響應(yīng)面法優(yōu)化百合多糖超聲輔助提取工藝

張占軍，王富花，葛洪，張軍，李海鳳

（1.揚(yáng)州市職業(yè)大學(xué)工程研究中心，江蘇揚(yáng)州225009；2.揚(yáng)州工業(yè)職業(yè)技術(shù)學(xué)院，江蘇揚(yáng)州225127）

響應(yīng)面法優(yōu)化百合多糖超聲輔助提取工藝

張占軍1，王富花2，葛洪1，張軍1，李海鳳1

（1.揚(yáng)州市職業(yè)大學(xué)工程研究中心，江蘇揚(yáng)州225009；2.揚(yáng)州工業(yè)職業(yè)技術(shù)學(xué)院，江蘇揚(yáng)州225127）

以宜興百合為原料，采用超聲輔助法提取百合中的多糖物質(zhì)。通過單因素試驗(yàn)，考察不同水平的超聲功率、超聲溫度、超聲時(shí)間和液料比對(duì)百合多糖得率的影響，并在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上采用響應(yīng)面法優(yōu)化超聲輔助提取百合多糖的工藝條件。試驗(yàn)結(jié)果表明，百合多糖最佳提取工藝條件為：超聲功率176 W，超聲溫度52℃、超聲時(shí)間30 min和液料比15∶1（mL/g），在該條件下，百合多糖的平均得率為12.37%，與理論預(yù)測(cè)值間差異不顯著，表明試驗(yàn)獲得的回歸數(shù)學(xué)模型能夠準(zhǔn)確預(yù)測(cè)百合多糖的得率。

百合；多糖；響應(yīng)面法；超聲；提取工藝

百合（Lily）為百合科百合屬多年生草本球根植物，又名強(qiáng)蜀、番韭、山丹、倒仙、重邁、中庭、摩羅、重箱、夜合花等，為衛(wèi)計(jì)委首批公布的藥食兩用植物之一[1]。百合的藥用價(jià)值極高，其味甘微苦，性平，味淡，微寒，具有養(yǎng)陰潤(rùn)肺止咳、清心安神、補(bǔ)中益氣的功效[2]。近年來的研究發(fā)現(xiàn)，百合中除含有氨基酸、蛋白質(zhì)、淀粉、脂肪、維生素和微量元素等基本營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)外，還含有多糖、秋水仙堿、皂苷等生物活性成分[3]。百合中多糖含量較高，最高可達(dá)30.41%[4]，其含量大小與品種、產(chǎn)地、采收期及提取檢測(cè)方法等因素密切相關(guān)。百合多糖具有廣泛藥理活性，如免疫調(diào)節(jié)、抗腫瘤、抗氧化、抑菌等生物活性，具有較高研究?jī)r(jià)值[5]。

目前多糖的提取多采用熱水浸提的方法，溫度高，耗時(shí)長(zhǎng)。近年來超聲波輔助提取方法已廣泛應(yīng)用于多糖的提取過程，利用超聲波的空化作用，可加速細(xì)胞壁的破裂，促進(jìn)多糖的溶出，縮短提取時(shí)間，提高多糖提取效率。此外，響應(yīng)面分析法作為一種優(yōu)化反應(yīng)條件和加工工藝參數(shù)的有效方法，已成功應(yīng)用于多種多糖的提取過程。本試驗(yàn)擬采用響應(yīng)面優(yōu)化法，以宜興百合的多糖得率為響應(yīng)值，通過考察超聲功率、提取溫度、提取時(shí)間和液料比等因素，采用Box-Behnken中心設(shè)計(jì)法，建立并驗(yàn)證相關(guān)的工藝數(shù)學(xué)模型，同時(shí)對(duì)提取的多糖進(jìn)行初步分析，以期為藥食兩用植物百合的進(jìn)一步開發(fā)利用提供試驗(yàn)參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

百合：產(chǎn)地江蘇宜興；無水乙醇、葡萄糖、苯酚、硫酸、無水乙醚、丙酮等：國(guó)產(chǎn)分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

DS-1高速組織搗碎機(jī)：上海標(biāo)本模型廠；DHG-9030A型電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱：上海一恒科技有限公司；R-210旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀：瑞士BUCHI公司；SHB-Ⅲ型循環(huán)水式多用真空泵：鄭州長(zhǎng)城科工貿(mào)有限公司；TDL-5000B型離心機(jī)：上海安亭科學(xué)儀器廠；SB-5200DTD超聲波清洗機(jī)：寧波新芝生物科技股份有限公司；722可見分光光度計(jì)：上海光學(xué)儀器廠。

1.3 方法

1.3.1 超聲波輔助提取百合多糖工藝

新鮮百合→去雜、掰片、烘干→破碎→石油醚回流脫脂→95%乙醇回流除小分子→烘干（預(yù)處理樣品）→稱取適量→加水超聲輔助提取→離心→上清液濃縮→加乙醇至85%終濃度醇沉→離心→沉淀部分→依次用無水乙醇、丙酮、石油醚抽洗→干燥→百合粗多糖

1.3.2 多糖含量和提取率的測(cè)定

1.3.2.1 百合多糖含量的測(cè)定

采用苯酚-硫酸法。即利用硫酸對(duì)多糖的水解作用，生成的單糖脫水生成糠醛衍生物，后與苯酚反應(yīng)生成有色化合物，在490 nm處進(jìn)行比色測(cè)定[6]。

1.3.2.2 百合多糖得率的計(jì)算

百合多糖得率 Y/%=（WE× CT）/WP× 100

式中：WE為百合粗多糖的質(zhì)量，g；WP為經(jīng)預(yù)處理的百合質(zhì)量，g；CT為百合粗多糖中總糖的含量。

1.3.3 單因素試驗(yàn)

通過超聲輔助、熱水浸提、乙醇沉淀的方法提取百合多糖。分別考察不同水平的超聲功率、超聲溫度、超聲時(shí)間和液料比對(duì)百合多糖得率的影響。

1.3.4 響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)

根據(jù)單因素試驗(yàn)確定的各變量范圍，選取超聲功率（A）、超聲溫度（B）、超聲時(shí)間（C）和液料比（D）為自變量，百合多糖得率為響應(yīng)值，通過Design Expert 8.0.6軟件，采用Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)方法，進(jìn)行四因素三水平的響應(yīng)面分析試驗(yàn)，同時(shí)對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行回歸分析，預(yù)測(cè)超聲輔助提取百合多糖的最佳提取工藝。

1.3.5 數(shù)據(jù)處理方法

所有數(shù)據(jù)均測(cè)定3次，以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差方式表示，單因素試驗(yàn)通過SPSS 22.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理進(jìn)行差異顯著性分析，P＜0.05認(rèn)為具有顯著差異，響應(yīng)面試驗(yàn)采用Design Expert 8.0.6軟件進(jìn)行結(jié)果分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 超聲波輔助提取單因素試驗(yàn)結(jié)果

2.1.1 超聲功率對(duì)百合多糖得率的影響

超聲功率對(duì)百合多糖得率的影響見圖1。

圖1 超聲功率對(duì)百合多糖得率的影響Fig.1 Effects of ultrasonic power on the yield of Lily polysaccharide

由圖1可以看出，在100 W～160 W范圍內(nèi)，百合多糖提取率隨著超聲功率提高而增加[7]，在超聲功率160 W時(shí)多糖得率達(dá)到最大值11.27%，此后再增大超聲功率，百合多糖得率開始下降。這可能是由于隨著超聲功率的增強(qiáng)，超聲波空化作用加劇，使得部分非多糖成分溶出，影響了百合多糖的溶出過程，同時(shí)超聲功率的增大也可能對(duì)溶出多糖產(chǎn)生一定程度的降解，因此導(dǎo)致百合多糖得率下降。綜合考慮，選擇160 W為百合多糖超聲功率中心試驗(yàn)點(diǎn)。

2.1.2 超聲溫度對(duì)百合多糖得率的影響

超聲溫度對(duì)百合多糖得率的影響見圖2。

圖2表明，超聲過程中溫度對(duì)百合多糖提取得率有較為明顯的影響，在30℃～50℃范圍內(nèi)，溫度升高，百合多糖得率增大，在超聲溫度為50℃時(shí)多糖得率達(dá)到最大值，此后再增大，百合多糖得率開始下降。溫度升高到一定值后，水分開始蒸發(fā)，影響多糖的溶出，同時(shí)溫度過高也導(dǎo)致了已溶出多糖的降解，從而造成百合多糖得率的降低[8]。因此選擇50℃為百合多糖超聲溫度中心試驗(yàn)點(diǎn)。

圖2 超聲溫度對(duì)百合多糖得率的影響Fig.2 Effects of extraction temperature on the yield of Lily polysaccharide

2.1.3 超聲時(shí)間對(duì)百合多糖得率的影響

超聲時(shí)間對(duì)百合多糖得率的影響見圖3。

圖3 超聲時(shí)間對(duì)百合多糖得率的影響Fig.3 Effects of extraction time on the yield of Lily polysaccharide

從圖3可以看出，在超聲時(shí)間10 min～40 min范圍內(nèi)，百合多糖提取率隨著超聲時(shí)間延長(zhǎng)而增加，超聲時(shí)間至40 min時(shí)多糖得率達(dá)到最大值。此后再延長(zhǎng)超聲時(shí)間，多糖得率變化不顯著，甚至有降低趨勢(shì)。這是由于開始提取液中百合多糖濃度低，延長(zhǎng)時(shí)間有助于多糖的溶出，但當(dāng)多糖的溶出達(dá)到一定程度后，單純延長(zhǎng)時(shí)間很難再增加多糖的進(jìn)一步溶解，甚至使多糖發(fā)生降解[9]。綜合考慮，選擇30 min為百合多糖提取超聲時(shí)間中心試驗(yàn)點(diǎn)。

2.1.4 液料比對(duì)百合多糖得率的影響

液料比對(duì)百合多糖得率的影響見圖4。

圖4表明，在液料比5∶1 mL/g～20∶1 mL/g范圍內(nèi)，百合多糖提取率隨著液料比增加而快速增加，液料比至20∶1 mL/g時(shí)多糖得率達(dá)到最大值，但當(dāng)液料比15∶1 mL/g后再增加液料比，多糖得率增加不再顯著。這主要是由于初始溶劑越多，多糖溶出就越多，從而多糖得率增加，但當(dāng)多糖溶解達(dá)到平衡時(shí)，再增加溶劑的量，多糖的溶解受到溶劑量的影響有限[10]?？紤]到后期濃縮等操作，選擇15∶1 mL/g為百合多糖提取液料比中心試驗(yàn)點(diǎn)。

圖4 液料比對(duì)百合多糖得率的影響Fig.4 Effects of ratio of water to material on the yield of Lily polysaccharide

2.2 響應(yīng)面法對(duì)百合多糖提取條件的優(yōu)化

2.2.1 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果

根據(jù)Box-Benhnken的中心組合試驗(yàn)設(shè)計(jì)原理，在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，利用Design Expert軟件進(jìn)行四因素三水平的響應(yīng)面法進(jìn)行試驗(yàn)設(shè)計(jì)，試驗(yàn)方案及結(jié)果見表1。設(shè)計(jì)了29次響應(yīng)面分析試驗(yàn)，其中24次為析因點(diǎn)試驗(yàn)，5次為零點(diǎn)試驗(yàn)，以估計(jì)誤差。

表1 Box-Behnken設(shè)計(jì)模型及試驗(yàn)值Table 1 Box-Behnken design matrix and experimental values

續(xù)表1 Box-Behnken設(shè)計(jì)模型及試驗(yàn)值Continue table 1 Box-Behnken design matrix and experimental values

2.2.2 百合多糖提取工藝回歸模型的建立及方差分析

對(duì)表2中的試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行回歸分析，得到百合多糖得率對(duì)以上4個(gè)因素的回歸方程為：

百合多糖得率=11.95+0.36A+0.41B+0.66C+0.44D+0.23AB+0.88AC-0.18AD-0.065BC+0.57BD-0.48CD-0.81A2-1.44B2-0.42C2-0.49D2

對(duì)回歸模型進(jìn)行方差分析，結(jié)果見表2。

表2 回歸模型方差分析Table 2 ANOVA for Response Surface Quadratic Model

該模型的確定系數(shù)為R2=0.919 1，模型的調(diào)整確定系數(shù)為R2adj=0.838 2。同時(shí)從表2可以看出：模型F值為11.36，P＜0.000 1，表明模型是高度顯著的，模型的失擬項(xiàng)P=0.154 8，表明失擬不顯著，說明該模型較穩(wěn)定，能較好地預(yù)測(cè)實(shí)際百合多糖提取情況。

2.2.3 響應(yīng)曲面圖分析優(yōu)化

因素交互作用對(duì)百合多糖得率影響的響應(yīng)面圖見圖5。

圖5 超聲功率（A）、超聲溫度（B）、超聲時(shí)間（C）和液料比（D）等因素交互作用對(duì)百合多糖得率影響的響應(yīng)面圖Fig.5 Response surface plots showing the interactive effects of ultrasonic power（A），extraction temperature（B），extraction time（C）and ratio of water to material（D）on the extraction yield of Lily polysaccharide

結(jié)合圖5可以看出，當(dāng)超聲時(shí)間和液料比一定時(shí)，當(dāng)超聲功率位于160 W～170 W，超聲溫度在50℃～55℃范圍內(nèi)時(shí)，兩者交互作用對(duì)百合多糖得率的影響最大（圖5a）；當(dāng)超聲溫度和液料比一定時(shí)，超聲功率越大，超聲時(shí)間越長(zhǎng)，百合多糖提取率也越高，兩者交互作用對(duì)百合多糖得率影響極顯著，百合多糖得率的最大值位于超聲功率170 W～180 W，超聲時(shí)間35 min～40 min區(qū)域內(nèi)（圖5b）；當(dāng)超聲溫度和超聲時(shí)間一定時(shí)，超聲功率和液料比之間的交互作用對(duì)百合多糖得率的影響不顯著，百合多糖得率最大值區(qū)域位于兩者中心試驗(yàn)點(diǎn)附近（圖5c）；當(dāng)超聲功率和液料比一定時(shí)，百合多糖得率最大值區(qū)域位于超聲溫度50℃～55℃，超聲時(shí)間35 min～40 min范圍內(nèi)，增加超聲時(shí)間對(duì)百合多糖得率的影響明顯大于超聲溫度的增加（圖5d）；當(dāng)超聲功率和超聲時(shí)間一定時(shí)，超聲溫度和液料比之間的交互作用對(duì)百合多糖得率的影響顯著，隨著超聲溫度的升高、液料比的增大，百合多糖得率也隨之增大，最大值區(qū)域位于超聲溫度50℃～55℃，液料比17.5 mL/g～20 mL/g范圍內(nèi)（圖5e）；當(dāng)超聲功率和超聲溫度一定時(shí)，超聲時(shí)間和液料比之間的交互作用對(duì)百合多糖得率的影響不顯著，增加超聲時(shí)間對(duì)百合多糖得率的影響明顯大于液料比的改變（圖5f）。

2.2.4 提取參數(shù)優(yōu)化及模型驗(yàn)證

通過 Design Expert軟件可知，當(dāng) A＝0.80、B＝0.17、C＝1.00、D＝－0.08時(shí)，Y出現(xiàn)理論最大值12.70%?？傻贸霭俸隙嗵亲罴烟崛」に嚄l件為超聲功率176 W，超聲溫度 51.7℃、超聲時(shí)間 30 min 和液料比 14.6∶1（mL/g）。考慮到實(shí)際操作的便利性，百合多糖最佳提取工藝條件最終確定為超聲功率176 W，超聲溫度52℃、超聲時(shí)間30 min和液料比15∶1（mL/g）。通過5次驗(yàn)證性試驗(yàn)，驗(yàn)證了該模型方程的適用性，驗(yàn)證性試驗(yàn)中百合多糖的得率為（12.37±0.23）%，而回歸方程所得的理論預(yù)測(cè)值為12.71%，通過IBM SPSS Statistics 22軟件，進(jìn)行單樣本T檢驗(yàn)，表明P值=0.075＞0.05，因此可以認(rèn)為采用優(yōu)化工藝條件所得實(shí)驗(yàn)值與理論預(yù)測(cè)值間沒有差異，即該方程能較好的預(yù)測(cè)百合多糖的提取得率。

3 結(jié)論

本研究以宜興百合為原料，通過單因素及響應(yīng)面試驗(yàn)，優(yōu)化了超聲輔助提取百合多糖的工藝，基于Design Expert軟件得到百合多糖最佳提取工藝為：超聲功率176 W，超聲溫度52℃、超聲時(shí)間30 min和液料比15∶1mL/g。在此條件下，百合多糖的得率為12.37%，與傳統(tǒng)的熱水浸提法相比，該提取方法具有溫度低、時(shí)間短、提取效率高等優(yōu)點(diǎn)，可為百合多糖的高效提取提供一定的參考。

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Optimization of Ultrasonic-assisted Extraction of Lily Polysaccharide by Response Surface Methodology

ZHANG Zhan-jun1，WANG Fu-hua2，GE Hong1，ZHANG Jun1，LI Hai-feng1
（1.Engineering Research Center，Yangzhou Vocational University，Yangzhou 225009，Jiangsu，China；2.Yangzhou Polytechnology Institute，Yangzhou 225127，Jiangsu，China）

The polysaccharide from Lily was extracted by ultrasonic-assisted extraction （UAE）method using flesh Lily in Yixing as raw materials.Firstly，the effects of the four main factors（ ultrasonic power，ultrasonic temperature，ultrasonic time and ratio of water to material）on the yield of Lily polysaccharide was discussed through single-factor experiments.The extraction technological condition of Lily polysaccharide was optimized with response surface method after single－factor test.Results showed that the maximum extraction yield of Lily polysaccharide was obtained at ultrasonic power 176 W，extraction temperature 52℃，extraction time 30 min and ratio of water to material 15 ∶1（mL/g）.Under this condition，the yield of Lily polysaccharide with ultrasonic extraction was the best of 12.37%，and the difference was not significant compared with the theoretical prediction.The mathematical model obtained in this experiment could accurately predict the yield of polysaccharide from Lily.This results will provide an experimental basis to further develop the resources of Lily in Yixing.

Lily；polysaccharide；response surface methodology；ultrasonic；extraction process

2017-01-06

10.3969/j.issn.1005-6521.2017.18.009

江蘇省基礎(chǔ)研究計(jì)劃（自然科學(xué)基金）項(xiàng)目（BK20141269）；江蘇省高?！扒嗨{(lán)工程”中青年學(xué)術(shù)帶頭人資助[蘇教師[2016]15號(hào)]；江蘇省第五期“333高層次人才培養(yǎng)工程”

張占軍（1977—），男（漢），副教授，博士，研究方向：食品生物技術(shù)。