2種羅布麻葉中蘆丁、金絲桃苷、異槲皮苷含量比較研究

馮春艷，卿德剛，倪慧，孫宇，張娟，賈曉光，徐建國

(1.新疆大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，烏魯木齊 830046；2.新疆維吾爾自治區(qū)中藥民族藥研究所，烏魯木齊 830002)

2種羅布麻葉中蘆丁、金絲桃苷、異槲皮苷含量比較研究

馮春艷1，卿德剛2，倪慧2，孫宇2，張娟2，賈曉光2，徐建國2

(1.新疆大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，烏魯木齊 830046；2.新疆維吾爾自治區(qū)中藥民族藥研究所，烏魯木齊 830002)

【目的】建立并測定羅布麻葉中蘆丁、金絲桃苷、異槲皮苷含量的HPLC方法，并比較2種羅布麻葉中3種黃酮成分的含量差異。為2種羅布麻質(zhì)量控制提供方法和依據(jù)。【方法】采用Symmetry Shield(250 mm× 4.6 mm，5 μm)色譜柱，在35℃條件下以乙腈-0.2%磷酸水溶液梯度洗脫，流速為1.0 mL/min，檢測波長為360 nm，進(jìn)樣量為10 μL?！窘Y(jié)果】蘆丁、金絲桃苷、異槲皮苷的線性范圍分別為0.251 1～1.255 4 μg、0.026 6～0.265 9 μg、0.235 6～1.178 0 μg，相關(guān)系數(shù)R分別為0.999 8、0.999 9、0.999 9；平均加標(biāo)回收率分別為103.6%、102.1%、104.4%，RSD均小于3.8%。大葉白麻中異槲皮苷含量最高，羅布紅麻中蘆丁含量最高，并且僅有羅布紅麻中檢測到了金絲桃苷。【結(jié)論】HPLC測定方法可用于羅布麻葉中3種黃酮成分的含量測定，2種羅布麻葉中3種黃酮成分含量差異有一定規(guī)律，羅布紅麻中異槲皮苷含量略高于大葉白麻，蘆丁含量則至少是大葉白麻的13倍，金絲桃苷含量僅為0.05%，且在大葉白麻中未檢測到金絲桃苷，研究結(jié)果可為2種羅布麻質(zhì)量控制提供方法和依據(jù)。

羅布麻；蘆丁；金絲桃苷；異槲皮苷；HPLC

0 引 言

【研究意義】羅布麻是藥食同源植物，在中國和日本均被用作茶飲?！侗静菥V目》記載，羅布麻有平心悸、止眩暈、消咳止咳、強(qiáng)心利尿之功能。現(xiàn)代藥理學(xué)研究表明，羅布麻對預(yù)防和治療高血壓、高血脂有較好療效。中國藥典[1]收載羅布麻(ApocynumvenetumL.)為羅布紅麻，由于羅布麻產(chǎn)量較少，我國市場尤其是新疆市場上廣泛存在大葉白麻(P.henderconii(Hook.f.))作為羅布紅麻代用品[2-4]。明確羅布紅麻和大葉白麻的化學(xué)成分異同，對二者的應(yīng)用及質(zhì)量控制都有積極意義。【前人研究進(jìn)展】目前，羅布麻的質(zhì)量控制主要圍繞其中的黃酮類成分進(jìn)行，包括槲皮素、金絲桃苷、白麻苷、異槲皮苷、山奈酚等。2005年版中國藥典羅布麻葉項(xiàng)下收載了槲皮素的含量測定[5]，2010年版、2015版中國藥典羅布麻葉項(xiàng)下則要求金絲桃苷含量不得低于0.30%[1、6]。另外有文獻(xiàn)報(bào)道，不同采收期、不同種屬和產(chǎn)地的羅布麻葉中黃酮類含量各有差異[3]。在研究中發(fā)現(xiàn)，蘆丁、異槲皮苷在羅布紅麻和大葉白麻中含量都較高，但僅有羅布紅麻中可檢測到金絲桃苷，同時2種羅布麻中都未檢測到槲皮素?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】大葉白麻常作為羅布紅麻的代用品，但二者的功效成分差異并不明確，研究選擇羅布麻葉中的主要功效成分建立含量測定方法并進(jìn)行定量比較?！緮M解決的關(guān)鍵問題】建立同時測定羅布麻葉中蘆丁、金絲桃苷、異槲皮苷含量的HPLC方法，并比較2種羅布麻中3種黃酮成分的含量差異。

1 材料與方法

1.1 材 料

1.1.1 儀器

Thermo U3000高效液相色譜儀，AB265-S電子天平(梅特勒-托利多公司)，水浴鍋(金壇市華峰儀器有限公司)，JY92-2D超聲波清洗儀(昆山市超聲儀器有限公司)。

1.1.2 試劑與材料

乙腈為色譜純，磷酸、乙醇等為分析純。蘆丁(含量為91.9%，100080-201610，中國藥品生物制品檢定所)、金絲桃苷(含量為94.3%，111521-201507，中國食品藥品檢定研究院)、異槲皮苷(含量為92.9%，111809-201403，中國食品藥品檢定研究院)。羅布麻(阿勒泰戈寶茶股份有限公司，ApocynumvenetumL.)，大葉白麻(百草堂大藥房、新特藥大藥房、濟(jì)康大藥房、普濟(jì)堂大藥房，P.henderconii(Hook.f.))。

1.2 方 法

1.2.1 HPLC含量測定

1.2.1.1 色譜條件

色譜柱：Symmetry Shield(250 mm× 4.6 mm，5 μm)；檢測器：VWD-3000； 流動相：乙腈-0.2%磷酸水溶液梯度洗脫(0～10 min，15%：85%；10～50 min，18%：82%)；流速：1.0 mL/min；檢測波長：360 nm；柱溫：35℃，進(jìn)樣量10 μL。

1.2.1.2 對照品溶液制備

精密稱取蘆丁、金絲桃苷、異槲皮苷適量，置50 mL容量瓶中，用50%甲醇溶解并定容，分別制成濃度為 0.125 5、0.026 6、0.117 8 mg/mL的對照品溶液，即得。

1.2.1.3 供試品溶液制備

參照藥典方法，精密稱取羅布麻葉粉末(過三號篩)0.5 g，置于圓底燒瓶中，加 50%甲醇 50 mL，稱重，80℃水浴加熱回流提取 0.5 h，提取液放冷，再次稱重，用50%甲醇補(bǔ)足減失重量，過濾，即得[1]。進(jìn)樣前需經(jīng)0.22 μm的微孔濾膜過濾。

1.2.1.4 線性關(guān)系

分別精密吸取10、8、6、4、2、1 mL的蘆丁、金絲桃苷、異槲皮苷對照品溶液于10 mL容量瓶中，加50%甲醇稀釋至刻度，搖勻，制得對照品溶液。每次取10 μL，依次進(jìn)樣。 按“1.2.1.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣，以峰面積為縱坐標(biāo)，濃度為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.2.1.5 方法學(xué)驗(yàn)證

分別進(jìn)行精密度實(shí)驗(yàn)、穩(wěn)定性試驗(yàn)、重復(fù)性試驗(yàn)、加回收率試驗(yàn)，對建立的HPLC含量方法進(jìn)行評價。

2 結(jié)果與分析

2.1 線性關(guān)系

蘆丁、金絲桃苷、異槲皮苷分別在0.125 6～1.255 4、 0.026 6～0.265 9和0.117 8～1.178 0 μg/L的范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系，回歸方程。表1

表1 3種成分線性關(guān)系

2.2 精密度

精密稱取羅布麻葉適量，制備供試品溶液，按“1.2.1.1”項(xiàng)下色譜條件連續(xù)進(jìn)樣6次。結(jié)果，蘆丁、金絲桃苷、異槲皮苷峰面積的RSD分別為0.28%、1.24%、0.16%，表明儀器在該色譜條件下精密度良好。 表2

2.3 穩(wěn)定性

精密稱取羅布麻葉適量，制備供試品溶液，室溫放置0、4、8、24 h后分別按“1.2.1.1”項(xiàng)下色譜條件測定。結(jié)果蘆丁、金絲桃苷、異槲皮苷峰面積的RSD分別為0.23%、1.08%、0.51%，表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定。表3

2.4 重復(fù)性

精密稱取同批羅布麻葉6份，制備供試品溶液，分別按“1.2.1.1”項(xiàng)色譜條件測定。結(jié)果表明，羅布麻葉中蘆丁、金絲桃苷、異槲皮苷平均含量分別為0.65%、0.05%、0.46%,RSD分別為1.63%、3.15%、2.83%，表明該方法重復(fù)性良好。表4

表2 精密度

表3 穩(wěn)定性

表4 重復(fù)性

2.5 加標(biāo)回收率實(shí)驗(yàn)

精密稱取羅布麻葉18份，6份為一組，分別制備供試品溶液，并精密加入不同體積的蘆丁、金絲桃苷、異槲皮苷對照品溶液，稱重、補(bǔ)足減失重量，按“1.2.1.1”項(xiàng)色譜條件測定。研究表明，蘆丁、金絲桃苷、異槲皮苷的平均加標(biāo)回收率分別為103.6%、102.1%、104.4，RSD值分別為2.4%、3.1%、3.8%，該方法準(zhǔn)確度較高。表5

2.6 樣品測定

分別測定9批羅布麻葉中3種黃酮成分的含量，對照品和供試品色譜圖。結(jié)果表明，6批大葉白麻中蘆丁含量最大相差2.5倍，最低、最高含量分別為0.02%、0.05%，并且均未檢測到金絲桃苷，異槲皮苷含量基本一致，在0.32%～0.38%；3批羅布紅麻中蘆丁含量分別為0.65%、0.66%、0.63%，且至少是大葉白麻的13倍，雖都檢測到了金絲桃苷，但含量僅為0.05%，遠(yuǎn)未達(dá)藥典0.30%的要求，異槲皮苷平均含量為0.45%，略高于大葉白麻。表6，圖1，圖2

表5 加標(biāo)回收率實(shí)驗(yàn)結(jié)果(n=6)

1.蘆丁 2.金絲桃苷 3.異槲皮苷

1. rutin 2. hyperoside 3.isoquercitrin

圖1 對照品HPLC色譜

Fig.1 HPLC chromatogram of reference substance

1.蘆丁 2.金絲桃苷 3.異槲皮苷

1. rutin 2. hyperoside 3.isoquercitrin

圖2 供試品HPLC色譜

3 討 論

3.1 色譜條件

為了提高色譜峰分離度并使出峰時間合理，采用乙腈-0.2%磷酸水溶液梯度洗脫的方法。由于金絲桃苷和異槲皮苷的色譜峰不易分開，曾嘗試調(diào)整乙腈比例，但二者始終不能完全分離。溫度對二者的分離有明顯改善作用，當(dāng)溫度為35℃時兩個色譜峰分離良好，分離度達(dá)4.14。綜合考慮，選擇在35℃的條件下進(jìn)行梯度洗脫。

3.2 羅布麻葉中黃酮類成分差異

對羅布紅麻和大葉白麻中蘆丁、金絲桃苷、異槲皮苷3種黃酮成分進(jìn)行了比較。結(jié)果表明，羅布紅麻中異槲皮苷含量略高于大葉白麻，蘆丁含量則至少是大葉白麻的13倍，并且羅布紅麻中金絲桃苷含量遠(yuǎn)未達(dá)到藥典0.30%的要求，而6批大葉白麻中都未檢測到金絲桃苷。石秋梅等的研究表明[2-4]，羅布紅麻中3種成分含量由高到低依次為蘆丁、異槲皮苷、金絲桃苷，大葉白麻中3種成分含量由高到低依次為異槲皮苷、蘆丁、金絲桃苷，蔡卿齡等的研究也表明[7-8]大葉白麻中金絲桃苷含量很少甚至檢測不到，這些結(jié)果與該研究結(jié)果基本一致。但是，張語遲等[9]研究認(rèn)為，蘆丁是大葉白麻的特征性成分，可以用于區(qū)分2種羅布麻。然而，研究表明羅布紅麻中的蘆丁含量高達(dá)0.65%，并且遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于大葉白麻，所以如何從化學(xué)成分的角度區(qū)分羅布紅麻與大葉白麻還需要更深入的研究。

Haijuan An等[10]對羅布紅麻和大葉白麻的黃酮成分進(jìn)行了研究，結(jié)果檢測的29批羅布紅麻中僅有4批金絲桃苷含量符合藥典0.30%的規(guī)定，定量分析結(jié)果表明金絲桃苷并不是羅布麻中含量最高的黃酮成分，這與研究結(jié)果一致。該研究結(jié)果還表明，羅布紅麻中主要黃酮成分為槲皮素-3-O -(6''-O-丙二酰)半乳糖苷、異槲皮苷、金絲桃苷，并且羅布紅麻中金絲桃苷、黃芪甙、槲皮素-3-O-(6''-O-丙二酰)半乳糖苷、槲皮素-3-O-(6''-O-乙酰)葡萄糖苷、槲皮素-3-O-(6''-O-丙二酰)葡萄糖苷含量明顯高于大葉白麻，而大葉白麻中的黃酮成分主要是槲皮素-3-O-(6''-O-丙二酰)半乳糖苷、異槲皮苷，并且未檢出三葉豆苷、槲皮素-3-O-(6''-O-乙酰)半乳糖苷、山奈酚-3-O-(6''-O-丙二酰)半乳糖苷。因此，探尋綜合評價手段來控制羅布麻質(zhì)量更有利于其安全、有效的應(yīng)用。

4 結(jié) 論

大葉白麻在新疆及毗鄰地區(qū)有較多種植，在新疆市場更是作為羅布紅麻的代用品長期存在。因此，明確2種羅布麻的化學(xué)成分、藥理活性差異，對二者安全、有效的應(yīng)用具有積極意義。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，HPLC測定方法可用于羅布麻葉中3種黃酮成分的含量測定，2種羅布麻葉中3種黃酮成分含量差異有一定規(guī)律，羅布紅麻中異槲皮苷含量略高于大葉白麻，蘆丁含量則至少是大葉白麻的13倍，金絲桃苷含量僅為0.05%，且在大葉白麻中未檢測到金絲桃苷，此研究結(jié)果可為2種羅布麻質(zhì)量控制提供方法和依據(jù)。

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Comparative Study on the Contents of Rutin, Hyperoside and Isoquercitrin in Two Kinds of Apocynum Leaves

FENG Chun-yan1, QING De-gang2, NI Hui2, SUN Yu2, ZHANG Juan2, JIA Xiao-guang2, XU Jian-guo2

(1.College of Life Science and Technology, Xinjiang University, Urumqi 830046， China;2. Xinjiang Institute of Chinese Materia Medica and Ethnodrug, Urumqi 830002, China)

【Objective】 To determine the content of rutin, hyperoside and isoquercitrin in apocynum leaf by HPLC, and compare the content of 3 flavonoids in Apocynum leaf from different sources.【Method】The assay was performed on symmetry column (250 mm×4.6 mm, 5 μm), eluted with a gradient of acetonitrile-0.2% aqueous phosphoric acid at 35℃. The rate of flow was 1.0 mL/min, detection wavelength was 360 nm, the infection volume was 10 μL. 【Result】The linear ranges of rutin, hyperoside and isoquercitrin were 0.251,1-1.255,4 μg, 0.026,6-0.265,9 μg, and 0.235,6-1.178,0 μg, and the correlation coefficients were 0.999,8, 0.999,9 and 0.999,9 respectively; The average recovery rates were 103.6%, 102.1% and 104.4%, respectively and the RSD was less than 3.8%. The content of isoquercitrin inPoacynumhendersonii(Hook. f.) Woodson was the highest，rutin inApocynumvenetumLinn was the highest ,and hypericides were detected only inApocynumvenetumLinn. 【Conclusion】HPLC method can be used to determine the content of 3 flavonoids inApocynumvenetumL. There are certain rules in the content of 3 flavonoids in two kinds ofApocynumvenetum, and the results can provide two methods and basis for quality control ofApocynumvenetum, The content of isoquercitrin in Apocynum venetum Linn is slightly higher than that of Poacynum hendersonii (Hook.f.) Woodson, the content of hyperoside is only 0.05%, no hypericides were detected in Poacynum hendersonii (Hook.f.) Woodson, and the results can provide two methods and basis for quality control of Apocynm venetum.

apocynum leaf；rutin；hyperoside；isoquercitrin；HPLC

Zhang Juan (1983-), female, Xinjiang, associate professor, master, research direction for Natural Product Research and Development. (E-mail) 372627151@qq.com

10.6048/j.issn.1001-4330.2017.07.015

2017-05-10

新疆維吾爾自治區(qū)科研機(jī)構(gòu)創(chuàng)新發(fā)展專項(xiàng)資金“中小企業(yè)健康產(chǎn)品研發(fā)與推廣”(2016D04004)，第二師科技計(jì)劃項(xiàng)目“嗎咖、肉蓯蓉等相關(guān)保健食品的開發(fā)”

馮春艷(1987-)，女，河南人，碩士生，研究方向?yàn)槭称房茖W(xué)專業(yè)，(E-mail)13807395@qq.com

張娟(1983-)，女，新疆人，副研究員，研究方向?yàn)樘烊划a(chǎn)物研究與開發(fā)，(E-mail)372627151@qq.com

S567

A

1001-4330(2017)07-1291-07

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