iRoot BP對人乳牙牙髓細(xì)胞增殖、礦化的影響

戰(zhàn)園，劉鶴

(1北京大學(xué)口腔醫(yī)學(xué)院口腔醫(yī)院第三門診部，北京100081；2北京大學(xué)口腔醫(yī)學(xué)院口腔醫(yī)院)

iRoot BP對人乳牙牙髓細(xì)胞增殖、礦化的影響

戰(zhàn)園1，劉鶴2

(1北京大學(xué)口腔醫(yī)學(xué)院口腔醫(yī)院第三門診部，北京100081；2北京大學(xué)口腔醫(yī)學(xué)院口腔醫(yī)院)

目的 探討iRoot BP對人乳牙牙髓細(xì)胞增殖、礦化的影響，為其用于乳牙活髓保存治療提供依據(jù)。方法 將iRoot BP和三氧化礦物凝聚體(MTA)分別制成高度2 mm、直徑8 mm的圓柱體，置于DMEM細(xì)胞培養(yǎng)基中，收集浸提液。原代培養(yǎng)人乳牙牙髓細(xì)胞并鑒定。隨機(jī)將人乳牙牙髓細(xì)胞分為iRoot BP組、MTA組、對照組。iRoot BP組和MTA組分別加入適量iRoot BP、MTA浸提液，使其終濃度分別為10%、20%、50%、100%，對照組不予處理。采用CCK-8法檢測三組培養(yǎng)24、72 h時細(xì)胞增殖指數(shù)，采用實(shí)時熒光定量PCR法檢測三組培養(yǎng)48、96 h時堿性磷酸酶(ALP)mRNA表達(dá)(iRoot BP、MTA浸提液濃度均為10%)。結(jié)果 與對照組同時間點(diǎn)比較，含50%、100%浸提液的iRoot BP組、MTA組細(xì)胞增殖指數(shù)均降低(P均<0.05)，而含10%、20%浸提液的iRoot BP組、MTA組細(xì)胞增殖指數(shù)無明顯變化(P均>0.05)。與對照組同時間點(diǎn)比較，iRoot BP組、MTA組ALP mRNA相對表達(dá)量均升高(P均<0.05)。iRoot BP組與MTA組作用48、96 h ALP mRNA相對表達(dá)量比較差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P均>0.05)。結(jié)論 10% iRoot BP浸提液對人乳牙牙髓細(xì)胞增殖無明顯影響，但可明顯促進(jìn)細(xì)胞礦化。

乳牙；牙髓保存；人乳牙牙髓細(xì)胞；直接蓋髓材料；三氧化礦物凝聚體；細(xì)胞增殖；細(xì)胞分化

活髓保存是兒童牙髓治療的首選方法，理想的活髓保存材料應(yīng)該能夠促進(jìn)組織愈合，具有良好的生物相容性、封閉性、抗菌性、尺寸穩(wěn)定性及操作性，能快速固化并不受潮濕環(huán)境影響等[1]。三氧化礦物凝聚體(MTA)克服了傳統(tǒng)活髓保存材料的封閉性和生物相容性差等缺點(diǎn)[2]， 蓋髓后牙髓組織炎性反應(yīng)較輕，可促進(jìn)恒牙牙髓細(xì)胞再生，形成修復(fù)性牙本質(zhì)[1, 3]，目前常用于評價其他新型活髓保存材料的參照物[4]。但MTA在使用前需將粉劑和無菌注射用水混合，難以保證材料的均質(zhì)性；而且其固化時間長，內(nèi)含的三氧化二鉍、鐵、鎂等成分易導(dǎo)致牙冠變色等[5]。iRoot BP是一種新型生物陶瓷材料，與MTA的基本組成成分類似。2016年10月～2017年1月，我們對iRoot BP與MTA在乳牙活髓保存中的效果進(jìn)行了對比觀察?，F(xiàn)報告如下。

1 材料與方法

1.1 乳牙牙髓細(xì)胞培養(yǎng)及鑒定 經(jīng)患兒監(jiān)護(hù)人知情同意，收集臨床無明顯根吸收的滯留乳牙或因外傷需拔除的乳牙。無菌條件下取出牙髓組織，棄牙髓根尖2 mm部分，將其余組織剪碎，平鋪于25 cm2培養(yǎng)瓶內(nèi)。培養(yǎng)瓶中加入α-MEM培養(yǎng)基(美國Gibco公司)，內(nèi)含15% FBS(美國Gibco公司)、2 mmol/L谷氨酰胺(美國Sigma公司)、100 μmol/L左旋抗壞血酸磷酸鹽(美國Sigma公司)、1×105U/L青霉素(華北制藥集團(tuán)有限責(zé)任公司)、100 mg/L鏈霉素(華北制藥集團(tuán)有限責(zé)任公司)，置于37 ℃、5% CO2、飽和濕度環(huán)境中培養(yǎng)。每2～3天換液1次。取傳4～6代細(xì)胞，免疫組化染色，顯微鏡下可見乳牙牙髓細(xì)胞呈典型的長梭形，具有成纖維細(xì)胞樣形態(tài)；Cytokeratin表達(dá)呈弱陽性、Vimentin表達(dá)呈強(qiáng)陽性。證實(shí)為原代培養(yǎng)的人乳牙牙髓細(xì)胞。

1.2 iRoot BP及MTA浸提液制備 將iRoot BP、MTA分別制成高度2 mm、直徑8 mm的圓柱體，紫外線滅菌3 h，置于50 mL DMEM培養(yǎng)基(含1 mmol/L L-Glu、10% FBS)中， 37 ℃細(xì)胞培養(yǎng)箱中浸提24 h。將iRoot BP、MTA浸提液采用0.22 μm濾器過濾除菌，4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 iRoot BP及MTA對牙髓細(xì)胞增殖能力影響的觀察 取對數(shù)生長期牙髓細(xì)胞，接種于96孔板，每孔3×103個，37 ℃、5% CO2、飽和濕度環(huán)境中培養(yǎng)24 h。隨機(jī)將細(xì)胞分為iRoot BP組、MTA組和對照組。iRoot BP組和MTA組分別加入適量iRoot BP、MTA浸提液，使其終濃度分別為10%、20%、50%、100%，對照組不予處理。三組分別于培養(yǎng)24、72 h，采用CCK-8法檢測450 nm波長處各孔的光密度(OD)值。細(xì)胞增殖指數(shù)=(OD實(shí)驗孔-OD空白孔)/(OD對照孔-OD空白孔)×100%。實(shí)驗重復(fù)3次，取平均值。

1.4 iRoot BP及MTA對牙髓細(xì)胞堿性磷酸酶(ALP)mRNA表達(dá)影響的觀察 取對數(shù)生長期牙髓細(xì)胞按1×104個/cm2接種于培養(yǎng)瓶中，隨機(jī)分為iRoot BP組、MTA組和對照組。根據(jù)1.3的結(jié)果，iRoot BP組和MTA組僅加入濃度為10% iRoot BP、MTA的浸提液，對照組不予處理。每48 h換液1次，連續(xù)培養(yǎng)96 h。分別收集三組培養(yǎng)48、96 h細(xì)胞，加入細(xì)胞裂解液，TRIzol法提取細(xì)胞總RNA，逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA。根據(jù)GenBank基因庫公布的ALP、GAPDH(內(nèi)參基因)mRNA 序列，使用Primer5.0軟件設(shè)計引物。引物序列：ALP上游引物：5′-AGCACTCCCACTTCATCTGGAA-3′，下游引物：5′-GAGACCCAATAGGTAGTCCACATTG-3′，引物長度分別為22、25 bp；GAPDH上游引物：5′-CAACGGATTTGGTCGTATTGG-3′，下游引物：5′-GCAACAATATCCACTTTACCAGAGTTAA-3′，引物長度分別為21、28 bp。PCR反應(yīng)體系共20 μL：Sybr Green Mix 10 μL、cDNA 0.5 μL、 Milli Q水8.5 μL和上下游引物各0.5 μmol/L。反應(yīng)條件：50 ℃ 2 min，95 ℃ 10 min，95 ℃ 15 s、60 ℃ 1 min重復(fù)40個循環(huán)。采用2-ΔΔCt法計算各組ALP mRNA相對表達(dá)量。實(shí)驗重復(fù)3次，取平均值。

2 結(jié)果

2.1 三組細(xì)胞增殖指數(shù)比較 與對照組同時間點(diǎn)比較，含100%、50%浸提液的iRoot BP組、MTA組細(xì)胞增殖指數(shù)均降低，以含100%浸提液的iRoot BP組、MTA組細(xì)胞增殖指數(shù)降低更明顯(P均<0.05)。含20%和10%浸提液的iRoot BP組、MTA組作用24、72 h細(xì)胞增殖指數(shù)與對照組比較差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P均>0.05)。含相同濃度浸提液的iRoot BP組、MTA組作用相同時間細(xì)胞增殖指數(shù)比較差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P均>0.05)。見表1。

表1 三組細(xì)胞增殖指數(shù)±s)

2.2 三組ALP mRNA表達(dá)比較 與對照組同時間點(diǎn)比較，iRoot BP組、MTA組ALP mRNA相對表達(dá)量均升高(P均<0.05)。iRoot BP組與MTA組作用48、96 h ALP mRNA相對表達(dá)量比較差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P均>0.05)。見表2。

表2 三組ALP mRNA相對表達(dá)量比較

注：與對照組同期比較，*P<0.05。

3 討論

牙髓組織具有一定的修復(fù)能力，當(dāng)其受到損傷時，原有的健康牙髓組織增殖分化并形成修復(fù)性牙本質(zhì)，這是保存活髓的基礎(chǔ)[6]。目前，保存活髓的方法主要為直接蓋髓術(shù)。直接蓋髓術(shù)是指在暴露的牙髓創(chuàng)面覆蓋能使牙髓組織恢復(fù)的制劑，即蓋髓劑。臨床應(yīng)用的蓋髓劑主要有氫氧化鈣和MTA。氫氧化鈣作為蓋髓劑時操作復(fù)雜，療程較長，治療成功率較低[7]。MTA中含三氧化二鉍，作為阻射劑時，不僅會增加細(xì)胞毒性，抑制細(xì)胞增殖，還可能導(dǎo)致牙冠變色[8]。iRoot BP是保存活髓的新型材料，該材料以氧化鉭、氧化鋯代替了MTA中的三氧化二鉍，可避免牙冠變色[9]。而且iRoot BP使用前無需調(diào)拌，可預(yù)先混合成膏狀或糊狀，吸收組織液或牙本質(zhì)中的水分即可引發(fā)固化反應(yīng)，臨床操作性能優(yōu)于MTA[10]。目前關(guān)于iRoot BP的研究主要集中于封閉性[11]、生物相容性[9]、成骨作用[12]等方面，其作為蓋髓劑對牙髓細(xì)胞增殖及礦化影響的報道較少。

原代培養(yǎng)的人牙髓細(xì)胞、牙周膜細(xì)胞和牙齦上皮細(xì)胞等常作為口腔材料、藥物生物安全性評價的模型[13,14]。本研究選擇與蓋髓材料直接接觸的乳牙牙髓細(xì)胞作為研究對象，結(jié)果顯示，與對照組同時間點(diǎn)比較，含100%、50%浸提液的iRoot BP組、MTA組細(xì)胞增殖指數(shù)均降低，而含20%、10%浸提液的iRoot BP組、MTA組細(xì)胞增殖指數(shù)則無明顯變化。說明高濃度的iRoot BP、MTA浸提液可抑制人乳牙牙髓細(xì)胞增殖，而低濃度的浸提液則無明顯增殖抑制作用，與以往研究[11]結(jié)果一致。因此，本研究選擇10% iRoot BP、MTA浸提液進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗。

ALP是與牙本質(zhì)基質(zhì)形成及礦化密切相關(guān)的蛋白，其表達(dá)水平可間接反映牙髓細(xì)胞向成牙本質(zhì)樣細(xì)胞分化，以及促進(jìn)礦化、形成修復(fù)性牙本質(zhì)的能力。研究證實(shí)，組織非特異型ALP可參與牙齒和骨等組織的代謝及礦化， ALP是成牙本質(zhì)樣細(xì)胞或成骨樣細(xì)胞分化成熟的標(biāo)志[14]。ALP是成骨細(xì)胞分化的早期表型標(biāo)志物，其能水解磷酸酯，為羥基磷灰石的沉積提供磷酸[15]。本研究結(jié)果顯示，同時間點(diǎn)iRoot BP組、MTA組ALP mRNA相對表達(dá)量均較對照組升高，但作用48、96 h時兩組ALP mRNA相對表達(dá)量比較差異均無統(tǒng)計學(xué)意義。表明10% iRoot BP、MTA浸提液均能促進(jìn)人乳牙牙髓細(xì)胞的礦化，且二者效果并無明顯統(tǒng)計學(xué)差異。

綜上所述，10% iRoot BP浸提液對人乳牙牙髓細(xì)胞增殖無明顯影響，但可明顯促進(jìn)細(xì)胞礦化，具有良好的生物活性及促成骨作用。此外，iRoot BP的操作性和固化性更好，有望成為兒科臨床適宜的直接蓋髓材料。

[1] Karabucak B, Li D, Lim J, et al. Vital pulp therapy with mineral trioxide aggregate[J]. Dent Traumatol, 2005,21(4):240-243.

[2] Parirokh M ,Torabinejad M. Mineral trioxide aggregate: a comprehensive literature review--Part Ⅲ: Clinical applications, drawbacks, and mechanism of action [J]. J Endod, 2010,36(3):400-413.

[3] Witherspoon DE, Small JC, Harris GZ. Mineral trioxide aggregate pulpotomies: a case series outcomes assessment[J]. J Am Dent Assoc, 2006,137(5):610-618.

[4] 董艷梅.活髓保存治療與生物活性蓋髓劑的臨床現(xiàn)狀與研究[J].中華口腔醫(yī)學(xué)雜志，2014，49(5)：268-271.

[5] Asgary S, Parirokh M, Eghbal MJ, et al. Chemical differences between white and gray mineral trioxide aggregate[J]. J Endod, 2005,31(2):101-103.

[6] Goldberg M, Smith AJ. Cells and extracellular matrices of dentin and pulp: a biological basis for repair and tissue engineering[J]. Crit Rev Oral Biol Med, 2004,15(1):13-27.

[7] Mohammadi Z, Dummer PM. Properties and applications of calcium hydroxide in endodontics and dental traumatology[J]. Int Endod J, 2011,44(8):697-730.

[8] Camilleri J, Montesin FE, Papaioannou S, et al. Biocompatibility of two commercial forms of mineral trioxide aggregate[J]. Int Endod J, 2004,37(10):699-704.

[9] Zhang S, Yang X, Fan M. BioAggregate and iRoot BP Plus optimize the proliferation and mineralization ability of human dental pulp cells[J]. Int Endod J, 2013,46(10):923-929.

[10] 喬迪，董艷梅，高學(xué)軍.體外評價新型根尖倒充填材料iRoot的生物學(xué)性能[J].北京大學(xué)學(xué)報(醫(yī)學(xué)版)，2016，48(2)：324-329.

[11] Ma J, Shen Y, Stojicic S, et al. Biocompatibility of two novel root repair materials[J]. J Endod, 2011,37(6):793-798.

[12] Muincharern W, Louwakul P, Pavasant P, et al. Effect of fluocinolone acetonide on human dental pulp cells: cytotoxicity, proliferation, and extracellular matrix formation[J]. J Endod, 2011,37(2):181-184.

[13] Galler KM, Schweikl H, Hiller KA, et al. TEGDMA reduces mineralization in dental pulp cells[J]. J Dent Res, 2011,90(2):257-262.

[14] Yao KL, Todescan RJ, Sodek J. Temporal changes in matrix protein synthesis and mRNA expression during mineralized tissue formation by adult rat bone marrow cells in culture[J]. J Bone Miner Res, 1994,9(2):231-240.

[15] 王國紅，李祺福.Cbfa1/Runx2與成骨細(xì)胞分化調(diào)控[J].生命科學(xué)，2005，17(1)：40-44.

劉鶴(E-mail： heliu69@126.com)

10.3969/j.issn.1002- 266X.2017.28.027

R329.2

B

1002- 266X(2017)28- 0085- 03

2017- 02- 09)