因此存在風(fēng)險(xiǎn)和隱患。應(yīng)建立更加精細(xì)、準(zhǔn)確的實(shí)驗(yàn)方法，在肉制品中針對(duì)性地檢測(cè)、鑒定致病微生物，保證食品安全。

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