利用非線性化學(xué)指紋圖譜法檢測奶粉中摻雜的尿素含量

馬永杰，包洪亮，董文賓

（1.洛陽師范學(xué)院食品與藥品學(xué)院，河南 洛陽 471000；2.陜西科技大學(xué)化學(xué)與化工學(xué)院，陜西 西安 710021；3.洛陽師范學(xué)院數(shù)學(xué)科學(xué)學(xué)院，河南 洛陽 471000）

利用非線性化學(xué)指紋圖譜法檢測奶粉中摻雜的尿素含量

馬永杰1,2，包洪亮3，董文賓2

（1.洛陽師范學(xué)院食品與藥品學(xué)院，河南 洛陽 471000；2.陜西科技大學(xué)化學(xué)與化工學(xué)院，陜西 西安 710021；3.洛陽師范學(xué)院數(shù)學(xué)科學(xué)學(xué)院，河南 洛陽 471000）

采用“硫酸-丙二酸-溴酸鈉-溴化鈉-硫酸鈰銨”為振蕩體系，利用非線性化學(xué)指紋圖譜法測定奶粉中摻雜的尿素。先向奶粉中摻入不同量的尿素，配成摻雜尿素的奶粉標(biāo)樣，每份奶粉標(biāo)樣的總量為1.00 g。通過非線性化學(xué)指紋圖譜法對奶粉標(biāo)樣進(jìn)行測定，運用最小二乘法，擬合出誘導(dǎo)時間相對于奶粉中摻雜尿素含量之間的一元線性關(guān)系，可求出奶粉中摻雜的尿素含量。實驗表明該方法可以達(dá)到以下指標(biāo)：當(dāng)奶粉中摻雜的尿素含量在0～40.00 mg/g范圍內(nèi)時，尿素含量與誘導(dǎo)時間線性關(guān)系良好，相關(guān)系數(shù)R2為0.996 6和0.999 5，回收率為95.48%～104.06%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差不大于1.82%，奶粉1#檢出限為3.3×10-4mg/g，奶粉2#檢出限為4.5×10-4mg/g，奶粉3#檢出限為1.1×10-4mg/g。方法準(zhǔn)確度高，操作簡單，是一種切實可行的測定奶粉中摻雜尿素的方法，也可作為復(fù)雜樣本中其他成分定量分析借鑒的方法。

非線性化學(xué)指紋圖譜；奶粉；線性回歸法；尿素含量測定

嬰兒階段是人生中最重要的生理階段，此時期生長發(fā)育旺盛，需要攝入大量且易于消化吸收的營養(yǎng)全面的物質(zhì)[1]。母乳無疑是嬰兒最理想的天然食品。當(dāng)母乳缺乏時，以牛乳或羊乳為基乳的嬰幼兒配方奶粉就成為母乳的替代品，用來補充嬰幼兒的營養(yǎng)需求[2]。最近幾年，隨著乳品工業(yè)的快速發(fā)展及消費者對乳品需求量的逐年上升，乳品中摻雜尿素、淀粉、蛋白粉、糊精及三聚氰胺等物質(zhì)的現(xiàn)象越來越嚴(yán)重。

尿素又名脲，學(xué)名為碳酰胺，其水溶液呈中性，是有機(jī)氮肥中的一種。在乳及乳制品中摻雜尿素，可以增加乳中的氮含量，進(jìn)而提高蛋白質(zhì)檢測含量和增加密度。尿素在乳制品行業(yè)中具有十分重要的地位，它可以在乳及乳制品中自然產(chǎn)生[3-4]，其含量范圍為0.18～0.40 mg/g[5]。據(jù)文獻(xiàn)[6-9]報道，尿素在乳及乳制品中的含量應(yīng)低于0.70 mg/g[7]，如果乳中的尿素含量超過正常范圍，能導(dǎo)致許多健康問題，如潰瘍、癌癥、消化不良、胃酸、腎功能疾病等。因此，尿素的檢測和評價在乳品行業(yè)、食品加工技術(shù)及臨床分析中都具有十分重要的意義。

目前，利用光譜和色譜建立的指紋圖譜技術(shù)，因其具有整體性、關(guān)聯(lián)性和模糊分析等特點，比較適合在食品或藥品中應(yīng)用[10]。其中常用的指紋圖譜技術(shù)有高效液相色譜[11]、超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜[10]、紫外、紅外和近紅外[12]等。如利用色譜法、紫外分光光度法及紅外光譜分析法等檢測乳及乳制品中的尿素[13]。這些方法多數(shù)存在樣品前處理復(fù)雜，且要求熟練的技術(shù)人員才能完成等問題。為此，探索一種既簡單、快速，又無需分離和提純測定奶粉中摻雜尿素的方法十分必要。

B-Z（Belousov&Zhabotinsky）振蕩反應(yīng)的發(fā)現(xiàn)促使人們開始對非線性化學(xué)反應(yīng)現(xiàn)象進(jìn)行研究[14]。非線性化學(xué)指紋圖譜是一種建立在非平衡化學(xué)理論基礎(chǔ)之上的動力學(xué)指紋圖譜，其反應(yīng)包括化學(xué)振蕩、化學(xué)湍流、化學(xué)斑圖和化學(xué)波等許多化學(xué)混沌現(xiàn)象[14-15]。對于非線性化學(xué)的反應(yīng)機(jī)理[15-16]和應(yīng)用[17-19]，國內(nèi)外學(xué)者已經(jīng)進(jìn)行了較為廣泛而深入的研究，并報道了許多研究成果[20-23]。采用非線性化學(xué)指紋圖譜法測定啤酒中乙醇含量已有報道[24]，但是利用非線性化學(xué)指紋圖譜法對奶粉中摻雜尿素的檢測鮮見報道。

因此，本研究基于“硫酸-丙二酸-溴酸鈉-溴化鈉-硫酸鈰銨”為振蕩體系，采用非線性化學(xué)指紋圖譜技術(shù)，利用最小二乘法建立特征參數(shù)與摻雜尿素含量的定量評價模型，對嬰幼兒配方奶粉中摻雜的尿素進(jìn)行定量分析和質(zhì)量評價。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

所用嬰幼兒配方奶粉（簡稱“奶粉”）由陜西省產(chǎn)品質(zhì)量監(jiān)督檢驗研究所提供。4 種品牌奶粉樣品分別為奶粉1#、奶粉2#、奶粉3#和奶粉4#，奶粉5#與奶粉1#同品牌但不同批次。

1.00 mol/L硫酸、1.00 mol/L丙二酸、0.01 mol/L溴化鈉、0.80 mol/L溴酸鈉、0.05 mol/L硫酸鈰銨溶液、尿素（均為分析純） 天津市福晨化學(xué)試劑廠；水為二次蒸餾水。

1.2 儀器與設(shè)備

MZ-1B-2型非線性化學(xué)指紋圖譜測定儀 湖南尚泰測控科技有限公司；217型復(fù)合甘汞電極、213型金屬鉑電極、BS 224 S型電子天平 上海精密科學(xué)儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 奶粉標(biāo)準(zhǔn)樣品系列配制

取6 份奶粉1#，分別加入0、5.00、10.00、20.00、30.00、40.00 mg的尿素，配成摻雜尿素的奶粉標(biāo)樣，每份標(biāo)樣的總量為1.00 g。奶粉2#、奶粉3#、奶粉5#摻雜尿素的奶粉標(biāo)樣的配制方法同奶粉1#。

1.3.2 標(biāo)樣定量信息測定與回歸方程模型建立

取1.00 g上述奶粉1#標(biāo)樣于反應(yīng)器中，分別加入1.00 mol/L硫酸溶液25.00 mL、1.00 mol/L丙二酸溶液10.00 mL、0.05 mol/L硫酸鈰銨溶液3.00 mL、0.01 mol/L溴化鈉溶液1.00 mL和15.00 mL蒸餾水。蓋好帶注射孔和電極的反應(yīng)器蓋。打開恒溫系統(tǒng)調(diào)節(jié)反應(yīng)器，溫度設(shè)為50 ℃，恒速攪拌設(shè)定為800 r/min，點擊菜單采集數(shù)據(jù)，攪拌到3.00 min時用注射器迅速加入0.80 mol/L溴酸鈉溶液5.00 mL。記錄E-t曲線至電位E不再隨時間t變化為止。所測奶粉指紋圖譜的定量參數(shù)如誘導(dǎo)時間、最大波幅和振蕩周期等由Matlab（Ver.7.11.2010b）軟件處理。采用最小二乘法來建立定量參數(shù)與摻雜尿素含量之間的一元線性回歸模型。

1.3.3 未知試樣的測定

準(zhǔn)確稱取1.00 g奶粉樣品于反應(yīng)器中，采用1.3.2節(jié)方法，測定指紋圖譜，利用Matlab軟件處理所測奶粉指紋圖譜的誘導(dǎo)時間，通過所建立的一元線性回歸模型計算奶粉中摻雜的尿素含量。

2 結(jié)果與分析

2.1 非線性化學(xué)指紋圖譜技術(shù)的分析原理

根據(jù)化學(xué)振蕩原理，在酸性介質(zhì)封閉條件下，丙二酸為有機(jī)底物，為氧化劑，Ce4+為催化劑，構(gòu)成穩(wěn)定的H2SO4-振蕩體系。在反應(yīng)過程中被還原為Ce3+，被還原為，其中HBrO2具有自催化作用，它的生成與消失影響著的進(jìn)一步還原產(chǎn)物Br-和金屬離子氧化產(chǎn)物Ce4+濃度的變

化，隨著Ce4+濃度消耗和Br-濃度累積至一定值，能引發(fā)體系一系列氧化-還原反應(yīng)的發(fā)生，當(dāng)Ce4+濃度累積和Br-濃度消耗至一定值時，同樣引發(fā)體系一系列氧化-還原反應(yīng)的發(fā)生，于是形成體系氧化還原值的周期性變化[25-26]。在封閉體系中，沒有外界能量的補充，隨著體系內(nèi)能量不斷耗散，振蕩最終停止。由于不同的奶粉組成成分和含量不同，當(dāng)將其加入到此振蕩體系時，使有機(jī)底物的組分發(fā)生改變，從而對振蕩體系會起到促進(jìn)或抑制作用。不同奶粉因其化學(xué)成分的氧化還原性存在差異，其促進(jìn)或抑制作用不同，因此所得相應(yīng)奶粉的非線性化學(xué)指紋圖譜的形狀和可量化信息存在差異。

2.2 奶粉非線性化學(xué)指紋圖譜的基本信息和重復(fù)性

圖1 奶粉4#非線性化學(xué)指紋圖譜的基本特征信息（A）及重復(fù)性（B）Fig. 1 Basic characteristic information about the nonlinear chemical fingerprint of milk powder 4# (A) and reproducibility (B)

非線性化學(xué)指紋圖譜擁有豐富的直觀信息和可量化信息，其直觀信息中包含誘導(dǎo)曲線、波動曲線、波峰形狀和電位漂移曲線等[22]；而可量化信息包括許多特征參數(shù)，如圖1所示，其中誘導(dǎo)時間（tind）是指第1波峰開始出現(xiàn)的時間[14]。由圖1B可知，對于同一品牌奶粉，因其成分的組分和含量一致，故指紋圖譜的重復(fù)性很好，相似度很高。

2.3 奶粉摻雜尿素定量測定結(jié)果

由于不同品牌奶粉的成分種類和含量存在差異，當(dāng)摻雜不同量的尿素時，相應(yīng)的奶粉指紋圖譜表現(xiàn)出相應(yīng)的差異。其定量信息如誘導(dǎo)時間、停波時間、波動周期或最大波幅等與奶粉中尿素含量之間可能呈線性關(guān)系。這要根據(jù)實際樣品，利用非線性化學(xué)指紋圖譜技術(shù)測定其非線性化學(xué)反應(yīng)的動力學(xué)信息之后來決定。本實驗以奶粉1#為檢測樣本，結(jié)果表明，當(dāng)尿素含量在0～40.00 mg/g時，奶粉1#的指紋圖譜的定量參數(shù)誘導(dǎo)時間與尿素含量呈良好的線性關(guān)系，當(dāng)尿素含量超過40.00 mg/g時，不呈線性，如圖2所示。

圖2 奶粉1#中摻雜的尿素含量對非線性化學(xué)指紋圖譜誘導(dǎo)時間的影響Fig. 2 Effects of urea content in milk powder 1# on induction time of nonlinear chemical fingerprint

當(dāng)向純奶粉中加入不同含量的尿素時，其摻雜奶粉指紋圖譜特征與純奶粉的特征明顯不同。為此，本實驗通過向奶粉中加入不同含量的尿素，測定摻雜奶粉的指紋圖譜，利用這些指紋圖譜的特征參數(shù)與摻雜奶粉中尿素含量之間的線性回歸關(guān)系模型，對相應(yīng)奶粉進(jìn)行鑒別和摻雜含量的定量評價。

2.4 不同摻雜量對奶粉指紋圖譜特征信息的影響

圖3 尿素的含量對奶粉1#非線性化學(xué)指紋圖譜誘導(dǎo)時間的影響（a）及局部圖形（b）Fig. 3 Effects of urea content on induction time of nonlinear chemical fingerprint of milk powder 1# and corresponding local graph

圖3 b為圖3a相應(yīng)指紋圖譜分別在180～300 s時的部分誘導(dǎo)曲線和波動曲線圖，由圖3b可知，隨著尿素含量的增加，相應(yīng)的指紋圖譜的誘導(dǎo)時間在逐漸延長，同時每個圖譜出第1個峰的時間也存在差異，圖中如箭頭所示。這是因為隨著尿素加入量的增加，改變了反應(yīng)底物的組分，尿素含量對非線性化學(xué)反應(yīng)的抑制作用在增強，從而導(dǎo)致相應(yīng)的誘導(dǎo)時間存在差異。當(dāng)奶粉中摻雜的尿素含量在0～40.00 mg/g范圍時，奶粉1#的非線性化學(xué)指紋圖譜的特征參數(shù)誘導(dǎo)時間與相應(yīng)奶粉中摻雜尿素的含量之間呈良好的線性關(guān)系，其回歸方程為tind=0.115 2C+ 249.07，相關(guān)系數(shù)R2為0.998 7。這些信息為測定奶粉中摻雜的尿素含量提供了必要條件。

2.5 定量實驗結(jié)果

圖4 尿素的含量對奶粉2#（A、B）、3#（C、D）非線性化學(xué)指紋圖譜誘導(dǎo)時間的影響Fig. 4 Effects of urea content on induction time of nonlinear chemical fingerprint of milk powder samples 2# and 3#

為了進(jìn)一步驗證實驗的可行性和可靠性，分別取奶粉2#和奶粉3#，人為向奶粉中分別加入0、5.00、10.00、20.00、30.00 mg和40.00 mg尿素，每份奶粉標(biāo)樣的總量為1.00 g，按照1.3.2節(jié)，奶粉2#和奶粉3#中尿素?fù)诫s量對指紋圖譜特征信息的影響分別見圖4（圖中的箭頭表示第1個峰的位置）。當(dāng)奶粉2#和奶粉3#分別摻雜尿素含量在0～40.00 mg/g范圍時，相應(yīng)奶粉指紋圖譜誘導(dǎo)時間與尿素含量之間的回歸方程分別為tind=-0.420 6C+257.3和tind=-0.774 5C+273.10，相關(guān)系數(shù)R2分別為0.999 5和0.996 6，如表1所示。

表1 利用非線性化學(xué)指紋圖譜法檢測奶粉中摻雜的尿素含量檢測結(jié)果Table 1 Results of urea determination in adulterated milk powder samples by nonlinear chemical fingerprint method

圖5 尿素含量對奶粉5#非線性化學(xué)指紋圖譜的影響Fig. 5 Effects of urea content on nonlinear chemical fingerprint of milk powder 5#

取奶粉5#，人為向奶粉中分別加入6.00、12.00 mg/g和23.00 mg/g尿素，每個樣品平行測定3 次。奶粉5#中分別摻雜6.00、12.00 mg/g和23.00 mg/g尿素的非線性化學(xué)指紋圖譜見圖5。這進(jìn)一步說明混合奶粉的重復(fù)性非常好。由驗證實驗可知，利用非線性指紋圖譜法測定奶粉中摻雜尿素的含量，其方法可行，同時此方法用回歸方程代替長期保存的同品牌奶粉標(biāo)樣，當(dāng)檢測與奶粉標(biāo)樣同品牌不同批次的奶粉時，只要利用非線性化學(xué)指紋圖譜法測出該品牌奶粉的圖譜信息，代入相應(yīng)擬合的方程，就可以對該奶粉的質(zhì)量進(jìn)行分析鑒定。

2.6 非線性化學(xué)指紋圖譜法測定奶粉中摻雜的尿素含量利用非線性化學(xué)指紋圖譜法，按照1.3.2節(jié)，測定奶粉1#中摻雜不同量尿素的非線性化學(xué)指紋圖譜，通過相應(yīng)的擬合方程，可求出相應(yīng)奶粉中摻雜的尿素含量，如表2所示。

表2 利用非線性化學(xué)指紋圖譜法檢測奶粉1#中摻雜的尿素含量Table 2 Results of urea determination in adulterated milk powder 1# by nonlinear chemical fingerprint method

由表2可知，測定結(jié)果的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差不大于1.82%，說明該方法的精確度較好，回收率在95.48%～104.06%之間，說明該方法的準(zhǔn)確度較高。此方法完全可用于奶粉中尿素含量的檢測，其方法可行，同時還可以為樣品中其他摻雜物質(zhì)的含量測定提供參考。

2.7 奶粉中摻雜尿素含量的檢出限結(jié)果

根據(jù)檢出限的計算方法[12,27-29]，檢出限為3 倍噪聲大小響應(yīng)信號的待測組分的量這一定義，本研究中選擇了多種不同品牌的奶粉進(jìn)行大量實驗，每個樣品平行測定10 次，奶粉中摻雜的尿素含量的檢出限基本是在1.1×10-4～4.5×10-4mg/g之間。由表3可知，計算所得檢出限分別為奶粉1# 3.3×10-4mg/g，奶粉2# 4.5× 10-4mg/g，奶粉3# 1.1×10-4mg/g。實際上，乳中尿素的含量一般在620.00 mg/L以內(nèi)為正常[30]，于是在本研究中，當(dāng)奶粉中摻雜尿素含量在0.62 mg/g以下時，將該摻雜奶粉作為純奶粉處理?；诖耍梅蔷€性化學(xué)指紋圖譜法對奶粉中摻雜尿素進(jìn)行定量分析和質(zhì)量評價，方法可行，并且有較高的準(zhǔn)確度和精密度。另外本方法也為配方乳粉中添加的尿素含量的檢測提供了依據(jù)。

表3 奶粉中摻雜尿素含量的檢出限Table 3 Limits of detection for urea content in adulterated milk powder samples (n = 10)

2.8 方法的特異性結(jié)果

通過大量實驗發(fā)現(xiàn)，向混合奶粉（尿素和奶粉的混合物）中加入一定量的三聚氰胺進(jìn)行干擾，當(dāng)混合奶粉中摻雜的尿素含量不變，同時三聚氰胺的含量小于5×10-5mg/g時，對實驗沒有影響；當(dāng)三聚氰胺的含量不小于5×10-5mg/g時，對實驗有一定的影響，并且通過非線性化學(xué)指紋圖譜方法，能把摻有尿素的奶粉和摻有三聚氰胺的奶粉區(qū)別開。

3 結(jié) 論

奶粉中摻雜的尿素含量與相應(yīng)摻雜奶粉非線性化學(xué)指紋圖譜的定量參數(shù)如誘導(dǎo)時間之間存在定量關(guān)系，利用奶粉標(biāo)樣非線性化學(xué)指紋圖譜信息擬合的線性回歸方程，可以測定同品牌不同批次奶粉中摻雜的尿素含量。實驗結(jié)果表明，提出的非線性化學(xué)指紋圖譜法具有較高的精密度和準(zhǔn)確度，同時此方法對于同一品牌的奶粉樣品，可用建立的回歸方程代替長期保存的奶粉標(biāo)樣。此外，與其他分析方法相比，該方法具有操作簡單、樣品不用預(yù)處理和分析成本低廉的優(yōu)點，同時為乳粉中摻雜的尿素含量測定提供了一種新方法。

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Determination of Urea Content in Adulterated Milk Powder by Nonlinear Chemical Fingerprint Method

MA Yongjie1,2, BAO Hongliang3, DONG Wenbin2
(1. College of Food and Drug, Luoyang Normal University, Luoyang 471000, China; 2. College of Chemistry and Chemical Engineering, Shaanxi University of Science and Technology, Xi’an 710021, China; 3. College of Mathematical Sciences, Luoyang Normal University, Luoyang 471000, China)

The urea content in adulterated milk powder was rapidly determined by nonlinear chemical fingerprint method using a reaction system consisting of sulfuric acid, malonic acid, ceric ammonium sulfate, sodium bromate and sodium bromide. Firstly, urea was added at different levels to milk powder to obtain adulterated milk powder standard samples each weighing 1.00 g. The nonlinear chemical fingerprint was recorded for each milk powder standard sample, and a linear relationship between the induction time and the urea content was established. Then, the urea content in milk powder was calculated by the least square method. The results showed that urea contents within the range of 0–40.00 mg/g in milk powder and induction time values displayed a good linear relationship with correlation coefficients equal to 0.996 6 and 0.999 5. The recoveries were 95.48%–104.06%, the relative standard deviations (RSDs) were not greater than 1.82%, and the detection limits (LODs) for milk powder samples 1#, 2# and 3# were 3.3 × 10-4, 4.5 × 10-4and 1.1 × 10-4mg/g, respectively. The method developed has the advantages of good accuracy and simple operation. It is a practical and feasible method for determining the urea content in milk powder.

nonlinear chemical fingerprint; milk powder; linear regression method; urea quantitation

10.7506/spkx1002-6630-201716047

TS252

A

1002-6630（2017）16-0292-06

馬永杰, 包洪亮, 董文賓. 利用非線性化學(xué)指紋圖譜法檢測奶粉中摻雜的尿素含量[J]. 食品科學(xué), 2017, 38(16): 292-297. DOI:10.7506/spkx1002-6630-201716047. http://www.spkx.net.cn

MA Yongjie, BAO Hongliang, DONG Wenbin. Determination of urea content in adulterated milk powder by nonlinear chemical fingerprint method[J]. Food Science, 2017, 38(16): 292-297. (in Chinese with English abstract)

10.7506/ spkx1002-6630-201716047. http://www.spkx.net.cn

2016-10-20

陜西省科技統(tǒng)籌創(chuàng)新工程計劃項目（2011KTCQ03-08）；“十二五”農(nóng)村領(lǐng)域國家科技計劃項目（2012BAD12B07）；陜西省教育廳服務(wù)地方項目（15JF009）；河南省高等學(xué)校重點科研項目（18A550012）

馬永杰（1979—），女，講師，博士，研究方向為食品檢測技術(shù)與食品功能因子及保健機(jī)理。E-mail：mayongjie113@163.com