地皮菜多糖的分離純化及結(jié)構(gòu)組成分析

張雅雯，李海平，孟麗青，王迎進(jìn)

（忻州師范學(xué)院化學(xué)系，山西忻州034000）

地皮菜多糖的分離純化及結(jié)構(gòu)組成分析

張雅雯，李海平，孟麗青，王迎進(jìn)*

（忻州師范學(xué)院化學(xué)系，山西忻州034000）

以地皮菜為原料，采用水提醇沉法獲得地皮菜多糖（Nostoc Commune polysaccharides，NCP），經(jīng)Sevage法脫蛋白、DEAE-Sepharose CL-6B柱色譜法分離純化、透析、凍干等制備地皮菜精制多糖。利用紫外和紅外光譜對其進(jìn)行純度及結(jié)構(gòu)分析，采用1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮柱前衍生HPLC法測定其單糖組成及含量。結(jié)果表明：地皮菜多糖經(jīng)DEAE-Sepharose CL-6B柱色譜分離可得到5種多糖組分，其主要組分NCP-3具有典型的多糖吸收峰。HPLC分析表明NCP-3主要由甘露糖、葡萄糖醛酸、葡萄糖、阿拉伯糖構(gòu)成，其摩爾比為2.17∶7.14∶2.56∶1。

地皮菜，多糖；分離；結(jié)構(gòu)表征；單糖

地皮菜（Nostoc Commune）又稱地木耳、地軟、地耳、地衣等，為念珠藻屬植物[1-2]。地皮菜在我國各地幾乎都有分布，資源極其豐富[3]。地皮菜含有豐富的蛋白質(zhì)、多糖、維生素以及鈣、鐵、磷等，具有清熱解毒、明目益氣、補腎等功效[4]。已有研究表明多糖類成分作為地皮菜主要營養(yǎng)活性成分之一，具有明顯的抗氧化、抑菌及保濕等作用[5]。因而有關(guān)地皮菜多糖的提取純化、結(jié)構(gòu)性質(zhì)和藥理作用的研究受到國內(nèi)外學(xué)者的廣泛關(guān)注[6]。目前，有關(guān)地皮菜多糖提取的研究不少[6]，但對地皮菜多糖的分離、純化、結(jié)構(gòu)組成分析研究報道很少[7]，且不夠系統(tǒng)。為此，本文采用水提醇沉法獲得地皮菜粗多糖，經(jīng)Sevage法脫蛋白，DEAE-Sepharose CL-6B柱色譜分離得到5種多糖組分（NCP-1、NCP-2、NCP-3、NCP-4 和 NCP-5），然后重點對主要組分NCP-3進(jìn)行純度、結(jié)構(gòu)及單糖組成分析，旨在為地皮菜多糖的開發(fā)利用和進(jìn)一步研究提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

地皮菜：山西省五臺縣五臺山；DEAE-Sepharose CL-6B：北京索萊寶科技有限公司；1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮（PMP）：國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；鼠李糖（Rha，HPLC檢測含量≥99%）：北京化學(xué)試劑公司；葡萄糖醛酸（GlcUA，含量≥98%）：西亞試劑公司；半乳糖醛酸（GalUA，含量≥97%）、葡萄糖（Glc，HPLC 檢測含量≥99%）、甘露糖（Man，含量≥98%）、半乳糖（Gal，HPLC檢測含量≥99.5%）、阿拉伯糖（Ara，含量≥98%）：南京都萊生物技術(shù)有限公司；乙腈為色譜純；水為超純水，其它試劑均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

LC-20AT高效液相色譜儀、SPD-20A紫外檢測器、FTIR 8400紅外光譜儀、UV-2550紫外可見分光光度計：日本島津；N-2000色譜工作站：浙江大學(xué)；BS-100A自動部分收集器：上海精密儀器有限公司；LGJ-10多歧管普通型冷凍干燥機(jī)：河南兄弟儀器設(shè)備有限公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 地皮菜多糖的提取

地皮菜70℃干燥4 h，粉碎，過60目篩，稱取地皮菜粉末100 g，95%乙醇600 mL攪拌回流2 h，抽濾，揮干。用石油醚（沸程60℃～90℃）600 mL攪拌回流2 h，抽濾，干燥得地皮菜藥渣。稱取地皮菜藥渣50 g，以20倍量的蒸餾水在溫度70℃下超聲提取45 min，過濾，濾渣重提2次，合并濾液，減壓濃縮。Sevage法脫蛋白、醇沉、過濾、洗滌、冷凍干燥得地皮菜粗多糖。

1.3.2 地皮菜多糖的分離純化[8]

DEAE-Sepharose CL-6B層析柱（2.5 cm×60 cm）先用超純水平衡，稱取地皮菜粗多糖0.100 g，少量水溶解，上柱，依次用 H2O、0.1、0.3、0.5、1 mol/L 的 NaCl溶液各250 mL洗脫，流速為1 mL/min，自動收集器收集每管10 mL。以硫酸-苯酚法跟蹤檢測，以管號為橫坐標(biāo)，吸光度為縱坐標(biāo)繪制洗脫曲線。由洗脫曲線可知，地皮菜粗多糖經(jīng)DEAE-Sepharose CL-6B層析后，可得 5個組分，分別命名為 NCP-1、NCP-2、NCP-3、NCP-4和NCP-5，其中NCP-3組分含量遠(yuǎn)高于其它4個組分，故選取NCP-3作為主要分析對象。按峰形合并NCP-3組分峰洗脫液，超純水透析48 h，濃縮，醇沉，離心，凍干。

1.3.3 NCP-3的紫外、紅外光譜測定[10]

將NCP-3溶液配成質(zhì)量濃度為0.1 mg/mL的溶液，在波長200 nm～400 nm范圍內(nèi)進(jìn)行紫外光譜掃描。將NCP-3與KBr混合、研細(xì)壓片，在400cm-1～4000cm-1范圍內(nèi)進(jìn)行紅外光譜掃描。

1.3.4 NCP-3的單糖組成

1.3.4.1 對照品溶液的制備

準(zhǔn)確取甘露糖、鼠李糖、葡萄糖醛酸、半乳糖醛酸各0.025 g、葡萄糖0.050 g、半乳糖0.030 g、阿拉伯糖0.030 g，用超純水溶解定容到10 mL容量瓶中，搖勻。

1.3.4.2 NCP-3的水解

取NCP-3溶液5 mL于比色管中，加0.1 mL濃硫酸，充N2密封，120℃水解4 h，NaOH溶液中和，離心5 min得上清液。

1.3.4.3 對照品及NCP-3水解產(chǎn)物的衍生化標(biāo)記

分別取對照品溶液和NCP-3水解產(chǎn)物各0.50 mL于5 mL離心管中，加入0.25 mol/LNaOH溶液0.5 mL，渦旋混勻。加入0.25 mol/L PMP甲醇溶液0.5 mL，混勻。70℃水浴反應(yīng)70 min，冷水浴10 min，加0.25 mol/L HCl 0.5 mL中和，渦旋2 min，加1 mL氯仿萃取3次，將水相用0.45 μm微孔膜過濾后HPLC進(jìn)樣分析[11]。

1.3.4.4 色譜條件

色譜柱：Krmasil C18（4.6 mm×250 mm，5 μm）；柱溫：35℃，流動相：20 mmol/L磷酸鹽緩沖溶液（pH6.72）-乙腈（體積比為 78 ∶22）；流速：1.0 mL/min；檢測波長：250 nm。

2 結(jié)果與分析

2.1 地皮菜多糖的分離純化

地皮菜多糖經(jīng)DEAE-Sepharose CL-6B柱層析得洗脫曲線如圖1所示。

圖1 地皮菜多糖的DEAE-Sepharose CL-6B柱色譜分離Fig.1 Elution curve of NCP on DEAE-Sepharose CL-6B column

峰NCP-1為超純水洗脫得到，峰NCP-2、NCP-3、NCP-4和NCP-5為NaCl溶液洗脫得到。其中NCP-3組分峰由0.3 mol/LNaCl洗脫得到，為地皮菜多糖的主要成分。經(jīng)透析、醇沉、凍干得地皮菜精制多糖NCP-3。

2.2 NCP-3的紫外、紅外光譜分析

圖2-a為NCP-3的紫外光譜圖，圖2-b為NCP-3的紅外光譜圖。

圖2 NCP-3的紫外光譜和紅外光譜Fig.2 UVabsorptionspectrum（a）andRspectrum（b）ofNCP-3

由圖2-a可以看出NCP-3的紫外光譜吸收曲線平滑，在波長260、280 nm附近無明顯的吸收峰，說明NCP-3的純度較高，不含核酸和蛋白質(zhì)。由葡萄糖對照溶液制作標(biāo)準(zhǔn)曲線方程計算得其總多糖純度達(dá)97.88%。由圖2-b可知，NCP-3組分具有多糖典型的特征吸收峰。在3 600 cm-1～3 200 cm-1出現(xiàn)的強而寬的峰為糖類物質(zhì)O-H的伸縮振動[12]，2 914.20 cm-1為烷基的C-H的伸縮振動，1 650.52 cm-1是羧基的C=O非對稱伸縮振動，1 423.15 cm-1為COO-中的對稱伸縮振動和COOH中的C-O伸縮振動[13]。1 065.09 cm-1處的強峰是吡喃糖環(huán)的醚鍵（C-O-C）和羥基的吸收峰，950 cm-1～1 200 cm-1的特征峰說明有C-O-C和C-OH存在。804.47 cm-1處有吸收峰，說明可能含有甘露糖。707.02 cm-1吸收峰是α-和β-吡喃單糖形成的特征[14]。

2.3 NCP-3的單糖組成

混合對照品和NCP-3水解產(chǎn)物PMP衍生物的分離效果見圖3。

由圖3可以看出，對照品7種成分和NCP-3水解產(chǎn)物的PMP衍生物均分離良好，NCP-3為主要由甘露糖、葡萄糖醛酸、葡萄糖及阿拉伯糖組成的雜多糖。用單糖對照品溶液制成一系列不同濃度的混合對照品溶液，按上述試驗條件1.3.4進(jìn)行衍生及色譜分析。以對照品各單糖的峰面積對進(jìn)樣量進(jìn)行線性回歸，x為質(zhì)量（μg）；y為峰面積，得各單糖的回歸方程、相關(guān)系數(shù)及線性范圍，見表1。

圖3 混合標(biāo)準(zhǔn)單糖（a）和NCP-3水解產(chǎn)物（b）的PMP衍生物HPLC圖Fig.3 HPLC chromatograms of PMP derivatives of mixed standard monosaccharides（a）and NCP-3 hydrolysis products（b）

表1 5種單糖和2種糖醛酸的標(biāo)準(zhǔn)曲線Table 1 Regression equation and linear range of 5 monosaccharides，glucuronic acid and galacturonic acid

由NCP-3組分中各單糖的峰面積計算得NCP-3中單糖的摩爾比為甘露糖：葡萄糖醛酸∶葡萄糖∶阿拉伯糖=1.68∶1.95∶4.2∶1。

3 結(jié)論

本試驗通過水提醇沉法獲得地皮菜粗多糖，經(jīng)DEAE-Sepharose CL-6B柱分離可獲得5種地皮菜多糖組分 NCP-1、NCP-2、ANCP-3、NCP-4、NCP-5。紫外光譜表明NCP-3經(jīng)分離純化后不含蛋白質(zhì)及核酸；紅外光譜表明NCP-3具有多糖的典型吸收峰。采用柱前衍生HPLC法測定了主要組分NCP-3的單糖組成，發(fā)現(xiàn)NCP-3為主要由甘露糖、葡萄糖醛酸、葡萄糖、阿拉伯糖等單糖組成的一種雜多糖。

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Separation，Purification and Structural Analysis of Polysaccharides from Nostoc Commune

ZHANG Ya-wen，LI Hai-ping，MENG Li-qing，WANG Ying-jin*
（Department of Chemistry，Xinzhou Normal University，Xinzhou 034000，Shanxi，China）

The polysaccharides were extracted from Nostoc Commune with boiling water，followed by precipitation with ethanol，deproteinization with Sevage regent，and purification with DEAE-Sepharose CL-6B column chromatography.The purity and their structure were analyzed by UV and FTIR spectroscopy，and the monosaccharide compositions were investigated by PMP pre-column derivatization HPLC.The result suggested that fiverefined polysaccharides fractions，named as NCP-1，NCP-2，NCP-3，NCP-4 and NCP-5，were obtained by DEAE-Sepharose CL-6B column chromatography.The major component NCP-3 showed no signals of protein and nucleic acid and exhibited typical signals of polysaccharides.The NCP-3 was a hetero polysaccharides consisting of mannose，galacturonic acid，glucose and arabinose in a molar ratio of 2.17 ∶7.14 ∶2.56 ∶1.

Nostoc Commune；polysaccharides；separation；structural analysis；monosaccharide

2016-12-31

10.3969/j.issn.1005-6521.2017.18.013

忻州師范學(xué)院青年科研資助項目（QN201411）；忻州師范學(xué)院大學(xué)生科技創(chuàng)新基金資助課題（201493）；忻州師范學(xué)院教學(xué)改革研究項目（JG201310）；忻州師范學(xué)院重點建設(shè)學(xué)科項目（XK201303）

張雅雯（1995—），女（漢），本科，主要從事食品化學(xué)研究。

*通信作者：王迎進(jìn)（1980—），男，副教授，碩士，主要從事天然植物有效成分分離研究工作。