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    地皮菜多糖的分離純化及結(jié)構(gòu)組成分析

    2017-09-07 00:13:44張雅雯李海平孟麗青王迎進(jìn)
    食品研究與開發(fā) 2017年18期
    關(guān)鍵詞:忻州醛酸單糖

    張雅雯,李海平,孟麗青,王迎進(jìn)

    (忻州師范學(xué)院化學(xué)系,山西忻州034000)

    地皮菜多糖的分離純化及結(jié)構(gòu)組成分析

    張雅雯,李海平,孟麗青,王迎進(jìn)*

    (忻州師范學(xué)院化學(xué)系,山西忻州034000)

    以地皮菜為原料,采用水提醇沉法獲得地皮菜多糖(Nostoc Commune polysaccharides,NCP),經(jīng)Sevage法脫蛋白、DEAE-Sepharose CL-6B柱色譜法分離純化、透析、凍干等制備地皮菜精制多糖。利用紫外和紅外光譜對其進(jìn)行純度及結(jié)構(gòu)分析,采用1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮柱前衍生HPLC法測定其單糖組成及含量。結(jié)果表明:地皮菜多糖經(jīng)DEAE-Sepharose CL-6B柱色譜分離可得到5種多糖組分,其主要組分NCP-3具有典型的多糖吸收峰。HPLC分析表明NCP-3主要由甘露糖、葡萄糖醛酸、葡萄糖、阿拉伯糖構(gòu)成,其摩爾比為2.17∶7.14∶2.56∶1。

    地皮菜,多糖;分離;結(jié)構(gòu)表征;單糖

    地皮菜(Nostoc Commune)又稱地木耳、地軟、地耳、地衣等,為念珠藻屬植物[1-2]。地皮菜在我國各地幾乎都有分布,資源極其豐富[3]。地皮菜含有豐富的蛋白質(zhì)、多糖、維生素以及鈣、鐵、磷等,具有清熱解毒、明目益氣、補腎等功效[4]。已有研究表明多糖類成分作為地皮菜主要營養(yǎng)活性成分之一,具有明顯的抗氧化、抑菌及保濕等作用[5]。因而有關(guān)地皮菜多糖的提取純化、結(jié)構(gòu)性質(zhì)和藥理作用的研究受到國內(nèi)外學(xué)者的廣泛關(guān)注[6]。目前,有關(guān)地皮菜多糖提取的研究不少[6],但對地皮菜多糖的分離、純化、結(jié)構(gòu)組成分析研究報道很少[7],且不夠系統(tǒng)。為此,本文采用水提醇沉法獲得地皮菜粗多糖,經(jīng)Sevage法脫蛋白,DEAE-Sepharose CL-6B柱色譜分離得到5種多糖組分(NCP-1、NCP-2、NCP-3、NCP-4 和 NCP-5),然后重點對主要組分NCP-3進(jìn)行純度、結(jié)構(gòu)及單糖組成分析,旨在為地皮菜多糖的開發(fā)利用和進(jìn)一步研究提供科學(xué)依據(jù)。

    1 材料與方法

    1.1 材料與試劑

    地皮菜:山西省五臺縣五臺山;DEAE-Sepharose CL-6B:北京索萊寶科技有限公司;1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮(PMP):國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司;鼠李糖(Rha,HPLC檢測含量≥99%):北京化學(xué)試劑公司;葡萄糖醛酸(GlcUA,含量≥98%):西亞試劑公司;半乳糖醛酸(GalUA,含量≥97%)、葡萄糖(Glc,HPLC 檢測含量≥99%)、甘露糖(Man,含量≥98%)、半乳糖(Gal,HPLC檢測含量≥99.5%)、阿拉伯糖(Ara,含量≥98%):南京都萊生物技術(shù)有限公司;乙腈為色譜純;水為超純水,其它試劑均為分析純。

    1.2 儀器與設(shè)備

    LC-20AT高效液相色譜儀、SPD-20A紫外檢測器、FTIR 8400紅外光譜儀、UV-2550紫外可見分光光度計:日本島津;N-2000色譜工作站:浙江大學(xué);BS-100A自動部分收集器:上海精密儀器有限公司;LGJ-10多歧管普通型冷凍干燥機(jī):河南兄弟儀器設(shè)備有限公司。

    1.3 試驗方法

    1.3.1 地皮菜多糖的提取

    地皮菜70℃干燥4 h,粉碎,過60目篩,稱取地皮菜粉末100 g,95%乙醇600 mL攪拌回流2 h,抽濾,揮干。用石油醚(沸程60℃~90℃)600 mL攪拌回流2 h,抽濾,干燥得地皮菜藥渣。稱取地皮菜藥渣50 g,以20倍量的蒸餾水在溫度70℃下超聲提取45 min,過濾,濾渣重提2次,合并濾液,減壓濃縮。Sevage法脫蛋白、醇沉、過濾、洗滌、冷凍干燥得地皮菜粗多糖。

    1.3.2 地皮菜多糖的分離純化[8]

    DEAE-Sepharose CL-6B層析柱(2.5 cm×60 cm)先用超純水平衡,稱取地皮菜粗多糖0.100 g,少量水溶解,上柱,依次用 H2O、0.1、0.3、0.5、1 mol/L 的 NaCl溶液各250 mL洗脫,流速為1 mL/min,自動收集器收集每管10 mL。以硫酸-苯酚法跟蹤檢測,以管號為橫坐標(biāo),吸光度為縱坐標(biāo)繪制洗脫曲線。由洗脫曲線可知,地皮菜粗多糖經(jīng)DEAE-Sepharose CL-6B層析后,可得 5個組分,分別命名為 NCP-1、NCP-2、NCP-3、NCP-4和NCP-5,其中NCP-3組分含量遠(yuǎn)高于其它4個組分,故選取NCP-3作為主要分析對象。按峰形合并NCP-3組分峰洗脫液,超純水透析48 h,濃縮,醇沉,離心,凍干。

    1.3.3 NCP-3的紫外、紅外光譜測定[10]

    將NCP-3溶液配成質(zhì)量濃度為0.1 mg/mL的溶液,在波長200 nm~400 nm范圍內(nèi)進(jìn)行紫外光譜掃描。將NCP-3與KBr混合、研細(xì)壓片,在400cm-1~4000cm-1范圍內(nèi)進(jìn)行紅外光譜掃描。

    1.3.4 NCP-3的單糖組成

    1.3.4.1 對照品溶液的制備

    準(zhǔn)確取甘露糖、鼠李糖、葡萄糖醛酸、半乳糖醛酸各0.025 g、葡萄糖0.050 g、半乳糖0.030 g、阿拉伯糖0.030 g,用超純水溶解定容到10 mL容量瓶中,搖勻。

    1.3.4.2 NCP-3的水解

    取NCP-3溶液5 mL于比色管中,加0.1 mL濃硫酸,充N2密封,120℃水解4 h,NaOH溶液中和,離心5 min得上清液。

    1.3.4.3 對照品及NCP-3水解產(chǎn)物的衍生化標(biāo)記

    分別取對照品溶液和NCP-3水解產(chǎn)物各0.50 mL于5 mL離心管中,加入0.25 mol/LNaOH溶液0.5 mL,渦旋混勻。加入0.25 mol/L PMP甲醇溶液0.5 mL,混勻。70℃水浴反應(yīng)70 min,冷水浴10 min,加0.25 mol/L HCl 0.5 mL中和,渦旋2 min,加1 mL氯仿萃取3次,將水相用0.45 μm微孔膜過濾后HPLC進(jìn)樣分析[11]。

    1.3.4.4 色譜條件

    色譜柱:Krmasil C18(4.6 mm×250 mm,5 μm);柱溫:35℃,流動相:20 mmol/L磷酸鹽緩沖溶液(pH6.72)-乙腈(體積比為 78 ∶22);流速:1.0 mL/min;檢測波長:250 nm。

    2 結(jié)果與分析

    2.1 地皮菜多糖的分離純化

    地皮菜多糖經(jīng)DEAE-Sepharose CL-6B柱層析得洗脫曲線如圖1所示。

    圖1 地皮菜多糖的DEAE-Sepharose CL-6B柱色譜分離Fig.1 Elution curve of NCP on DEAE-Sepharose CL-6B column

    峰NCP-1為超純水洗脫得到,峰NCP-2、NCP-3、NCP-4和NCP-5為NaCl溶液洗脫得到。其中NCP-3組分峰由0.3 mol/LNaCl洗脫得到,為地皮菜多糖的主要成分。經(jīng)透析、醇沉、凍干得地皮菜精制多糖NCP-3。

    2.2 NCP-3的紫外、紅外光譜分析

    圖2-a為NCP-3的紫外光譜圖,圖2-b為NCP-3的紅外光譜圖。

    圖2 NCP-3的紫外光譜和紅外光譜Fig.2 UVabsorptionspectrum(a)andRspectrum(b)ofNCP-3

    由圖2-a可以看出NCP-3的紫外光譜吸收曲線平滑,在波長260、280 nm附近無明顯的吸收峰,說明NCP-3的純度較高,不含核酸和蛋白質(zhì)。由葡萄糖對照溶液制作標(biāo)準(zhǔn)曲線方程計算得其總多糖純度達(dá)97.88%。由圖2-b可知,NCP-3組分具有多糖典型的特征吸收峰。在3 600 cm-1~3 200 cm-1出現(xiàn)的強而寬的峰為糖類物質(zhì)O-H的伸縮振動[12],2 914.20 cm-1為烷基的C-H的伸縮振動,1 650.52 cm-1是羧基的C=O非對稱伸縮振動,1 423.15 cm-1為COO-中的對稱伸縮振動和COOH中的C-O伸縮振動[13]。1 065.09 cm-1處的強峰是吡喃糖環(huán)的醚鍵(C-O-C)和羥基的吸收峰,950 cm-1~1 200 cm-1的特征峰說明有C-O-C和C-OH存在。804.47 cm-1處有吸收峰,說明可能含有甘露糖。707.02 cm-1吸收峰是α-和β-吡喃單糖形成的特征[14]。

    2.3 NCP-3的單糖組成

    混合對照品和NCP-3水解產(chǎn)物PMP衍生物的分離效果見圖3。

    由圖3可以看出,對照品7種成分和NCP-3水解產(chǎn)物的PMP衍生物均分離良好,NCP-3為主要由甘露糖、葡萄糖醛酸、葡萄糖及阿拉伯糖組成的雜多糖。用單糖對照品溶液制成一系列不同濃度的混合對照品溶液,按上述試驗條件1.3.4進(jìn)行衍生及色譜分析。以對照品各單糖的峰面積對進(jìn)樣量進(jìn)行線性回歸,x為質(zhì)量(μg);y為峰面積,得各單糖的回歸方程、相關(guān)系數(shù)及線性范圍,見表1。

    圖3 混合標(biāo)準(zhǔn)單糖(a)和NCP-3水解產(chǎn)物(b)的PMP衍生物HPLC圖Fig.3 HPLC chromatograms of PMP derivatives of mixed standard monosaccharides(a)and NCP-3 hydrolysis products(b)

    表1 5種單糖和2種糖醛酸的標(biāo)準(zhǔn)曲線Table 1 Regression equation and linear range of 5 monosaccharides,glucuronic acid and galacturonic acid

    由NCP-3組分中各單糖的峰面積計算得NCP-3中單糖的摩爾比為甘露糖:葡萄糖醛酸∶葡萄糖∶阿拉伯糖=1.68∶1.95∶4.2∶1。

    3 結(jié)論

    本試驗通過水提醇沉法獲得地皮菜粗多糖,經(jīng)DEAE-Sepharose CL-6B柱分離可獲得5種地皮菜多糖組分 NCP-1、NCP-2、ANCP-3、NCP-4、NCP-5。紫外光譜表明NCP-3經(jīng)分離純化后不含蛋白質(zhì)及核酸;紅外光譜表明NCP-3具有多糖的典型吸收峰。采用柱前衍生HPLC法測定了主要組分NCP-3的單糖組成,發(fā)現(xiàn)NCP-3為主要由甘露糖、葡萄糖醛酸、葡萄糖、阿拉伯糖等單糖組成的一種雜多糖。

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    Separation,Purification and Structural Analysis of Polysaccharides from Nostoc Commune

    ZHANG Ya-wen,LI Hai-ping,MENG Li-qing,WANG Ying-jin*
    (Department of Chemistry,Xinzhou Normal University,Xinzhou 034000,Shanxi,China)

    The polysaccharides were extracted from Nostoc Commune with boiling water,followed by precipitation with ethanol,deproteinization with Sevage regent,and purification with DEAE-Sepharose CL-6B column chromatography.The purity and their structure were analyzed by UV and FTIR spectroscopy,and the monosaccharide compositions were investigated by PMP pre-column derivatization HPLC.The result suggested that fiverefined polysaccharides fractions,named as NCP-1,NCP-2,NCP-3,NCP-4 and NCP-5,were obtained by DEAE-Sepharose CL-6B column chromatography.The major component NCP-3 showed no signals of protein and nucleic acid and exhibited typical signals of polysaccharides.The NCP-3 was a hetero polysaccharides consisting of mannose,galacturonic acid,glucose and arabinose in a molar ratio of 2.17 ∶7.14 ∶2.56 ∶1.

    Nostoc Commune;polysaccharides;separation;structural analysis;monosaccharide

    2016-12-31

    10.3969/j.issn.1005-6521.2017.18.013

    忻州師范學(xué)院青年科研資助項目(QN201411);忻州師范學(xué)院大學(xué)生科技創(chuàng)新基金資助課題(201493);忻州師范學(xué)院教學(xué)改革研究項目(JG201310);忻州師范學(xué)院重點建設(shè)學(xué)科項目(XK201303)

    張雅雯(1995—),女(漢),本科,主要從事食品化學(xué)研究。

    *通信作者:王迎進(jìn)(1980—),男,副教授,碩士,主要從事天然植物有效成分分離研究工作。

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