一株植物內(nèi)生菌的化感作用測(cè)定

郁天臣　張延浩　何中瓊

摘要 采用培養(yǎng)皿培育法，檢測(cè)加拿大一枝黃花內(nèi)生黑曲霉CHH-S1發(fā)酵菌液對(duì)4種作物種子萌發(fā)及幼苗生長(zhǎng)的影響。結(jié)果表明，內(nèi)生黑曲霉的發(fā)酵液能降低油菜、油麥菜和芝麻種子的發(fā)芽率，不同濃度的菌液可顯著抑制4種受體植物籽苗的鮮重、根長(zhǎng)和可溶性蛋白含量的增長(zhǎng)，并表現(xiàn)出一定的濃度依賴性。油麥菜和芝麻籽苗內(nèi)可溶性多糖含量受菌液刺激而增高，莧菜和油菜幼苗中的多糖含量則受到明顯抑制作用。以上結(jié)果表明，加拿大一枝黃花的內(nèi)生菌具有良好的化感作用。

關(guān)鍵詞 植物內(nèi)生菌；黑曲霉；化感作用；幼苗；發(fā)芽率

中圖分類號(hào) Q948.12 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 A 文章編號(hào) 1007-5739（2017）14-0092-03

Abstract The effects of the fermentation broth of Aspergillus niger CHH-S1，an endophytic fungus isolated from the Solidago canadensis L.，on the seed germination and seedling growth of four crops were studied by petri dish culture method.The results showed that the broth of endophytic Aspergillus niger could reduce the germination rate of rape，lettuce and sesame seeds，and different concentrations of the broth could decrease the fresh weight，root length and the content of soluble protein in four kinds of receptor plants seedlings.The effects were stronger with the broth concentration increased.The content of polysaccharide in the lettuce and sesame seedling were increased by dealing with the broth，and the contents in the leaf lettuce and rape seedlings were just inverse.These results showed that the endophytic fungus CHH-S1 of Solidago canadensis L. had allelopathic effect on other plants.

Key words endophytic fungus；Aspergillus niger；allelopathy；seedling；germination rate

化感作用是外來(lái)植物成功入侵，并造成本土生物多樣性破壞的重要機(jī)理之一[1]。加拿大一枝黃花作為一種典型入侵物種，其不同組織的水或醇提取物對(duì)小麥、玉米等多種本地植物均表現(xiàn)出明顯的化感抑制作用[2-5]，在我國(guó)已成為非常嚴(yán)重的“生態(tài)殺手”。

化感作用不僅存在于植物之間，已有研究表明，植物根際及正常組織中的微生物通過(guò)產(chǎn)生特定的代謝產(chǎn)物，也可以影響周邊植物或微生物的生長(zhǎng)[6-8]。對(duì)禾草、紫莖澤蘭等植物的研究表明，植物內(nèi)生真菌可以提高宿主植物抗逆境能力，促進(jìn)宿主種子發(fā)芽和幼苗存活，從而增強(qiáng)宿主植物對(duì)周邊植物的競(jìng)爭(zhēng)力，提高植物的入侵能力[9-10]。從核桃、胡桃、水稻及黑麥等植物中分離的內(nèi)生菌，其發(fā)酵液同樣表現(xiàn)出對(duì)小麥、稗草、豆科植物等供試植物生長(zhǎng)（芽或根）或病原菌生長(zhǎng)的抑制作用[11-15]。但尚未見(jiàn)對(duì)加拿大一枝花內(nèi)生菌作用的研究，本試驗(yàn)通過(guò)對(duì)加拿大一枝黃花內(nèi)生菌化感作用的研究，希望為進(jìn)一步了解該植物的入侵機(jī)制和開(kāi)發(fā)新型生物農(nóng)藥提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)儀器及試劑

試驗(yàn)試劑均為分析純，購(gòu)自國(guó)藥化學(xué)試劑有限公司。芝麻、油麥菜、莧菜和油菜種子購(gòu)自鎮(zhèn)江七里甸農(nóng)貿(mào)市場(chǎng)。試驗(yàn)儀器包括SW-CJ-IF超凈工作臺(tái)（蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司）、DHZ-052D恒溫震蕩搖床（上海博彩生物科技有限公司）、TGL-16G離心機(jī)（上海安亭科學(xué)儀器廠）、N-1100V旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（東京理化）和SPX-250B-D光照培養(yǎng)箱（上海予騰生物科技有限公司）。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 內(nèi)生菌株的發(fā)酵。內(nèi)生菌株CHH-S1為分離自加拿大一枝黃花莖組織的一株黑曲霉。采用PDA平板進(jìn)行菌株活化，25 ℃恒溫培養(yǎng)3～5 d。接入ME液體培養(yǎng)基中發(fā)酵，取100 mL置于250 mL錐形瓶，在28 ℃條件下120 r/min發(fā)酵14 d，過(guò)濾得到菌液和菌體。對(duì)菌液進(jìn)行重復(fù)過(guò)濾，保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 種子發(fā)芽試驗(yàn)。用2%次氯酸鈉浸泡莧菜、油麥菜、油菜和芝麻種子10 min，蒸餾水沖洗3遍，浸泡5 h后備用。在無(wú)菌的9 cm 培養(yǎng)皿中放入雙層濾紙，以2 mL發(fā)酵液浸潤(rùn)濾紙，將30粒健康種子均勻分布在濾紙上。以蒸餾水處理作為對(duì)照，每種種子做3個(gè)平行試驗(yàn)，測(cè)定其發(fā)芽率。培養(yǎng)條件設(shè)定為溫度（24±1）℃、光照周期12 h/12 h，連續(xù)培養(yǎng)6 d。記錄每天種子發(fā)芽數(shù)（以芽長(zhǎng)2 mm以上為發(fā)芽），按以下公式進(jìn)行發(fā)芽指標(biāo)測(cè)定：

發(fā)芽率（%）=（發(fā)芽的種子數(shù)/供檢測(cè)的種子數(shù)）×100；

發(fā)芽指數(shù)（GI）=∑（Gt/Dt）；

抑制率（%）=（對(duì)照組數(shù)據(jù)-處理組數(shù)據(jù)）/對(duì)照數(shù)據(jù)×100。

式中，Dt—發(fā)芽天數(shù)，Gt—與發(fā)芽天數(shù)相對(duì)應(yīng)的當(dāng)日發(fā)芽數(shù)目。endprint

1.2.3 菌株化感作用測(cè)定。將4種植物種子于20 ℃條件下水浸潤(rùn)催芽，12 h后選取發(fā)芽狀態(tài)一致的種子各30粒，以分別稀釋1倍（1/2 S1）、4倍（1/4 S1）和8倍（1/8 S1）的發(fā)酵液和無(wú)菌水分別處理4 d，觀測(cè)芽長(zhǎng)、根長(zhǎng)、根重以及芽重的差異。培養(yǎng)結(jié)束后每個(gè)培養(yǎng)皿選取10株發(fā)芽幼苗，測(cè)定各株的根長(zhǎng)、芽長(zhǎng)、株重和干重，取各組平均值進(jìn)行比較。幼芽中多糖含量采用硫酸蒽酮比色法測(cè)定，可溶性蛋白含量采用考馬斯亮藍(lán)法測(cè)定[16]。

1.3 數(shù)據(jù)分析

統(tǒng)計(jì)3組觀測(cè)值數(shù)據(jù)，并采用SPSS 18.0 統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行單因素方差分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 菌株發(fā)酵液對(duì)4種植物種子發(fā)芽的影響

CHH-S1發(fā)酵液處理4種植物種子6 d后，芝麻、油菜和油麥菜種子的相對(duì)發(fā)芽率分別為28.6%、51.2%和26.0%，明顯低于對(duì)照組，而莧菜種子的相對(duì)發(fā)芽率則略高于對(duì)照組。相對(duì)發(fā)芽指數(shù)略高于相對(duì)發(fā)芽率，但與后者有相似的變化特點(diǎn)，除莧菜種子外，其他3種作物種子的萌發(fā)均受到CHH-S1菌株發(fā)酵液的抑制（圖1）。

2.2 菌株發(fā)酵液對(duì)植物幼苗生長(zhǎng)的影響

以3種不同稀釋倍數(shù)的菌液（1/2 S1、1/4 S1和1/8 S1）分別處理作物預(yù)萌發(fā)種子，4種作物萌發(fā)幼苗的生長(zhǎng)表現(xiàn)出明顯的濃度依賴性，菌液濃度越高，萌發(fā)種子生長(zhǎng)受到的抑制作用越強(qiáng)，幼苗的長(zhǎng)度和生物量均顯著低于以蒸餾水處理的對(duì)照組（圖2、3、4）。

1/2 S1及1/4 S1的發(fā)酵液處理組的種子幾乎不見(jiàn)明顯生長(zhǎng)。1/8 S1處理后的芝麻、莧菜和油麥菜的種子雖有生長(zhǎng)，但幼芽末端變紅，根出現(xiàn)萎蔫；油菜的萌發(fā)幼苗則基本沒(méi)有生長(zhǎng)（圖2）。數(shù)據(jù)分析表明，4個(gè)種子處理組的根長(zhǎng)均與對(duì)照組根長(zhǎng)有顯著差異（P<0.05），但油菜幼苗對(duì)發(fā)酵液濃度變化敏感，且具有明顯的濃度依賴性。油麥菜和芝麻幼苗在各稀釋濃度處理組間的根長(zhǎng)則無(wú)明顯差異（圖3）。莧菜種子試驗(yàn)組中，中低濃度（1/4 S1和1/8 S1）與高濃度組間差異顯著（P<0.05）。4種植物幼苗經(jīng)不同濃度發(fā)酵液處理后，其鮮重與對(duì)照組均存在顯著差異，但均未表現(xiàn)出濃度依賴性（圖4）。

2.3 菌株CHH-S1對(duì)幼苗生理生化指標(biāo)的影響

種子萌發(fā)后，通過(guò)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的轉(zhuǎn)化以提供幼苗生長(zhǎng)所需。因此，其中的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)組成會(huì)發(fā)生一定變化。采集培育6 d后的植物幼苗，按照文獻(xiàn)[16]方法進(jìn)行組織中可溶性多糖和蛋白含量的測(cè)定。由圖5可知，菌株的各濃度菌液可以促進(jìn)油麥菜和芝麻幼苗中多糖含量增加，減少莧菜和油菜幼苗組織中可溶性多糖物質(zhì)的含量。油麥菜種子試驗(yàn)組中，籽苗中的多糖含量排列如下：1/8 S1（13.34 mg/g）>1/2 S1（13.01 mg/g）>1/4 S1（5.39 mg/g）>CK（2.72 mg/g）。芝麻種子試驗(yàn)組中，組內(nèi)兩兩之間均存在顯著差異，且1/2 S1>1/8 S1>1/4 S1，種子受菌液促進(jìn)效果最強(qiáng)（1/2 S1）時(shí)，籽苗中多糖含量為對(duì)照組的924.78%。莧菜和油麥菜種子試驗(yàn)組的中低濃度組（1/8 S1和1/4 S1）組間的多糖含量無(wú)顯著差異；高濃度處理組中，莧菜中多糖含量較對(duì)照組減少96.04%，油菜組則減少92.12%，表現(xiàn)出明顯的抑制性。

由圖6可知，油麥菜種子試驗(yàn)組中，隨著發(fā)酵液濃度的升高，蛋白含量受抑制效果不斷加強(qiáng)；1/2 S1濃度時(shí)，受抑制效果最強(qiáng)，抑制率為71.14%。油菜和莧菜種子試驗(yàn)組中，1/4 S1濃度時(shí)，蛋白含量最低，抑制率分別是61.32%和89.72%。而芝麻種子試驗(yàn)組，濃度為1/8時(shí)，蛋白含量最低，抑制率為73.60%。

3 討論

植物可以通過(guò)化感作用影響周邊其他植物的生長(zhǎng)，而存活于植物組織內(nèi)部的內(nèi)生菌可以通過(guò)提高宿主的抗病力、增強(qiáng)其對(duì)不良生態(tài)因子的耐受性等作用直接或間接促進(jìn)宿主植物的競(jìng)爭(zhēng)力，并在抑制其他植物種子萌發(fā)及幼苗生長(zhǎng)中發(fā)揮作用。楊晨從紫莖澤蘭的健康組織中分離得到多株內(nèi)生菌，其中某些優(yōu)勢(shì)內(nèi)共生真菌能促進(jìn)紫莖澤蘭種子的發(fā)芽和幼苗的存活，從而促進(jìn)宿主植物更快地建立起種群[11]。王 靜等發(fā)現(xiàn)紫莖澤蘭的部分內(nèi)生真菌表現(xiàn)出良好的除草活性，可以抑制高粱、小麥、黃瓜、油菜等作物根系的生長(zhǎng)[12]。本試驗(yàn)從加拿大一枝黃花組織中得到一株內(nèi)生黑曲霉CHH-S1，其發(fā)酵液對(duì)芝麻、油菜、莧菜和油麥菜4種作物種子發(fā)芽表現(xiàn)出一定的抑制作用，以上結(jié)果均表明入侵植物的內(nèi)生菌對(duì)宿主外受體植物具有化感作用。攜帶內(nèi)生菌的宿主植物可以表現(xiàn)出更強(qiáng)的化感作用，楊 松等發(fā)現(xiàn)披堿草內(nèi)生真菌對(duì)黑麥草、高羊茅和草地早熟禾3種草坪種子的萌發(fā)具有一定的抑制作用[17]，黃 璽等發(fā)現(xiàn)帶菌醉馬草浸提液對(duì)針茅和硬質(zhì)早熟禾的種子萌發(fā)和幼苗生長(zhǎng)有抑制作用，并且隨著質(zhì)量濃度的增加抑制作用增強(qiáng)[18]。內(nèi)生菌的發(fā)酵產(chǎn)物也具有一定的化感作用。黃湘海發(fā)現(xiàn)黑核桃內(nèi)菌生真HJI的發(fā)酵產(chǎn)物對(duì)3 種受體種子（小麥、油菜、蘿卜）生長(zhǎng)具有一定的抑制作用。王 靜等發(fā)現(xiàn)側(cè)柏內(nèi)生真菌鏈格孢菌（Alternaria alternaria）對(duì)反枝莧種子幼根的生長(zhǎng)表現(xiàn)出較強(qiáng)的抑制作用，其中有8株的抑制率在70%以上。來(lái)源于強(qiáng)化感水稻的內(nèi)生菌塔賓曲霉、粘紅酵母發(fā)酵產(chǎn)物均可顯著抑制稗草的生長(zhǎng)[15]。因此，植物內(nèi)生菌可作為潛在生物除草劑的來(lái)源。

加拿大一枝花內(nèi)生黑曲霉CHH-S1菌株的發(fā)酵液能明顯抑制4個(gè)種子籽苗的鮮重、根長(zhǎng)和蛋白含量，4種受體種子籽苗的鮮重對(duì)發(fā)酵液的濃度變化不敏感，處理組間無(wú)顯著差異（P>0.05）。菌液對(duì)籽苗根伸長(zhǎng)的抑制效果隨著濃度的降低而減弱，且4個(gè)種子處理組均與對(duì)照組間有顯著差異（P<0.05）。不同濃度的菌液對(duì)4個(gè)種子籽苗內(nèi)的蛋白含量具有顯著抑制性，且不同處理組間存在顯著差異性（P<0.05）。其中，芝麻種子對(duì)菌液的敏感性最強(qiáng)。對(duì)于多糖含量來(lái)說(shuō)，油麥菜和芝麻幼苗中的多糖物質(zhì)受菌液刺激而含量增加，但莧菜和油菜幼苗中的多糖物質(zhì)含量則受到明顯抑制作用。對(duì)于內(nèi)生菌產(chǎn)物中具體的作用物質(zhì)還需要進(jìn)一步試驗(yàn)進(jìn)行分離和檢驗(yàn)。endprint

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