CellSearch系統(tǒng)檢測(cè)胃癌患者循環(huán)腫瘤細(xì)胞及臨床意義

賈海明，米泰宇，楊 雯，賈彬彬，張克玲，蒲 競(jìng)

（蘭州市第二人民醫(yī)院，甘肅 蘭州 730046）

CellSearch系統(tǒng)檢測(cè)胃癌患者循環(huán)腫瘤細(xì)胞及臨床意義

賈海明，米泰宇*，楊 雯，賈彬彬，張克玲，蒲 競(jìng)

（蘭州市第二人民醫(yī)院，甘肅 蘭州 730046）

CellSearch系統(tǒng)；胃癌；循環(huán)腫瘤細(xì)胞

循環(huán)腫瘤細(xì)胞（Circulating Tumor Cells，CTC）是指在腫瘤患者外周血中檢測(cè)到來(lái)源于實(shí)體腫瘤、逃離宿主免疫殺傷后存活的異質(zhì)性腫瘤細(xì)胞。19世紀(jì)許多學(xué)者發(fā)現(xiàn)，腫瘤細(xì)胞能通過(guò)血流傳播到遠(yuǎn)處器官[1]。1869年，Cristofanilli等[2]在惡性腫瘤患者外周血中發(fā)現(xiàn)了與原發(fā)灶腫瘤性質(zhì)相似的細(xì)胞，首次提出循環(huán)腫瘤細(xì)胞的概念。1889年，Chafer等[3]提出了“種子和土壤”假說(shuō)，解釋了腫瘤原發(fā)灶與轉(zhuǎn)移灶之間的關(guān)系。腫瘤的原發(fā)病灶往往并不致死，因腫瘤轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)所引起的死亡約占實(shí)體瘤的90%[4]。循環(huán)腫瘤細(xì)胞可能代表原發(fā)腫瘤的表型和遺傳組成，被稱為潛在的轉(zhuǎn)移性腫瘤的“液體活檢”。

CellSearch系統(tǒng)是目前自動(dòng)化程度最高的循環(huán)腫瘤細(xì)胞檢測(cè)技術(shù)，受人為因素影響較小，該系統(tǒng)集免疫磁珠富集技術(shù)和免疫熒光技術(shù)于一體，具有較高的特異性、敏感性及可重復(fù)性[5]。該系統(tǒng)是目前唯一被美國(guó)食品與藥品監(jiān)督管理局批準(zhǔn)用于轉(zhuǎn)移性乳腺癌、結(jié)直腸癌或前列腺癌循環(huán)腫瘤細(xì)胞檢測(cè)的新技術(shù)[6～8]。近年來(lái)，應(yīng)用該系統(tǒng)檢測(cè)肺癌及其他實(shí)體瘤循環(huán)腫瘤細(xì)胞的研究也越來(lái)越受重視，而且通過(guò)該系統(tǒng)分析循環(huán)腫瘤細(xì)胞分子標(biāo)記的研究也漸有嘗試。我們采用CellSearch系統(tǒng)檢測(cè)47例胃癌患者的循環(huán)腫瘤細(xì)胞，現(xiàn)報(bào)告如下。

1 對(duì)象與方法

1.1 對(duì)象

搜集2014年4月至2016年5月就診于蘭州市第二人民醫(yī)院，并經(jīng)病理證實(shí)為胃癌的患者共47例，其中女19例，男28例；年齡≤60歲者29例，＞60歲者18例；I期患者3例，Ⅱ期患者8例，Ⅲ期患者27例，Ⅳ期患者9例。慢性胃炎患者40例，其中女24例，男26例，平均年齡（54.42±8.76）歲。健康志愿者40例，其中女26例，男14例，平均年齡（47.60±10.37）歲。將以上人群作為研究對(duì)象。

1.2 儀器與設(shè)備

9541循環(huán)上皮細(xì)胞自動(dòng)樣本處理系統(tǒng)（上海寶騰生物醫(yī)藥科技有限公司）；9555循環(huán)上皮細(xì)胞結(jié)果分析系統(tǒng)（上海寶騰生物醫(yī)藥科技有限公司），包括CellSave儲(chǔ)存管、CellSearch試劑盒、CellTracks自動(dòng)處理系統(tǒng)、磁槽、CellTracks自動(dòng)分析儀。

1.3 納入標(biāo)準(zhǔn)和排除標(biāo)準(zhǔn)

納入標(biāo)準(zhǔn)：（1）經(jīng)病理學(xué)檢查確診的患者；（2）入組前未接受任何形式的抗腫瘤治療；（3）既往無(wú)其他惡性腫瘤病史；（4）自愿參與此次研究。排除標(biāo)準(zhǔn)：（1）合并終末期肝病或者腎病的患者；（2）合并全身其他惡性腫瘤的患者。

2 方法

2.1 樣本處理

空腹抽取肘靜脈血7.5m l，標(biāo)記錐形管，將每支CellSave儲(chǔ)存管中的7.5m l血液注入帶有標(biāo)記的CellTracks AutoPrep錐形管內(nèi)進(jìn)行混合，加入6.5ml稀釋緩沖液，蓋好裝有血液的Cell-Tracks AutoPrep錐形管，并顛倒混勻5次，以2 000 r/min離心10分鐘，樣本準(zhǔn)備完成1小時(shí)內(nèi)，在CellTracks AutoPrep系統(tǒng)上對(duì)試管進(jìn)行處理。

2.2 CTC無(wú)創(chuàng)性標(biāo)準(zhǔn)化檢測(cè)

系統(tǒng)自動(dòng)處理樣本，磁珠富集EpCAM陽(yáng)性細(xì)胞，細(xì)胞固定后依次加入藻紅蛋白（PE）標(biāo)記的CK81/81/9抗體、藻藍(lán)蛋白（APC）標(biāo)記的CD45抗體，使用4，6-二脒基-2-苯基吲哚（4，6-diamin-odino-2-phenylindole，DAPI）對(duì)細(xì)胞核進(jìn)行染色。處理后的樣品自動(dòng)轉(zhuǎn)入MagNest，避光孵育20分鐘后放入Analyzer系統(tǒng)進(jìn)行熒光掃描分析并還原成圖像，系統(tǒng)分選符合腫瘤細(xì)胞形態(tài)、CK的細(xì)胞供人工判讀，CK+DAPI+CD45的細(xì)胞被定義為循環(huán)腫瘤細(xì)胞。

2.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

對(duì)所獲得的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)應(yīng)用SPSS 17.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，計(jì)數(shù)資料采用χ2檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有顯著性。

3 結(jié)果

3.1 胃癌組、慢性胃炎組、健康對(duì)照組循環(huán)腫瘤細(xì)胞陽(yáng)性人數(shù)比例比較

胃癌組循環(huán)腫瘤細(xì)胞陽(yáng)性比例在術(shù)前、術(shù)后、化療前及化療后均明顯高于慢性胃炎組以及健康對(duì)照組（P＜0.05），具體見(jiàn)表1。

3.2 循環(huán)腫瘤細(xì)胞與性別、年齡的關(guān)系

調(diào)查發(fā)現(xiàn)，胃癌患者循環(huán)腫瘤細(xì)胞與性別、年齡之間無(wú)顯著相關(guān)性（P＞0.05）。

3.3 循環(huán)腫瘤細(xì)胞與腫瘤標(biāo)記物的相關(guān)性

表1 胃癌組、慢性胃炎組、健康對(duì)照組循環(huán)腫瘤細(xì)胞陽(yáng)性人數(shù)比例比較[n（%）]

研究顯示，胃癌患者循環(huán)腫瘤細(xì)胞與腫瘤標(biāo)記物CEA、CA125、CA153、CA199、CA724之間無(wú)顯著相關(guān)性（P＞0.05）。

3.4 循環(huán)腫瘤細(xì)胞與腫瘤分期的關(guān)系

I～Ⅱ期胃癌患者11例，其中4例循環(huán)腫瘤細(xì)胞陽(yáng)性（36.4%）；Ⅲ～Ⅳ期胃癌患者36例，其中24例循環(huán)腫瘤細(xì)胞陽(yáng)性（66.7%），兩組間循環(huán)腫瘤細(xì)胞陽(yáng)性率比較，差異有顯著性（P＜0.05）。T1～T2和T3～T 4期胃癌患者循環(huán)腫瘤細(xì)胞陽(yáng)性率分別為46.4%和57.9%，兩組間循環(huán)腫瘤細(xì)胞陽(yáng)性率比較，差異無(wú)顯著性（P＞0.05）。淋巴結(jié)分期為N0～N1、N2～N3胃癌患者循環(huán)腫瘤細(xì)胞陽(yáng)性率分別為46.2%、76.2%，兩組間循環(huán)腫瘤細(xì)胞陽(yáng)性率比較，差異有顯著性（P＜0.05）。無(wú)遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移（M0）的胃癌患者循環(huán)腫瘤細(xì)胞陽(yáng)性率為55.3%，有遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移（M1）的胃癌患者循環(huán)腫瘤細(xì)胞陽(yáng)性率為77.8%，兩組循環(huán)腫瘤細(xì)胞陽(yáng)性率比較，差異有顯著性（P＜0.05），具體見(jiàn)表2。

表2 循環(huán)腫瘤細(xì)胞與腫瘤分期的關(guān)系

4 討論

4.1 胃癌患者循環(huán)腫瘤細(xì)胞陽(yáng)性率分析

血液轉(zhuǎn)移是腫瘤轉(zhuǎn)移的重要途徑之一，是否存在遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移是惡性腫瘤臨床分期的判斷標(biāo)準(zhǔn)之一。雖然血液中檢測(cè)到腫瘤細(xì)胞并不意味著一定存在轉(zhuǎn)移灶，但是研究表明，循環(huán)腫瘤細(xì)胞的存在與腫瘤分期具有明顯的相關(guān)性（P＜0.05）[9]，而目前的臨床分期基于影像學(xué)或病理學(xué)檢查結(jié)果，難以精確反映轉(zhuǎn)移灶對(duì)患者治療和預(yù)后的影響。劉志東等[10]研究發(fā)現(xiàn)，外周血循環(huán)存在腫瘤細(xì)胞可被視為腫瘤TNM分期的TX狀態(tài)，作為精確臨床分期的必要補(bǔ)充，有利于對(duì)患者的預(yù)后做出更準(zhǔn)確的預(yù)測(cè)。Sastre等[11]使用CellSearch系統(tǒng)檢測(cè)大腸癌患者的循環(huán)腫瘤細(xì)胞，結(jié)果顯示，循環(huán)腫瘤細(xì)胞陽(yáng)性率與原發(fā)腫瘤部位、癌胚抗原、乳酸脫氫酶升高水平及腫瘤分化程度無(wú)關(guān)（P＞0.05），但與結(jié)腸癌的臨床分期有關(guān)（P＜0.05），且循環(huán)腫瘤細(xì)胞在結(jié)腸癌的早期即可檢測(cè)到，表明循環(huán)腫瘤細(xì)胞檢測(cè)有助于早期發(fā)現(xiàn)結(jié)腸癌及可能出現(xiàn)的微轉(zhuǎn)移。Tanaka等[12]通過(guò)CellSearch系統(tǒng)檢測(cè)125例原發(fā)性肺癌患者及25例非惡性腫瘤患者的循環(huán)腫瘤細(xì)胞，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在38例肺癌患者外周血中檢測(cè)到循環(huán)腫瘤細(xì)胞，3例非惡性腫瘤患者外周血中檢測(cè)到循環(huán)腫瘤細(xì)胞，且肺癌患者循環(huán)腫瘤細(xì)胞計(jì)數(shù)顯著高于非惡性腫瘤患者（P＜0.05），對(duì)于肺癌患者，小細(xì)胞肺癌患者循環(huán)腫瘤細(xì)胞計(jì)數(shù)顯著高于非小細(xì)胞肺癌患者（P＜0.05），且循環(huán)腫瘤細(xì)胞計(jì)數(shù)隨著疾病嚴(yán)重程度（分期）的增加而顯著增加（P＜0.05），Ⅳ期患者循環(huán)腫瘤細(xì)胞計(jì)數(shù)顯著高于Ⅰ期患者（P＜0.05），有遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移患者的循環(huán)腫瘤細(xì)胞計(jì)數(shù)顯著高于無(wú)轉(zhuǎn)移的患者（P＜0.05），這表明循環(huán)腫瘤細(xì)胞計(jì)數(shù)是診斷遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的一個(gè)標(biāo)志，但Tanaka等[12]提示，循環(huán)腫瘤細(xì)胞檢測(cè)的臨床應(yīng)用價(jià)值有待進(jìn)一步驗(yàn)證。但是，Hofman等[13]應(yīng)用 CellSearch系統(tǒng)檢測(cè)非小細(xì)胞肺癌患者循環(huán)腫瘤細(xì)胞，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，循環(huán)腫瘤細(xì)胞的存在與腫瘤分期及其組織學(xué)類型無(wú)關(guān)（P＞0.05）?？梢?jiàn)，對(duì)于循環(huán)腫瘤細(xì)胞與腫瘤臨床分期的相關(guān)性眾說(shuō)紛紜，為明確其確切意義，尚需進(jìn)一步開(kāi)展大規(guī)模、高質(zhì)量的臨床研究來(lái)驗(yàn)證。

4.2 循環(huán)腫瘤細(xì)胞檢測(cè)的應(yīng)用前景

循環(huán)腫瘤細(xì)胞標(biāo)準(zhǔn)化檢測(cè)已經(jīng)成為美國(guó)乳腺癌、前列腺癌和結(jié)腸癌等腫瘤轉(zhuǎn)移性診斷、療效檢測(cè)和預(yù)后判斷的重要依據(jù)。但是，對(duì)我國(guó)高發(fā)腫瘤——胃癌的研究卻很少。因此，本研究采用目前國(guó)際上先進(jìn)的循環(huán)腫瘤細(xì)胞無(wú)創(chuàng)性標(biāo)準(zhǔn)化檢測(cè)技術(shù)，針對(duì)我國(guó)常見(jiàn)的胃癌早期診斷標(biāo)志物進(jìn)行系列研究，獲取國(guó)人常見(jiàn)腫瘤發(fā)生、發(fā)展與轉(zhuǎn)移過(guò)程中循環(huán)腫瘤細(xì)胞的基本數(shù)據(jù)，并與血清標(biāo)志物數(shù)據(jù)進(jìn)行比對(duì)。結(jié)果表明，胃癌患者血循環(huán)腫瘤細(xì)胞陽(yáng)性率顯著高于慢性胃炎患者和健康人群（P＜0.05），而與胃癌患者的年齡、性別無(wú)明顯關(guān)系（P＞0.05），這提示循環(huán)腫瘤細(xì)胞也許可以成為診斷胃癌的血液學(xué)指標(biāo)，以提高胃癌的早期診斷率；淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及其他遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移患者的循環(huán)腫瘤細(xì)胞陽(yáng)性率高于無(wú)轉(zhuǎn)移的胃癌患者（P＜0.05），這提示血液中循環(huán)腫瘤細(xì)胞的出現(xiàn)與胃癌轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。另外，部分早期胃癌患者外周血中可查到循環(huán)腫瘤細(xì)胞，這表明早期胃癌在未出現(xiàn)明顯影像學(xué)轉(zhuǎn)移灶時(shí)已發(fā)生微轉(zhuǎn)移，這將對(duì)胃癌的診斷及制訂治療方案方面起到至關(guān)重要的作用。腫瘤臨床分期越高，循環(huán)腫瘤細(xì)胞的陽(yáng)性率越高。

4.3 循環(huán)腫瘤細(xì)胞檢測(cè)的臨床應(yīng)用價(jià)值

大量研究證實(shí)，循環(huán)腫瘤細(xì)胞與腫瘤復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移密切相關(guān)（P＜0.05），檢測(cè)循環(huán)腫瘤細(xì)胞有助于腫瘤轉(zhuǎn)移的早期診斷、臨床分期、療效監(jiān)測(cè)及預(yù)后判斷，并為腫瘤患者個(gè)體化治療提供臨床指導(dǎo)。作為一種標(biāo)準(zhǔn)化的檢測(cè)體系，CellSearch系統(tǒng)的出現(xiàn)，使得在臨床常規(guī)開(kāi)展循環(huán)腫瘤細(xì)胞檢測(cè)成為可能。此外，CellSearch系統(tǒng)以及其他的循環(huán)腫瘤細(xì)胞檢測(cè)技術(shù)也在不斷改進(jìn)和發(fā)展，這有助于我們更深入地了解腫瘤轉(zhuǎn)移的生物學(xué)特性，動(dòng)態(tài)實(shí)時(shí)地分析患者的腫瘤分子特征，為真正的個(gè)體化治療提供依據(jù)。

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（*通訊作者：米泰宇）

R735.2

：A

1671-1246（2017）17-0149-03

注：本文系甘肅省自然科學(xué)基金（145RJZA057）