雷公藤配伍減毒作用的研究

何風雷+陳貴英+彭富全+陳燕勤+郭秋平+莫國強+郭鐘慧

[摘要] 目的 觀察雷公藤的毒性作用及配伍補腎中藥后對其毒性的影響。 方法 根據(jù)動物體重，將60只SD大鼠隨機分為陰性對照組、雷公藤組、配伍組（雷公藤配伍菟絲子、枸杞子、淫羊藿），每組20只。各組大鼠連續(xù)灌胃給藥30 d，每天1次，陰性對照組大鼠給予0.5%的羧甲基纖維素鈉（CMC-Na）溶液。試驗期間，每天觀察動物的外觀體征、行為活動、腺體分泌、呼吸、糞便性狀等，每周測定體重。給藥30 d后處死動物，進行血液學、激素水平及病理學等各項檢查。 結(jié)果 與陰性對照組比較，雷公藤組大鼠體重增長遲緩（P < 0.05），血液學指標白細胞計數(shù)（WBC）、血紅蛋白（HGB）、紅細胞平均體積（MCV）、紅細胞平均血紅蛋白含量（MCH）、紅細胞平均血紅蛋白濃度（MCHC）、網(wǎng)織紅細胞數(shù)（RET）、網(wǎng)織紅細胞比率（RET%）降低（P < 0.05），中性粒細胞數(shù)（NEUT）、中性粒細胞比率（NEUT%）、淋巴細胞比率（LYMPH%）降低（P < 0.05）；性激素檢查發(fā)現(xiàn)卵泡刺激素（FSH）、黃體生成素（LH）、睪酮（TTE）降低（P < 0.05）；病理組織學檢查發(fā)現(xiàn)雄性附睪管空虛，管腔縮小，管腔內(nèi)未見精子或細胞成分。與雷公藤組比較，配伍組動物體重變化無明顯差異，動物血液學指標WBC、HGB、RET升高（P < 0.05），激素TTE升高（P < 0.05），附睪病變程度減輕。 結(jié)論 在本試驗研究條件下，雷公藤具有明顯的生殖系統(tǒng)及血液系統(tǒng)毒性作用，配伍菟絲子、枸杞子、淫羊藿可減輕其生殖系統(tǒng)及血液系統(tǒng)的毒性作用，具有明顯的配伍減毒作用。

[關鍵詞] 雷公藤；配伍減毒；生殖損傷；血液毒性

[中圖分類號] R285 [文獻標識碼] A [文章編號] 1673-7210（2017）07（c）-0010-04

[Abstract] Objective To observe the toxicity effect of Tripterygium wilfordii and the influence on the toxicity after compatibility with Chinese nourishing kidney herbs. Methods Sixty SD rats were randomly divided into negative control group， Tripterygium wilfordii group and compatibility group （Tripterygium wilfordii combined with Cuscuta chinensis， Fructus Lycii and Epimedium davidii） according to the body weight of animals， with 20 rats in each group. All groups were administrated with corresponding drugs by intragastric administration once a day for 30 days， the rats of negative control group were treated with 0.5% sodium carboxyl methyl cellulose （CMC-Na）. During the test， the physical signs， behaviors， gland secretion， respiratory and stool characters of animals were observed every day， and weight was measured every week. After 30 days， the animals were killed for the examination of hematology， hormone levels and pathology. Results Compared with the negative control group， the body weight of Tripterygium wilfordii group was grown slowly （P < 0.05）， the hematological indexes such as white blood cell count （WBC）， hemoglobin （HGB）， mean corpuscular volume （MCV）， mean corpuscular hemoglobin （MCH）， mean corpuscular haemoglobin concentration （MCHC）， reticulocyte count （RET） and RET% were decreased significantly （P < 0.05）， neutrophile granulocyte （NEUT）， NEUT% and the ratio of lymphocyte （LYMPH%） were decreased significantly （P < 0.05）； hormone examination showed that follicle-stimulating hormone （FSH）， luteinizing hormone （LH） and testosterone （TTE） were decreased （P < 0.05） in the Tripterygium wilfordii group； histopathologic examination showed that the male ductus epididymis was empty， the lumen was narrow， and no sperm or cell components in the lumen were found in the Tripterygium wilfordii group. Compared with Tripterygium wilfordii group， the body weight of compatibility group showed no significant difference， the hematology indexes such as WBC， HGB and RET were increased （P < 0.05）， TTE level was increased （P < 0.05） and the degree of epididymal lesions was reduced in compatibility group. Conclusion Under the experimental conditions， Tripterygium wilfordii has obvious toxic effects on reproductive system and blood system. Compatibility of Cuscuta chinensis， Fructus Lycii and Epimedium davidii can reduce the toxicity of Tripterygium wilfordii on reproductive system and blood system， which has obvious effects of attenuated toxicity by compatibility.

[Key words] Tripterygium wilfordii； Attenuated toxicity by compatibility； Reproductive damage； Hematotoxicity

國家食品藥品監(jiān)督管理總局自2007年來積極采取了多項措施，鼓勵或要求對上市后藥品開展再評價工作，特別是國務院頒發(fā)了《國家藥品安全十二五規(guī)劃》，著重強調(diào)了藥物再評價。目前復方中藥物配伍多以藥效的協(xié)同增效以及減毒作用為依托。市場常見的治療關節(jié)炎的免疫抑制劑多為雷公藤制劑[1-2]，但是雷公藤在發(fā)揮藥效的同時，對機體的消化系統(tǒng)及生殖系統(tǒng)會產(chǎn)生毒性作用[3-4]，因此降低其毒性，保證其用藥安全具有重要意義。本研究觀察了雷公藤的毒性作用，并進行了配伍減毒的研究。

1 材料與方法

1.1 藥物

雷公藤木部水提物由廣州陳李濟藥廠有限公司提供（批號：10021）；雷公藤配伍菟絲子、枸杞子、淫羊藿的復方由廣州陳李濟藥廠有限公司提供（批號：TG1081）。

1.2 試驗動物

SD大鼠，4～5周齡，SPF級，雌雄各半，體重120～160 g，由廣東省醫(yī)學實驗動物中心供給。實驗動物合格證號：SCXK（粵）2013-0004；飼養(yǎng)環(huán)境：每天12 h照明/12 h黑暗交替，溫度（24±2）℃，相對濕度50%～60%。

1.3 試劑

凝血質(zhì)控（批號：548192）、凝血酶原時間（PT）（批號：545388）、凝血酶時間（TT）（批號：40621）、纖維蛋白原（Fib）（批號：40678）均由美國DADE BEHRING公司提供；血液質(zhì)控（批號：12280802）、白細胞溶血素（批號：R1025）、白細胞染液（批號：R1056）、血紅蛋白（HGB）溶血素（批號：1007）、網(wǎng)織紅細胞（RET）試劑盒（批號：ZA1025）均由日本Sysmex公司提供。促性腺激素釋放激素（GnRH）、卵泡刺激素（FSH）、黃體生成素（LH）、睪酮（TTE）酶聯(lián)免疫吸附測定（ELISA）試劑盒均由武漢伊萊瑞特生物科技有限公司提供。

1.4 儀器

電子天平（北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司），3-18K高速冷凍離心機（德國Sigma公司），Sysmex2000iv型全自動血液分析儀（日本Sysmex公司），Sysmex CA-510型凝血儀（日本Sysmex公司），RM2235型切片機（德國Leica公司），BX 41、BH-2型生物熒光顯微鏡（日本 Olympus公司）。

1.5 方法

選取檢疫合格的SD大鼠60只，按體重隨機分成三組，分別為陰性對照組、雷公藤組和配伍組（雷公藤配伍菟絲子、枸杞子、淫羊藿）。陰性對照組給予0.5%羧甲基纖維素鈉（CMC-Na）溶液，雷公藤劑量為0.512 g/kg（按體表面積換算法換算為等效劑量的4倍），菟絲子、枸杞子、淫羊藿配伍劑量為0.648 g/kg（按體表面積換算法換算為等效劑量的4倍）。各組動物的給藥體積均為10 mL/kg。每天1次，共給藥30 d。給藥30 d后處死動物，進行血液學、激素水平及病理學等各項檢查。

1.6 觀察指標

1.6.1 一般狀況及體重測定 試驗期間，每天觀察動物的外觀體征、行為活動、腺體分泌、呼吸、糞便性狀等。每周稱1次體重，觀察雷公藤提取物及配伍藥物對大鼠體重變化的影響。

1.6.2 血液學檢測 末次給藥后，各組大鼠禁食16～20 h，用20%烏來糖0.75 mL/100 g麻醉，腹主動脈取血。凝血功能指標PT、部分凝血激酶時間（APTT）、TT、Fib用0.109 mol/L的枸櫞酸鈉（和血液的體積比為1∶9）抗凝，3600 r/min（離心半徑13.5 cm），20℃離心15 min，用凝血儀測定；白細胞、紅細胞和血小板體系相關指標以EDTA抗凝，2000 g離心15 min，取血漿，用全自動血液分析儀測定。

1.6.3 性激素水平檢測 采用ELISA試劑盒，按試劑盒說明書操作，分別測定雄性大鼠血清中GnRH、FSH、LH和TTE的含量。

1.6.4 附睪組織病理學檢查 將附睪組織用10%中性福爾馬林固定，酒精脫水，石蠟包埋，2～3 μm切片，常規(guī)蘇木素-伊紅（HE）染色封片，光學顯微鏡下檢查。

1.7 統(tǒng)計學方法

所有實驗數(shù)據(jù)均采用Graphpad Prism 5軟件進行統(tǒng)計處理，所得結(jié)果均以均數(shù)±標準差（x±s）表示。進行方差分析，如F值有顯著性差異，用Dunnett-t檢驗進行組間比較。以P < 0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 雷公藤提取物及配伍藥物連續(xù)灌胃給藥30 d對大鼠一般狀況及體重的影響

灌胃給藥30 d后，陰性對照組及各給藥組動物未見外觀體征、行為活動、腺體分泌、糞便性狀、呼吸等異常變化。與陰性對照組比較，雷公藤組大鼠體重增長遲緩（P < 0.05），配伍組動物體重明顯增加，與陰性對照組比較差異無統(tǒng)計學意義（P > 0.05）。見表1。

2.2 雷公藤提取物及配伍藥物連續(xù)灌胃給藥30 d對大鼠血液學指標的影響

灌胃給藥30 d后，與陰性對照組比較，雷公藤組大鼠白細胞計數(shù)（WBC）、HGB、紅細胞平均體積（MCV）、紅細胞平均血紅蛋白含量（MCH）、紅細胞平均血紅蛋白濃度（MCHC）、RET、網(wǎng)織紅細胞比率（RET%）降低（P < 0.05），中性粒細胞數(shù)（NEUT）、中性粒細胞比率（NEUT%）、淋巴細胞比率（LYMPH%）降低；與雷公藤組比較，配伍組大鼠WBC、HGB、RET升高（P < 0.05），其余指標未見明顯差異（P > 0.05）。見表2。

2.3 雷公藤提取物及配伍藥物連續(xù)灌胃給藥30 d對雄性大鼠生殖系統(tǒng)的影響

灌胃給藥30 d后，與陰性對照組比較，雷公藤組大鼠出現(xiàn)附睪管空虛、管腔縮小、管腔內(nèi)未見精子或細胞成分；與雷公藤組比較，配伍組大鼠附睪病變程度減輕。見圖1～2。

2.4 雷公藤提取物及配伍藥物連續(xù)灌胃給藥30 d對雄性大鼠性激素水平的影響

灌胃給藥30 d后，與陰性對照組比較，雷公藤組大鼠血清中FSH、LH和TTE明顯降低（P < 0.05）。與雷公藤組比較，配伍組大鼠激素TTE明顯升高（P < 0.05）。見表3。

3 討論

雷公藤及其配伍菟絲子、枸杞和淫羊藿的復方是廣州陳李濟藥廠有限公司提供的受試藥物，參考我國《藥物非臨床研究質(zhì)量管理規(guī)范》和委托方提供的與受試物相關的信息和相關文獻資料，在GLP條件下，本研究進行了雷公藤及其配伍補腎中藥的毒性作用研究，旨在觀察連續(xù)30 d給予藥物對大鼠產(chǎn)生的毒性反應及嚴重程度，以及配伍能否降低其毒性，為臨床設計人用安全劑量和主要監(jiān)測指標提供參考，也為藥物二次開發(fā)及多次給藥進行風險評價。雷公藤及其制劑的毒性反應主要表現(xiàn)為對消化系統(tǒng)、血液系統(tǒng)和生殖系統(tǒng)的損害[5-7]，本研究主要從血液系統(tǒng)和生殖系統(tǒng)毒性入手，考察配伍補腎中藥能否減輕其毒性。

雷公藤對血液系統(tǒng)的毒性反應主要表現(xiàn)為白細胞、紅細胞、血小板減少，以粒細胞減少最為常見[8-10]。研究發(fā)現(xiàn)，連續(xù)4周給予雷公藤提取物后，大鼠的WBC、HGB都有降低[11]。本研究中，血液學指標的結(jié)果發(fā)現(xiàn)，配伍補腎藥物組大鼠的HGB、RET和WBC增多，表明配伍補腎藥物可從一定程度上減輕雷公藤對血液系統(tǒng)的毒性。

據(jù)報道，雷公藤對生殖系統(tǒng)的毒性反應最為嚴重[12-14]。雷公藤對雄性動物的毒性反應主要表現(xiàn)為附睪尾內(nèi)未成熟精子率及畸形精子率升高，睪丸和附睪發(fā)生明顯的病理變化；雌性動物則表現(xiàn)為動情周期紊亂，卵巢和子宮發(fā)生明顯的病理變化[15]。本研究中，病理研究發(fā)現(xiàn)，雷公藤組雌性大鼠卵母細胞發(fā)育異常，卵巢閉鎖卵泡數(shù)量增加，各級卵母細胞均見減少，黃體數(shù)量亦減少，雄性大鼠附睪管空虛，管腔縮小，管腔內(nèi)未見精子或細胞成分；而配伍補腎中藥組雄性大鼠可見附睪病變程度減輕。激素水平的結(jié)果也發(fā)現(xiàn)，雷公藤組雄性大鼠FSH、LH、TTE降低；配伍補腎藥物后，雄性動物的TTE水平升高。這些結(jié)果提示配伍補腎藥物可減輕雷公藤對生殖系統(tǒng)的毒性。

中藥配伍是降低有毒中藥毒性的主要途徑之一[16-18]。有研究用補腎中藥六味地黃丸干預雷公藤多苷導致的雄性幼鼠生殖損傷，結(jié)果表明，補腎中藥組睪丸病理改變較雷公藤多苷組為輕，提示補腎中藥可以降低雷公藤對生殖系統(tǒng)的毒性反應[19]。補腎中藥也能減輕雷公藤多苷對雌性幼鼠生殖能力的損傷[20]。本研究將雷公藤與菟絲子、枸杞和淫羊藿配伍，觀察其對大鼠生殖毒性相關指標的影響。結(jié)果顯示，雷公藤配伍上述中藥后，動物體重、附睪的病理改變均得到不同程度的緩解，其機制可能與降低FSH、LH和T的分泌有關。

總之，在本研究條件下，雷公藤具有明顯的生殖系統(tǒng)及血液系統(tǒng)的毒性作用。配伍菟絲子、枸杞子、淫羊藿可減輕其對生殖系統(tǒng)及血液系統(tǒng)的毒性作用，具有明顯的配伍減毒作用。

[參考文獻]

[1] 李凌漢，麥培根，陳寶紅.雷公藤多甙聯(lián)合免疫抑制劑治療類風濕關節(jié)炎療效及對炎性因子的影響[J].現(xiàn)代中西醫(yī)結(jié)合雜志，2017，26（10）：1088-1090.

[2] 李金全，運乃茹，溫學紅.雷公藤多苷在常見自身免疫性疾病中的臨床應用及安全性[J].醫(yī)學綜述，2016，22（19）：3850-3854.

[3] 張喆，張志勇.雷公藤的毒理作用及增效減毒配伍的研究進展[J].中國藥房，2008，19（9）：705-707.

[4] 薛璟，賈曉斌，譚曉斌，等.雷公藤的肝毒性研究及ADME/Tox評價思路[J].中草藥，2009，40（4）：655-658.

[5] 孫鳳，楊興華，馬冬梅，等.雷公藤用藥者消化系統(tǒng)不良事件發(fā)生率的Meta分析[J].中國藥房，2014，23（7）：843-852.

[6] 李志霞，馬冬梅，楊興華，等.雷公藤用藥者血液系統(tǒng)不良事件發(fā)生率的Meta分析[J].中國中藥雜志，2015，40（2）：339-345.

[7] 趙莉，袁玉麗，周玲玲，等.基于“異類相制”的雷公藤復方對小鼠精母細胞凋亡及凋亡蛋白表達的影響[J].中國實驗方劑學雜志，2016，22（2）：122-125.

[8] 張玉萌，朱麗萍.雷公藤制劑致肝毒性、生殖毒性和血液系統(tǒng)毒性不良反應回顧性分析[J].中草藥，2014，11（3）：173-176.

[9] 劉苗，孟凡慧，張玉萌.雷公藤制劑致血液毒性反應的回顧性分析及臨床護理啟示[J].中醫(yī)臨床研究，2014，6（24）：125-126.

[10] 鄒愛英，劉秀書.雷公藤多苷片的不良反應及防治對策[J].天津藥學，2008，20（1）：25.

[11] 孔維鋼，夏素霞，包玉龍，等.雷公藤提取物配伍甘草提取物對正常大鼠血液生化學指標的影響[J].中國醫(yī)藥指南，2012，10（27）：79-80.

[12] 黃鄭雋，闕慧卿，朱惠，等.雷公藤甲素對生殖系統(tǒng)毒性的研究進展[J].藥物評價研究，2013，36（3）：224-227.

[13] 雷夏凌，黃元鏗，郭秋平，等.雷公藤提取物對雄性大鼠生殖系統(tǒng)毒性[J].中國藥理學與毒理學雜志，2013，27（3）：585.

[14] 黃鄭雋，闕慧卿，彭華毅，等.雷公藤內(nèi)酯醇對雄性大鼠的生殖毒性及其機制研究[J].中國中藥雜志，2015，40（23）：4655-4659.

[15] 梁策，高慧.雷公藤制劑致卵巢早衰的研究進展[J].中華中醫(yī)藥雜志，2015，30（10）：3588-3590.

[16] 趙莉，周學平.中藥配伍減輕雷公藤生殖毒性的研究進展[J].中華中醫(yī)藥雜志，2015，30（2）：482-484.

[17] 許坡，孟楣，張靜，等.基于“性味理論”探討雷公藤配伍減生殖毒性的研究進展[J].中國藥房，2016，27（10）：1412-1415.

[18] 曹玲娟，顏苗，李煥德，等.雷公藤致肝損傷及與甘草配伍減毒機制的研究進展[J].中國中藥雜志，2015，40（13）：2537-2541.

[19] 景曉平，丁櫻，何麗.補腎中藥對雷公藤多苷所致雄性幼鼠生殖損傷的保護作用及最終生育能力的影響[J].中國實驗方劑學雜志，2013，19（20）：230-233.

[20] 許靜云，李春麗，李園園.補腎中藥干預雷公藤多苷致雌性幼鼠生殖損傷的實驗研究[J].中國現(xiàn)代藥物應用，2015，9（16）：265-267.