酸奶中6種合成甜味劑的測(cè)定方法

王成華，宋蘇，王卉，范廣宇，孟祥龍，姚燕林

（連云港出入境檢驗(yàn)檢疫局，江蘇連云港222042）

酸奶中6種合成甜味劑的測(cè)定方法

王成華，宋蘇，王卉，范廣宇*，孟祥龍，姚燕林

（連云港出入境檢驗(yàn)檢疫局，江蘇連云港222042）

建立液相色譜-質(zhì)譜/質(zhì)譜法（liquid chromatography-mass spectrometry/mass spectrometry，LC-MS/MS）同時(shí)測(cè)定酸奶中安賽蜜、甜蜜素、阿斯巴甜、阿力甜、紐甜、糖精鈉的分析方法。樣品經(jīng)甲酸-三乙胺緩沖溶液提取后，加入亞鐵氰化鉀和乙酸鋅沉淀析出蛋白質(zhì)，經(jīng)HLB固相萃取小柱凈化后，再通過(guò)Phenomenex XB-C18色譜柱分離，以含0.1%（體積分?jǐn)?shù)）的甲酸溶液和甲醇為流動(dòng)相，進(jìn)行梯度洗脫，可以在3 min內(nèi)完成6種人工合成甜味劑的基線分離。在ESI負(fù)離子模式下，采用多反應(yīng)監(jiān)測(cè)模式進(jìn)行測(cè)定，在加標(biāo)水平為10、25、50 μg/kg時(shí)，被測(cè)物的回收率達(dá)到70.50%～102.10%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為1.56%～4.83%。該方法可用于酸奶及其他乳酸菌飲品中合成甜味劑的測(cè)定。

酸奶；液相色譜-質(zhì)譜/質(zhì)譜法；安賽蜜；甜蜜素；阿斯巴甜；阿力甜；紐甜；糖精鈉

酸奶是以牛奶為原料，經(jīng)過(guò)巴氏殺菌后再向牛奶中添加發(fā)酵劑，經(jīng)發(fā)酵后，再冷卻灌裝的一種牛奶制品。酸奶不但保留了牛奶的所有優(yōu)點(diǎn)，而且某些方面經(jīng)加工過(guò)程還揚(yáng)長(zhǎng)避短。其主要功效為降血壓，瘦身，促消化，防止便秘，成為更加適合于人類的營(yíng)養(yǎng)保健品。為了迎合人們的口味，生產(chǎn)商們往往添加一種或幾種甜味劑來(lái)達(dá)到酸甜的口感[3]。隨著消費(fèi)和認(rèn)識(shí)水平的提高，甜味劑的使用情況越來(lái)越受到人們的關(guān)注[1]。其中，安賽蜜、甜蜜素、阿斯巴甜、阿力甜、紐甜、糖精鈉6種合成的甜味劑更是受到添加劑行業(yè)的青睞。

關(guān)于甜味劑檢測(cè)的標(biāo)準(zhǔn)，均是針對(duì)某個(gè)和某幾個(gè)甜味劑的檢測(cè)，主要采用氣相色譜法和高效液相色譜法[4-5]。目前在食品生產(chǎn)加工過(guò)程中，同時(shí)使用多種甜味劑，定量檢測(cè)這些甜味劑不僅是為了保證產(chǎn)品的質(zhì)量，更重要的是保護(hù)消費(fèi)者的利益。因此，建立一種能同時(shí)測(cè)定這些甜味劑的方法就顯得十分重要。對(duì)于食品中多組分甜味劑的分析，不可避免會(huì)遇到以下問(wèn)題：（1）由于色譜的分辨能力有限，當(dāng)樣品中組分過(guò)多時(shí)，色譜手段很難將所有的組分分離；（2）相鄰的色譜峰，當(dāng)保留時(shí)間相近時(shí)，僅靠保留時(shí)間對(duì)組分定性既不準(zhǔn)確也不充分；（3）對(duì)于復(fù)雜基質(zhì)的樣品，基質(zhì)的干擾僅靠紫外檢測(cè)器很難進(jìn)行排除。本試驗(yàn)采用LCMS/MS技術(shù)，利用串聯(lián)質(zhì)譜分離能力強(qiáng)，MRM定性準(zhǔn)確、選擇性和靈敏度高的特點(diǎn)，能在較短的時(shí)間內(nèi)對(duì)多組分進(jìn)行一次性的分離和鑒定，建立一種可同時(shí)測(cè)定并能夠準(zhǔn)確定性食品中多種甜味劑的方法[6]。

1 試驗(yàn)部分

1.1 儀器與試劑

Agilent1290-6490液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀：美國(guó)Agilent公司；THZ-92A型振蕩器：艾卡儀器設(shè)備有限公司；XW-80A型旋渦混合器：上海青浦滬西儀器制造廠；TDL-40C臺(tái)式離心機(jī)：上海安亭儀器廠；N-EVP 112氮?dú)獯蹈蓛x：上海秉越電子儀器有限公司；VISZPREP固相萃取裝置：美國(guó)Supelco公司。甲醇（HPLC純）：德國(guó)默克股份有限公司；三氯甲烷（氯仿）、三乙胺：南京化學(xué)試劑有限公司；甲酸、亞鐵氰化鉀、乙酸鋅：國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；Waters oasis HLB萃取柱（6 mL）：天津市天興達(dá)科技有限公司；水為符合GB/T 6682-2008《分析實(shí)驗(yàn)室用水國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)》規(guī)定的一級(jí)水。

甜蜜素、安賽蜜、阿斯巴甜、糖精鈉：純度大于95.0%，德國(guó)Dr.Ehrenstorfe標(biāo)準(zhǔn)品有限公司。阿力甜和紐甜：純度大于95%，北京曼哈格生物科技有限公司。準(zhǔn)確稱取該標(biāo)準(zhǔn)品，用空白樣品基質(zhì)配制成適當(dāng)濃度的混合標(biāo)準(zhǔn)工作液，使用前配制。

1.2 儀器工作條件

色譜柱：PhenomenexC18柱（50mm×2.1mm，2.6μm）；流動(dòng)相：A為0.1%（體積分?jǐn)?shù)，下同）甲酸，B為甲醇；流速：0.4 mL/min；柱溫：35 ℃；進(jìn)樣量：5 μL。流動(dòng)相的洗脫程序見(jiàn)表1。

表1 流動(dòng)相的洗脫程序Table 1 The mobile phase elution program

1.3 質(zhì)譜條件

離子源：ESI；掃描方式：負(fù)離子掃描；檢測(cè)方式：多反應(yīng)監(jiān)測(cè)掃描模式（MRM）。干燥氣溫度：290℃；干燥氣流速：14 L/min；碰撞氣壓力：20 Pa；鞘氣溫度：250℃；鞘氣流速：11 L/min；毛細(xì)管電壓：-4 500 V。其他質(zhì)譜參數(shù)見(jiàn)表2。

表2 6種合成甜味劑的質(zhì)譜參數(shù)和保留時(shí)間Table 2 Mass spectrum parameters and retention time 6 kinds of synthetic sweeteners

1.4 樣品前處理

1.4.1 樣品的提取

稱取2 g酸奶樣品于50 mL離心管中，加入10 mL甲酸-三乙胺緩沖溶液，渦旋混勻，超聲30 min后取出，加入5 mL的10%的亞鐵氰化鉀和20%的乙酸鋅溶液以及5 mL的三氯甲烷，渦旋混勻以3 500 r/min的速度離心5 min，取上層清夜轉(zhuǎn)移至另一只50 mL的離心管中，在殘?jiān)屑尤?0 mL的提取液重復(fù)以上提取過(guò)程，待凈化。

1.4.2 樣品的萃取

依次用5 mL甲醇、5 mL水活化HLB固相萃取柱，棄淋洗液，將上清液過(guò)柱子，棄流出液。然后用5 mL水淋洗，棄去淋洗液，抽干。用9 mL的甲醇洗脫，收集洗脫液至離心管中，在35℃下氮吹濃縮至0.5 mL，并用甲醇-水（3∶7，體積比）定容至 1 mL，過(guò) 0.22 μm 有機(jī)濾膜，供液相色譜-質(zhì)譜/質(zhì)譜儀測(cè)定。

2 結(jié)果與討論

2.1 提取液的選擇

研究表明6種甜味劑都是水溶性的[7]，本試驗(yàn)比較了0.1%甲酸溶液、0.08%的甲酸溶液、水3種水相提取劑。結(jié)果表明0.08%甲酸溶液優(yōu)于0.1%甲酸溶液和水，由于高pH值會(huì)影響阿斯巴甜的穩(wěn)定性，故加入三乙胺來(lái)調(diào)節(jié)提取劑的pH值，當(dāng)三乙胺為2.5 mL，pH=4.5時(shí)阿斯巴甜的回收比較理想。

2.2 流動(dòng)相條件的優(yōu)化

通過(guò)對(duì)SN/T 3538-2013《出口食品中六種合成甜味劑的檢測(cè)方法 液相色譜-質(zhì)譜/質(zhì)譜法》的檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行比較[8]，先對(duì)流動(dòng)相條件進(jìn)行摸索，流動(dòng)相水相嘗試了水、0.1%乙酸銨溶液和0.1%甲酸溶液，有機(jī)相嘗試了甲醇和乙腈。采用0.1%乙酸銨溶液作為水相，無(wú)論有機(jī)相是甲醇還是乙腈，甜蜜素、糖精鈉、安賽蜜的質(zhì)譜響應(yīng)都很低，這可能是由于在負(fù)離子掃描模式下加入乙酸銨會(huì)抑制目標(biāo)化合物的離子化效率，無(wú)論有機(jī)相是甲醇還是乙腈，相對(duì)于水，采用0.1%甲酸溶液可以獲得更好的質(zhì)譜響應(yīng)和峰型效果。流動(dòng)相的選擇不僅要考慮對(duì)組分的洗脫能力，而且還需考慮在質(zhì)譜中是否能促使目標(biāo)化合物達(dá)到較高的離子化效率。因此又考察了乙腈-0.1%甲酸溶液體系和甲醇-0.1%甲酸溶液體系，相比之下，甲醇-0.1%甲酸溶液體系可以獲得更好的質(zhì)譜響應(yīng)。

2.3 質(zhì)譜檢測(cè)及色譜分離條件的優(yōu)化

先對(duì)6種人工合成甜味劑分別在全掃描模式下進(jìn)行掃描，分別確定6種準(zhǔn)分子離子。從6種人工合成甜味劑的分子結(jié)構(gòu)看，電噴霧離子源中易失去一個(gè)氫原子而帶負(fù)電荷，且負(fù)離子模式下準(zhǔn)分子離子峰強(qiáng)度高于正離子模式，即負(fù)離子模式下的靈敏度高于正離子模式，因此選擇電噴霧離子源負(fù)離子模式對(duì)其進(jìn)行檢測(cè)。6種人工合成甜味劑的總離子流圖譜見(jiàn)圖1。

圖1 6種合成甜味劑標(biāo)準(zhǔn)溶液總離子圖（10 μg/kg）Fig.1 Total ion chromatogram of 6 kinds of synthetic sweeteners（10 μg/kg）

2.4 線性關(guān)系及標(biāo)準(zhǔn)曲線

以空白的酸奶樣品為基質(zhì)制成基質(zhì)空白標(biāo)準(zhǔn)溶液，再將6種人工合成甜味劑制成相應(yīng)質(zhì)量濃度的系列標(biāo)準(zhǔn)溶液，以6種人工合成甜味劑的峰面積作為縱坐標(biāo)，目標(biāo)物的線性方程、相關(guān)系數(shù)、線性范圍和檢出限見(jiàn)表3。

表3 目標(biāo)物的線性方程、相關(guān)系數(shù)、線性范圍和檢出限Table 3 The target of linear equation，correlation coefficient，linear range and detection limit

2.5 精密度及回收率驗(yàn)證

加標(biāo)濃度分別為0.10、0.25、0.50 mg/kg的回收率試驗(yàn)，每份樣品分別測(cè)定6次，結(jié)果見(jiàn)表4。

從結(jié)果可知，其平均回收率在70.50%～102.10%之間，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）為1.56%～4.83%。

表4 6種合成甜味劑的回收率及標(biāo)準(zhǔn)偏差Table 4 The recovery rate and standard deviation for 6 kinds of synthetic sweeteners

3 結(jié)論

本研究通過(guò)優(yōu)化流動(dòng)相條件、質(zhì)譜和色譜條件，建立了同時(shí)測(cè)定6種合成甜味劑的液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法。該方法不僅實(shí)現(xiàn)了食品中多種合成甜味劑的同時(shí)測(cè)定，提高了檢測(cè)效率，同時(shí)結(jié)果準(zhǔn)確，靈敏度高，耗時(shí)短，能夠有效的避免利用液相色譜法測(cè)定對(duì)復(fù)雜基質(zhì)樣品出現(xiàn)的假陽(yáng)結(jié)果。該方法能夠滿足SN/T 3538-2013《出口食品中六種合成甜味劑的檢測(cè)方法液相色譜-質(zhì)譜/質(zhì)譜法》對(duì)以上6種合成甜味劑的規(guī)定使用量檢測(cè)要求，為甜味劑檢測(cè)提供一種高效、快捷、準(zhǔn)確的檢測(cè)方法。利用液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)建立多組分的甜味劑同時(shí)測(cè)定的方法將成為將來(lái)食品安全檢測(cè)技術(shù)的發(fā)展方向之一。

[1] 劉曉霞,丁利,劉錦霞,等.高效液相色譜一串聯(lián)質(zhì)譜法測(cè)定食品中6種人工合成甜味劑[J].色譜,2010,28(11):1020-1025

[2] 峰恩,楊國(guó)生,譚璐,等.色譜分析法檢測(cè)人工合成甜味劑研究進(jìn)展[J].山東農(nóng)業(yè)科學(xué),2011(12):1205-1210

[3] 吳婕,楊柳.高效液相色譜法同時(shí)測(cè)定食品中防腐劑、甜味劑和色素[J].化學(xué)工程與裝備,2010(10):910-914

[4] 譚朝勤,吳新.高效液相色譜法同時(shí)測(cè)定面包糕點(diǎn)中苯甲酸(鈉)、山梨酸(鉀)、安賽蜜、糖精鈉和脫氫乙酸(鈉)的含量[J].廣東化工,2009(6):458-462

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The Inspection Method of Six Kinds of Synthetic Sweeteners in Yogurt

WANG Cheng-hua，SONG Su，WANG Hui，F(xiàn)AN Guang-yu*，MENG Xiang-long，YAO Yan-lin
（Lianyungang Entry-exit Inspection and Quarantine Bureau，Lianyungang 222042，Jiangsu，China）

Set up a method of liquid chromatography-mass spectrometry/mass spectrometry （LC-MS/MS）to detect the acesulfame，cyclamate，aspartame，alitame，neotame，saccharin sodium in yogurt.The sample was extracted by formic acid-triethylamine buffer solution.Add some potassium ferrocyanide and zinc acetate then the protein will be precipitated，purified by HLB solid-phase，through Phenomenex XB-C18 chromatographic column for separation，with 0.1%（volume fraction）formic acid and methanol as mobile phase，then the separation of these 6 kinds of synthetic sweeteners within 3 minutes by gradient elution.In the negative ion mode，measured with the multiple reaction mode，when the external standard level with 10，25，50 μg/kg，the recovery rate can be 70.50%-102.10%，and the relative standard deviation can be 1.56%-4.83%.This method is fast，accurate and high sensitivity.It can be used in the determination of synthetic sweeteners in yogurt and other lactic acid bacteria beverage.

yogurt；liquid chromatography-mass spectrometry/mass spectrometry；acesulfame；cyclamate；aspartame；alitame；neotame；saccharin sodium

2016-12-28

10.3969/j.issn.1005-6521.2017.18.033

王成華（1987—），女（漢），學(xué)士，主要從事進(jìn)出口食品中獸藥殘留及食品添加劑的檢測(cè)工作。

*通信作者