簕菜葉提取物中總黃酮含量及其抑菌活性研究

程書朋，張焜，，武文敬，胡浩鵬，林惠瓊，梁立尹，李冬利，何燕，*

（1.廣東工業(yè)大學(xué)輕工化工學(xué)院，廣東廣州510006；2.五邑大學(xué)化學(xué)與環(huán)境學(xué)院，廣東江門529020）

簕菜葉提取物中總黃酮含量及其抑菌活性研究

程書朋1，張焜1，2，武文敬1，胡浩鵬1，林惠瓊1，梁立尹1，李冬利2，何燕1，*

（1.廣東工業(yè)大學(xué)輕工化工學(xué)院，廣東廣州510006；2.五邑大學(xué)化學(xué)與環(huán)境學(xué)院，廣東江門529020）

研究簕菜葉提取物中總黃酮含量及其抑菌活性，為簕菜的開發(fā)利用提供科學(xué)依據(jù)。首先，以95%乙醇回流提取簕菜葉粉末，依次用不同有機(jī)溶劑萃取得到石油醚、氯仿、乙酸乙酯、正丁醇萃取萃取層和剩余水層；然后采用標(biāo)準(zhǔn)曲線法分別測(cè)定簕菜葉各萃取層總黃酮含量；采用最低抑制濃度法考察各萃取層對(duì)大腸桿菌以及金黃色葡萄球菌等8種試驗(yàn)菌的抑制效果。結(jié)果表明，乙酸乙酯層總黃酮含量最高，為282.39 mg/g。石油醚層抑菌效果最佳，石油醚層對(duì)沙門氏菌、大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、白葡萄球菌、藤黃微球菌均具有較強(qiáng)的抑制效果，其最低抑制濃度（MIC）為10 μg/mL～40 μg/mL，對(duì)芽孢桿菌的抑制作用稍差。抑菌活性與總黃酮含量之間存在一定的相關(guān)性，但二者并非簡(jiǎn)單的正比關(guān)系。

簕菜；總黃酮；含量；抑菌活性

簕菜，學(xué)名白簕（Acanthopanax trifoliatus（L.）Merr.）又稱苦刺、三加皮、三葉五加、鵝掌簕等，為五加科（Araliaceae）五加屬（Acanthopanax）的攀援灌木，多生于林緣、灌叢或山坡[1]。作為藥食兩用植物，簕菜除良好的營(yíng)養(yǎng)保健價(jià)值外，還含有較多的黃酮類、多酚類及揮發(fā)油等活性物質(zhì)[2-4]。其中黃酮類化合物對(duì)自然界中的很多病原微生物具有廣泛的抑制和殺滅作用[5]。相關(guān)研究報(bào)道了植物黃酮及多酚類物質(zhì)的抑菌活性，其藥理活性在藥物及功能食品方面具有明顯的優(yōu)勢(shì)，并從中發(fā)現(xiàn)和提取低毒廣譜抗菌的黃酮類物質(zhì)，對(duì)藥物及功能食品的發(fā)展起到了重要作用[6-8]。

目前，鮮見系統(tǒng)的簕菜抑菌活性研究報(bào)道。本文以乙醇回流提取簕菜葉粉末得到粗提物，以石油醚、氯仿、乙酸乙酯、正丁醇以及水依次萃取簕菜葉乙醇粗提物得到不同萃取層，以大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、沙門氏菌、枯草芽孢桿菌、綠膿桿菌、藤黃微球菌、蠟狀芽孢桿菌、白葡萄球菌8種細(xì)菌為供試菌株，采用最低抑制濃度法考察不同萃取層萃取物的抑菌效果，并測(cè)定不同萃取層的總黃酮含量，建立總黃酮與抑菌活性之間的聯(lián)系，為簕菜的進(jìn)一步開發(fā)利用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與設(shè)備

簕菜：廣東省恩平市雪荘茶廠。

營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基：廣州瑞舒試劑有限公司；LB液體培養(yǎng)基、環(huán)丙沙星：Sigma-Aldrich；石油醚、氯仿、乙酸乙酯、正丁醇、無(wú)水乙醇（均為分析純）：天津市大茂化學(xué)試劑廠。

大腸桿菌（E.coli）、金黃色葡萄球菌（S.aureus）、沙門氏菌（Salmonella）、枯草芽孢桿菌（B.cereus）、綠膿桿菌（P.Aeruginosa）、藤黃微球菌（Micrococcus luteus）、蠟狀芽孢桿菌（B.subtilis）、白葡萄球菌（White staphylococcus）：皆采購(gòu)于廣州微生物研究所。

CS-400A型粉碎機(jī)：辰禾盛豐工貿(mào)有限公司；SN510C型立式壓力蒸汽滅菌器：重慶雅馬拓科技有限公司；DHP-9162型電熱恒溫培養(yǎng)箱、DZF-6090型真空干燥箱：上海一恒科學(xué)儀器有限公司；SHZ-82型氣浴恒溫振蕩器：金壇市科析儀器有限公司；SW-OJ-2FD型潔凈工作臺(tái)：蘇凈集團(tuán)蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司；RE-2000A型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀：上海亞榮生化儀器廠；ML204型電子天平：梅特勒-托利多儀器上海有限公司。

1.2 方法

1.2.1 簕菜葉乙醇提取物制備

新鮮簕菜葉在80℃干燥24 h，后用粉碎機(jī)粉碎并過(guò)100目篩，105℃下干燥4 h，得簕菜葉粉。準(zhǔn)確稱取20 g粉末置于500 mL圓底燒瓶中，加入一定量的95%無(wú)水乙醇溶液80℃下回流提取2 h，過(guò)濾后繼續(xù)回流提取，以上提取過(guò)程共進(jìn)行3次。將所得提取物旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮并真空干燥至恒重，稱重。

1.2.2 簕菜葉乙醇提取物的不同極性萃取物制備

準(zhǔn)確稱取10 g簕菜葉乙醇提取物，溶于20 mL乙醇，倒入100 mL分液漏斗中，依次用石油醚、氯仿、乙酸乙酯、正丁醇、水萃取，得到不同極性的萃取物。

石油醚層（A）：加入50 mL石油醚，振蕩搖勻，靜置分層，取上層石油醚部分，繼續(xù)萃取2次，合并萃取液，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮，得黃褐色膏狀黏稠物，真空干燥至恒重，稱重并計(jì)算得率。下層溶液收集備用。

氯仿層（B）：將石油醚萃取后的下層溶液加入50 mL氯仿，振蕩搖勻，靜置分層，取下層氯仿部分，繼續(xù)萃取2次，合并萃取液，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮，得黃褐色膏狀黏稠物，真空干燥至恒重，稱重并計(jì)算得率。上層溶液收集備用。

乙酸乙酯層（C）：將氯仿萃取后的上層溶液加入50 mL乙酸乙酯，振蕩搖勻，靜置分層，取上層乙酸乙酯部分，繼續(xù)萃取2次，合并萃取液，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮，得黃色膏狀黏稠物，真空干燥至恒重，稱重并計(jì)算得率。下層溶液收集備用。

正丁醇層（D）：將乙酸乙酯萃取后的下層溶液加入50 mL正丁醇，振蕩搖勻，靜置分層，取上層正丁醇部分，繼續(xù)萃取2次，合并萃取液，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮，得淡黃色膏狀黏稠物，真空干燥至恒重，稱重并計(jì)算得率。下層溶液收集備用。

水層（E）：將正丁醇萃取后的下層溶液減壓濃縮，得到淡黃色膏狀黏稠物，真空干燥至恒重，稱重并計(jì)算得率。

提取過(guò)程如圖1所示。準(zhǔn)確稱取上述5種不同部位萃取物，分別用二甲基亞砜溶解，配制成2.56 mg/mL的各萃取物溶液，保存?zhèn)溆谩?/p>

圖1 簕菜葉不同萃取層提取物的提取過(guò)程Fig.1 The extraction process of different extracts of Acanthopanax trifoliatus（L.）Merr leaves

1.2.3 總黃酮含量測(cè)定

以蘆丁為對(duì)照品，采用標(biāo)準(zhǔn)曲線法計(jì)算樣品中總黃酮的含量[9-10]。

標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備：精密量取蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液0、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0 mL，分別置于 7 個(gè) 10 mL 具塞試管中，用30%乙醇補(bǔ)充至5 mL，再加入0.3 mL質(zhì)量分?jǐn)?shù)為5%的NaNO2溶液，混勻，放置5 min后分別加入0.3 mL，質(zhì)量分?jǐn)?shù)為10%的Al（NO）3溶液，混勻，放置6 min，加的4 mL的1 mol/L的NaOH混勻，用30%乙醇定容至10 mL，搖勻，以無(wú)水乙醇作空白，用紫外-可見分光光度法在510 nm處測(cè)定吸光度。以吸光度為縱坐標(biāo)（A），蘆丁濃度為橫坐標(biāo)（mg/mL），繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

樣品測(cè)定：精密量取待測(cè)提取物溶液1.0 mL（V0），用30%乙醇補(bǔ)充至5 mL，再加入0.3 mL質(zhì)量分?jǐn)?shù)為5%的NaNO2溶液，混勻，放置5 min后分別加入0.3 mL，質(zhì)量分?jǐn)?shù)為10%的Al（NO）3溶液，混勻，放置6 min，加的4 mL的1 mol/L的NaOH混勻，用30%乙醇定容至10 mL，搖勻，以無(wú)水乙醇作空白，用紫外-可見分光光度法在510 nm處測(cè)定吸光度，由標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算出供試品溶液中含總黃酮的濃度（c），從而計(jì)算樣品中總黃酮的含量（X）。

式中：X為試樣中總黃酮量（以蘆丁計(jì)），mg蘆丁/g簕菜葉粉末；c為經(jīng)試樣自身校正后，由標(biāo)準(zhǔn)曲線算得被測(cè)液中總黃酮濃度，mg/mL；V為試樣定容后體積，mL；m為供試溶液制備中稱取試樣的質(zhì)量，g；n為試樣測(cè)定稀釋的倍數(shù)；V0為試樣測(cè)定的取樣量，mL。

計(jì)算結(jié)果保留4位有效數(shù)字。

1.2.4 供試菌株活化及菌懸液制備

將供試菌種接入相對(duì)應(yīng)的試管斜面培養(yǎng)基上，于37℃恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)24 h，培養(yǎng)完成后，置于4℃冰箱中冷藏備用。將配置好的LB液體培養(yǎng)基于121℃滅菌20 min，室溫冷卻后，用接種環(huán)從斜面培養(yǎng)基上挑取一環(huán)置于10 mL滅菌液體培養(yǎng)基中，于37℃搖床中培養(yǎng)24 h，活化2次。用接種環(huán)挑取少許活化的菌種以無(wú)菌水稀釋至0.5麥?zhǔn)媳葷嵋壕鷳乙海謩e制成1.5×108CFU/mL的菌懸液，再用LB液體培養(yǎng)基稀釋100倍，配制成1.5×106CFU/mL的菌懸液，備用[11-12]。

1.2.5 最低抑菌濃度（MIC）測(cè)定

采用液體稀釋法測(cè)定，每種菌的測(cè)定，需取30支試管，分5組，將每組6支試管編號(hào)。將LB液體培養(yǎng)基和試管于121℃滅菌20 min，冷卻后，試管中各加入1 mL液體培養(yǎng)基，5組的第一支試管中各對(duì)應(yīng)加入1 mL石油醚層、氯仿層、乙酸乙酯層、正丁醇層、水層萃取物，按照兩倍稀釋法，將提取物配成不同的濃度，每組試管中各加入該試驗(yàn)菌0.1 mL，搖勻。將試管置于37℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，觀察細(xì)菌生長(zhǎng)情況。其他7種菌同樣操作[11]。

2 結(jié)果與分析

2.1 簕菜葉不同萃取層提取物的提取率

根據(jù)簕菜葉各部位萃取物的重量計(jì)算得到不同萃取層提取物的提取率，如表1所示。

表1 簕菜葉不同萃取層提取物的提取率Table 1 The extraction rate of different extracts of Acanthopanax trifoliatus（L.）Merr leaves

從表1可以看出，氯仿層提取率最高，為48.94%，其次為石油醚層，為22.25%。5個(gè)萃取層提取物的提取率由高到低依次為：氯仿層＞石油醚層＞水層＞正丁醇層＞乙酸乙酯層。

2.2 簕菜葉不同萃取層提取物中總黃酮含量

采用標(biāo)準(zhǔn)曲線法測(cè)定簕菜各萃取層中總黃酮的含量結(jié)果顯示如圖2。

圖2 簕菜葉各萃取部位的總黃酮含量比較Fig.2 Contents of total flavonoid of the extracts of Acanthopanax trifoliatus（L.）Merr leaves

由圖2可知，不同提取物的總黃酮含量不同。其中，乙酸乙酯層提取物的總黃酮含量最高，達(dá)到282.39mg/g，其次為石油醚層提取物，為141.13 mg/g，水層提取物含量最低，僅為25.81 mg/g，表明簕菜提取物中總黃酮主要集中于乙酸乙酯層。

2.3 簕菜葉不同萃取層提取物的最低抑菌濃度（MIC）

簕菜葉乙醇提取物的石油醚層、氯仿層、乙酸乙酯層、正丁醇層、水層5個(gè)萃取物的抑菌效果見表2。

表2 簕菜葉不同萃取層提取物對(duì)8種細(xì)菌的最低抑菌濃度Table 2 MIC of different extraction layer of Acanthopanax trifoliatus（L.）Merr extracts for eight kinds of bacteria

由表2可以看出，正丁醇層與水層萃取物對(duì)8種細(xì)菌的抑制作用不明顯，乙酸乙酯層萃取物對(duì)沙門氏菌與大腸桿菌有微弱的抑制作用。5個(gè)萃取物的抑菌效果由強(qiáng)到弱依次為：石油醚層＞氯仿層＞乙酸乙酯層＞正丁醇層＞水層。石油醚層萃取物對(duì)8種細(xì)菌都有較好的抑制作用，對(duì)沙門氏菌的抑制作用最強(qiáng)，最為接近環(huán)丙沙星的抑菌效果。氯仿層萃取物對(duì)沙門氏菌與大腸桿菌的抑制作用稍遜于石油醚層萃取物。

3 結(jié)論與討論

采用乙醇提取簕菜葉中有效成分，研究醇提取物不同萃取部位的總黃酮含量及其抑菌活性。試驗(yàn)結(jié)果顯示簕菜各萃取部位都含有總黃酮，5個(gè)萃取層萃取物總黃酮含量由高到低依次為：乙酸乙酯層＞石油醚層＞正丁醇層＞氯仿層＞水層，其中乙酸乙酯層總黃酮含量最高，為282.39 mg/g，其次為石油醚層萃取物，為141.13 mg/g。因此，簕菜不論是作為野生保健蔬菜還是藥用植物，都具有較高的經(jīng)濟(jì)價(jià)值和廣泛的開發(fā)前景。

抑菌試驗(yàn)結(jié)果表明石油醚層提取物、氯仿層提取物以及乙酸乙酯層提取物對(duì)沙門氏菌、大腸桿菌以及金黃色葡萄球菌等8種細(xì)菌均存在一定的抑制作用，而水層提取物與正丁醇層提取物對(duì)8種試驗(yàn)菌均無(wú)明顯抑制作用。通過(guò)對(duì)各提取物的抑菌活性比較，發(fā)現(xiàn)石油醚層提取物對(duì)沙門氏菌、大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、白葡萄球菌、藤黃微球菌、綠膿桿菌、枯草芽孢桿菌、蠟狀芽孢桿菌8種細(xì)菌的MIC分別為10、20、40、40、40、80、80、80 μg/mL，其抑菌作用最強(qiáng)，可作為植物資源的抑菌劑并進(jìn)一步研究。

根據(jù)研究報(bào)道植物黃酮具有良好的抑菌活性，結(jié)合簕菜葉各萃取層的抑菌活性及其總黃酮含量分析，發(fā)現(xiàn)二者存在一定的相關(guān)性。各萃取層中都含有總黃酮，總黃酮含量為20 mg/g～150 mg/g，也都具有一定的抑菌活性，其中石油醚層總黃酮含量較高，其抑菌活性最佳。但是抑菌活性與總黃酮含量并不成簡(jiǎn)單的正比關(guān)系。在進(jìn)行植物抑菌活性研究時(shí)，應(yīng)認(rèn)識(shí)到其成分的復(fù)雜性和各種成分性質(zhì)的差異性，多種成分同時(shí)存在時(shí)可能僅存在“最低抑菌濃度”。

綜上，對(duì)簕菜葉醇提物乙酸乙酯層和石油醚層提取物的化學(xué)成分做深入研究，有望尋找到新型的抑菌劑。

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Research of Total Flavonoid Content and Antibacterial Activity of the Extracts of Acanthopanax trifoliatus（L.）Merr Leaves

CHENG Shu-peng1，ZHANG Kun1，2，WU Wen-jing1，HU Hao-peng1，LIN Hui-qiong1，LIANG Li-yin1，LI Dong-li2，HE Yan1，*
（1.School of Chemical Engineering and Light Industry，Guangdong University of Technology，Guangzhou 510006，Guangdong，China；2.School of Chemical and Environmental，Wuyi University，Jiangmen 529020，Guangdong，China）

Total flavonoid contents and antibacterial activities of the extracts ofAcanthopanax trifoliatus（L.）Merr leaves were investigated.The powder of leaves were extracted with 95%EtOH.After the solvent were evaporated，the resultant extract was then extracted in turn with petroleum ether，chloroform，ethyl acetate，n-BuOH and water.The contents of total flavonoid of the extracts were measured by the standard curve method.The antibacterial activities of the extracts were measured by using minimum inhibiting concentration method against eight bacteria，such asE.coli，Salmonella，S.aureus.The result indicated that the highest content of flavonoid was 282.39 mg/g in the ethyl acetate extract.The petroleum ether extract had the best antibacterial activity.The extract from petroleum ether exhibited higher inhibition effect toSalmonella，E.coli，S.aureus，White staphylococcusandMicrococcus luteuswith a MIC range of 10 μg/mL to 40 μg/mL and lower inhibition effect to bacillus.The correlation bettween the content of total flavonoid and antibacterial activity was existed but not a simple proportional relationship.

Acanthopanax trifoliatus；total flavonoid；content；antibacterial activity

2017-01-04

10.3969/j.issn.1005-6521.2017.18.008

廣東省自然科學(xué)基金面上項(xiàng)目（2016A030313006）；江門市農(nóng)業(yè)科技攻關(guān)計(jì)劃項(xiàng)目（20150160008298）

程書朋（1991—），女（漢），碩士，研究方向：化學(xué)工程與技術(shù)。

*通信作者：何燕（1979—），女，高級(jí)工程師，博士，研究方向：藥物制劑。