HPLC法同時(shí)測(cè)定復(fù)方甲硝唑克林霉素乳膏中4種成分的含量Δ

范義鳳，王 欽（南通大學(xué)附屬醫(yī)院藥學(xué)部，江蘇南通 226001）

HPLC法同時(shí)測(cè)定復(fù)方甲硝唑克林霉素乳膏中4種成分的含量Δ

范義鳳＊，王 欽（南通大學(xué)附屬醫(yī)院藥學(xué)部，江蘇南通 226001）

目的：建立同時(shí)測(cè)定復(fù)方甲硝唑克林霉素乳膏中甲硝唑、鹽酸克林霉素、螺內(nèi)酯、維生素B6含量的方法。方法：采用高效液相色譜法。色譜柱為Diamonsil C18，流動(dòng)相為乙腈-[0.68%磷酸氫二鉀溶液（含1%三乙胺）]（梯度洗脫），流速為1.0 mL/min，檢測(cè)波長(zhǎng)為210 nm，柱溫為25℃，進(jìn)樣量為20 μL。結(jié)果：甲硝唑、鹽酸克林霉素、螺內(nèi)酯、維生素B6檢測(cè)質(zhì)量濃度線(xiàn)性范圍分別為20.0～120.0 μg/mL（r＝0.999 9）、10.0～60.0 μg/mL（r＝0.999 1）、4.0～24.0 μg/mL（r＝0.999 4）、10.0～60.0 μg/mL（r＝0.999 4）；定量限分別為13.06、7.36、2.43、6.42 μg/mL，檢測(cè)限分別為4.18、1.82、0.76、1.79 μg/mL；精密度、穩(wěn)定性、重復(fù)性試驗(yàn)的RSD＜2.0%；回收率分別為98.97%～100.91%（RSD＝0.79%，n＝9）、99.02%～101.80%（RSD＝1.03%，n＝9）、98.18%～101.05%（RSD＝1.01%，n＝9）、98.75%～101.36%（RSD＝0.87%，n＝9）。結(jié)論：該方法簡(jiǎn)便、快速、結(jié)果準(zhǔn)確，可用于復(fù)方甲硝唑克林霉素乳膏中甲硝唑、鹽酸克林霉素、螺內(nèi)酯、維生素B6含量的同時(shí)測(cè)定。

甲硝唑；鹽酸克林霉素；螺內(nèi)酯；維生素B6；高效液相色譜法；含量

1 材料

1.1 儀器

1100型HPLC儀，包括四元泵、紫外檢測(cè)器、手動(dòng)進(jìn)樣器、色譜工作站、在線(xiàn)真空脫氣機(jī)（美國(guó)Agilent公司）；Cary-300型紫外分光光度計(jì)（美國(guó)Varian公司）；BP211D型十萬(wàn)分之一電子天平（德國(guó)Sartorius公司）；Milli-Q Advantage A10型超純水儀（美國(guó)Millipore公司）。

1.2 藥品與試劑

復(fù)方甲硝唑克林霉素乳膏（南通大學(xué)附屬醫(yī)院自制，批號(hào)：160407、160412、160510，規(guī)格：20 g/盒）；甲硝唑?qū)φ掌罚ㄅ?hào)：0191-9804，純度：99.6%）、鹽酸克林霉素對(duì)照品（批號(hào)：130422-200702，純度：99.9%）、螺內(nèi)酯對(duì)照品（批號(hào)：100193-14189，純度：99.8%）、維生素B6對(duì)照品（批號(hào)：100116-13470，純度：99.8%）均購(gòu)自中國(guó)食品藥品檢定研究院；乙腈為色譜純，磷酸氫二鉀、乙醇為分析純，水為純化水。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

色譜柱：Diamonsil C18（150 mm×4.6 mm，5 μm）；流動(dòng)相：乙腈（A）-[0.68%磷酸氫二鉀溶液（含1%三乙胺，B）]，梯度洗脫（洗脫程序見(jiàn)表1）；流速：1.0 mL/min；檢測(cè)波長(zhǎng)：210 nm；柱溫：25℃；進(jìn)樣量：20 μL。

表1 梯度洗脫程序Tab 1 Gradient elution process

2.2 溶液的制備

2.2.1 混合對(duì)照品溶液 精密稱(chēng)取甲硝唑?qū)φ掌?00 mg、鹽酸克林霉素對(duì)照品50 mg、螺內(nèi)酯對(duì)照品20 mg、維生素B6對(duì)照品50 mg，置于同一100 mL量瓶中，加50%乙醇溶液適量，于80℃水浴加熱20 min使溶解，放至室溫，再加50%乙醇溶液定容，搖勻，作為混合對(duì)照品貯備液。取上述混合對(duì)照品貯備液5 mL，置于25 mL量瓶中，加流動(dòng)相定容，搖勻，即得。

2.2.2 供試品溶液 精密稱(chēng)取樣品5 g，置于100 mL燒杯中，加50%乙醇溶液于80℃水浴加熱20 min，回流提取3次，每次30 mL，提取液轉(zhuǎn)移至100 mL量瓶中，加50%乙醇溶液定容，搖勻，濾過(guò)，取續(xù)濾液5 mL，置于25 mL量瓶中（測(cè)定甲硝唑含量時(shí)取續(xù)濾液2 mL，置于25 mL量瓶中），加流動(dòng)相定容，搖勻，即得。

2.2.3 陰性對(duì)照溶液 按樣品的制備工藝和處方比例，取空白輔料適量，按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備陰性對(duì)照溶液。

2.3 系統(tǒng)適用性試驗(yàn)

精密量取“2.2”項(xiàng)下混合對(duì)照品溶液、供試品溶液和陰性對(duì)照溶液各適量，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄色譜，詳見(jiàn)圖1。由圖1可知，在該色譜條件下各成分均能達(dá)到基線(xiàn)分離，分離度＞1.5；理論板數(shù)以甲硝唑、鹽酸克林霉素、螺內(nèi)酯、維生素B6峰計(jì)均＞3 360，保留時(shí)間分別為3.5、11.7、13.5、1.6 min。結(jié)果表明，其他成分對(duì)測(cè)定無(wú)干擾。

圖1 高效液相色譜法Fig 1 HPLC chromatograms

2.4 線(xiàn)性關(guān)系考察

精密量取“2.2.1”項(xiàng)下混合對(duì)照品貯備液2.0、3.0、4.0、5.0、6.0、8.0、10.0、12.0 mL，分別置于100 mL量瓶中，加流動(dòng)相定容，搖勻，即得系列混合對(duì)照品溶液，再按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積。以待測(cè)成分質(zhì)量濃度（x，μg/mL）為橫坐標(biāo)、峰面積（y）為縱坐標(biāo)進(jìn)行線(xiàn)性回歸，回歸方程與線(xiàn)性范圍見(jiàn)表2。

表2 回歸方程與線(xiàn)性范圍Tab 2 Regression equations and linear ranges

2.5 定量限（LOQ）與檢測(cè)限（LOD）考察

取“2.2.1”項(xiàng)下混合對(duì)照品溶液適量，倍比稀釋?zhuān)础?.1”項(xiàng)下色譜條件連續(xù)進(jìn)樣測(cè)定6次，記錄峰面積。當(dāng)信噪比為10∶1時(shí)，得LOQ；當(dāng)信噪比為3∶1時(shí)，得LOD，結(jié)果見(jiàn)表3。

表3 LOQ與LOD測(cè)定結(jié)果（μg/mL）Tab 3 Results of LOQ and LOD（μg/mL）

2.6 精密度試驗(yàn)

精密量取“2.2.1”項(xiàng)下混合對(duì)照品溶液適量，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積。結(jié)果，甲硝唑、鹽酸克林霉素、螺內(nèi)酯、維生素B6峰面積的RSD分別為0.71%、0.59%、0.42%、0.87%（n＝6），表明儀器精密度良好。

2.7 穩(wěn)定性試驗(yàn)

精密量取“2.2.2”項(xiàng)下供試品溶液（批號(hào)：160412）適量，分別于室溫下放置0、2、4、8、12 h時(shí)按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積。結(jié)果，甲硝唑、鹽酸克林霉素、螺內(nèi)酯、維生素B6峰面積的RSD分別為0.91%、1.23%、0.87%、1.56%（n＝5），表明供試品溶液在室溫下放置12 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.8 重復(fù)性試驗(yàn)

精密稱(chēng)取同一批樣品（批號(hào)：160412）適量，按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，再按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積。結(jié)果，甲硝唑、鹽酸克林霉素、螺內(nèi)酯、維生素B6峰面積的RSD分別為0.65%、0.89%、0.77%、0.93%（n＝6），表明本方法重復(fù)性良好。

2.9 回收率試驗(yàn)

按樣品的處方比例取空白輔料適量，共9份，分別置于100 mL燒杯中，各加入低、中、高質(zhì)量的甲硝唑、鹽酸克林霉素、螺內(nèi)酯、維生素B6對(duì)照品，按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，再按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積并計(jì)算回收率，結(jié)果見(jiàn)表4。

2.10 樣品含量測(cè)定

取3批樣品各適量，按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，再按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積并計(jì)算樣品含量，結(jié)果見(jiàn)表5。

表4 回收率試驗(yàn)結(jié)果（n＝9）Tab 4 Results of recovery test（n＝9）

表5 樣品含量測(cè)定結(jié)果（n＝3，%）Tab 5 Results of contents determination of samples（n＝3，%）

3 討論

3.1 檢測(cè)波長(zhǎng)的選擇

在200～400 nm波長(zhǎng)范圍內(nèi)進(jìn)行掃描，發(fā)現(xiàn)甲硝唑的最大吸收波長(zhǎng)為310 nm，螺內(nèi)酯的最大吸收波長(zhǎng)為237 nm，維生素B6的最大吸收波長(zhǎng)為290 nm，鹽酸克林霉素的最大吸收波長(zhǎng)為210 nm，且4種成分均有末端吸收，因此綜合考慮選擇最靠近末端的210 nm作為本試驗(yàn)的檢測(cè)波長(zhǎng)。

3.2 流動(dòng)相和洗脫方式的選擇

本課題組曾選擇乙腈-[0.68%磷酸氫二鉀溶液（含1%三乙胺）]（20∶80，V/V）為流動(dòng)相進(jìn)行等度洗脫，結(jié)果甲硝唑和維生素B6分離度較好，但鹽酸克林霉素和螺內(nèi)酯分離度較差；而調(diào)整流動(dòng)相比例為（60∶40，V/V）再進(jìn)行等度洗脫，鹽酸克林霉素和螺內(nèi)酯出峰時(shí)間比較合適且分離度符合要求，但甲硝唑和維生素B6出峰時(shí)間太快，從而無(wú)法將甲硝唑、維生素B6分離。最后改變洗脫方式，采用梯度洗脫，結(jié)果上述4種成分的色譜分離均較好。因此，本試驗(yàn)以乙腈-[0.68%磷酸氫二鉀溶液（含1%三乙胺）]為流動(dòng)相進(jìn)行梯度洗脫。

3.3 提取溶劑和提取次數(shù)的選擇

本課題組曾考察了不同體積分?jǐn)?shù)的提取溶劑（20%、30%、40%、50%、70%乙醇溶液），以及提取次數(shù)（1、2、3、4、5次），結(jié)果發(fā)現(xiàn)采用50%乙醇溶液提取3次、40%乙醇溶液提取5次能將4種待測(cè)成分提取完全。為了減少提取次數(shù)，方便試驗(yàn)操作，本研究最終采用50%乙醇溶液于80℃水浴加熱20 min，回流提取3次的方式進(jìn)行樣品的提取。

綜上所述，本方法簡(jiǎn)便、快速、結(jié)果準(zhǔn)確，可用于復(fù)方甲硝唑克林霉素乳膏中甲硝唑、鹽酸克林霉素、螺內(nèi)酯、維生素B6含量的同時(shí)測(cè)定。

[1] Bartlett KB，Davis SA，F(xiàn)eldman SR.Topical antimicrobial acne treatment tolerability：a meaningful factor in treatment adherence[J].J Am Acad Dermatol，2014，71（3）：581-582.

[2] Khodaeiani E，F(xiàn)ouladi RF，Yousefi N，et al.Efficacy of 2%metronidazole gel in moderate acne vulgaris[J].Indian J Dermatol，2012，57（4）：279-281.

[3] Mokhtari F，F(xiàn)aghihi G，Basiri A，et al.Comparison effect of azithromycin gel 2%with clindamycin gel 1%in patients with acne[J].Adv Biomed Res，2016，5（4）：72-73.

[4] Schaller M，Sebastian M，Ress C，et al.A multicentre，randomized，single-blind，parallel-group study comparing the efficacy and tolerability of benzoyl peroxide 3%/ clindamycin 1%with azelaic acid 20%in the topical treatment of mild-to-moderate acne vulgaris[J].J Eur Acad Dermatol Venereol，2016，30（6）：966-973.

[5] Bagherani N.Efficacy of topical spironolactone in treatment of acne[J].Dermatol Ther，2015，28（3）：176-177.

[6] 戴君來(lái).單純外用0.1%阿達(dá)帕林凝膠與聯(lián)合內(nèi)服甲硝唑及維生素B6治療尋常痤瘡的療效比較[J].上海醫(yī)學(xué)，2002，25（1）：115-116.

[7] 王友志，亓志鵬，李永坤.四環(huán)素、甲氰咪胍、維生素B6治療170例尋常痤瘡療效觀察[J].中國(guó)麻風(fēng)皮膚病雜志，2001，17（2）：146-146.

[8] 張金安，郭金平，胡占芳，等.HPLC法同時(shí)測(cè)定氯甲醑中氯霉素和甲硝唑的含量[J].中國(guó)藥師，2014，17（9）：1596-1598.

[9] 彭賢東，唐志立，龍鳳，等.HPLC法同時(shí)測(cè)定替硝唑螺內(nèi)酯乳膏中替硝唑和螺內(nèi)酯含量[J].中國(guó)藥房，2013，24（5）：468-470.

[10] 張帶榮.高效液相色譜法測(cè)定鹽酸克林霉素注射液的含量[J].中國(guó)醫(yī)院藥學(xué)雜志，2010，30（13）：1165-1167.

[11]陳方劍，陸松偉，宋洪杰，等.用HPLC法測(cè)定珍珠維E乳膏中維生素B6和維生素E的含量[J].藥學(xué)服務(wù)與研究，2015，15（3）：201-204.

Simultaneous Determination of 4 Components in Compound Metronidazole Clindamycin Cream by HPLC

FAN Yifeng，WANG Qin（Dept.of Pharmacy，the Affiliated Hospital of Nantong University，Jiangsu Nantong 226001，China）

OBJECTIVE：To establish the method for simultaneous determination of the content of metronidazole，clindamycin hydrochloride，spironolactone and vitamin B6in Compound metronidazole clindamycin cream.METHODS：HPLC method was adopted.The determination was performed on Diamonsil C18column with mobile phase consisted of acetonitrile-[0.68%dipotassium hydrogen phosphate solution（containing 1%triethylamine）]（gradient elution）at the flow rate of 1.0 mL/min.The detection wavelength was set at 210 nm，and column temperature was 25℃.The sample size was 20 μL.RESULTS：The linear ranges of metronidazole，clindamycin hydrochloride，spironolactone and vitamin B6were respectively 20.0-120.0 μg/mL（r＝0.999 9），10.0-60.0 μg/mL（r＝0.999 1），4.0-24.0 μg/mL（r＝0.999 4），10.0-60.0 μg/mL（r＝0.999 4）.The quantitative limits were respectively 13.06，7.36，2.43，6.42 μg/mL.The detection limits were 4.18，1.82，0.76，1.79 μg/mL.RSDs of the precision，stability，repeatability tests were all less than 2%.The recovery rates were respectively 98.97%-100.91%（RSD＝0.79%，n＝9），99.02%-101.80%（RSD＝1.03%，n＝9），98.18%-101.05%（RSD＝1.01%，n＝9）and 98.75%-101.36%（RSD＝0.87%，n＝9）.CONCLUSIONS：The method is simple，rapid，accurate and can be used for the determination of metronidazole，clindamycin hydrochloride，spironolactone and vitamin B6in Compound clindamycin metronidazole cream.

Metronidazole；Clindamycin hydrochloride；Spironolactone；Vitamin B6；HPLC；Content復(fù)方甲硝唑克林霉素乳膏為我院自行研制的院內(nèi)制劑，其主要成分為甲硝唑、鹽酸克林霉素、螺內(nèi)酯、維生素B6，主要用于青少年尋常型痤瘡的治療。尋常型痤瘡主要由體內(nèi)雄性激素水平過(guò)高、皮脂腺功能亢進(jìn)、痤瘡丙酸桿菌感染等引起[1]。甲硝唑和鹽酸克林霉素可有效抑制痤瘡桿菌的生長(zhǎng)[2-4]，螺內(nèi)酯可干擾皮膚雄激素受體使皮脂腺分泌明顯減少[5]，維生素B6在治療尋常型痤瘡方面也具有一定的療效[6-7]。且目前尚無(wú)同時(shí)測(cè)定該制劑中甲硝唑、鹽酸克林霉素、螺內(nèi)酯、維生素B64種主要成分含量的報(bào)道。鑒于此，本課題組參考相關(guān)文獻(xiàn)[8-11]，采用高效液相色譜法（HPLC）建立了同時(shí)測(cè)定該制劑中上述4種成分含量的方法，以期為完善該制劑的質(zhì)量控制提供參考。

R927.2

A

1001-0408（2017）24-3418-04

2017-01-02

2017-05-10）

（編輯：劉 柳）

江蘇省藥學(xué)會(huì)—奧賽康醫(yī)院藥學(xué)基金立項(xiàng)課題（No.A201616）

＊主任藥師。研究方向：醫(yī)院藥學(xué)。電話(huà)：0513-85052282。E-mail：fyfeng606@126.com

DOI10.6039/j.issn.1001-0408.2017.24.31