Fascin-1對(duì)惡性黑色素瘤細(xì)胞增殖和凋亡的影響及其作用機(jī)制

駱曼，李靈毅

(1 武漢市第一醫(yī)院，武漢430014；2 華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院附屬武漢中心醫(yī)院)

Fascin-1對(duì)惡性黑色素瘤細(xì)胞增殖和凋亡的影響及其作用機(jī)制

駱曼1，李靈毅2

(1 武漢市第一醫(yī)院，武漢430014；2 華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院附屬武漢中心醫(yī)院)

目的 探討Fascin-1對(duì)惡性黑色素瘤細(xì)胞增殖和凋亡的影響及其作用機(jī)制。方法 體外培養(yǎng)人惡性黑色素瘤細(xì)胞A375和人皮膚成纖維細(xì)胞CCC-HSF-1。將A375細(xì)胞隨機(jī)分為CON組和Fascin-1-shRNA組，分別按照10 MOI的感染復(fù)數(shù)加入CON和Fascin-1-shRNA病毒，培養(yǎng)48 h。采用qRT-PCR法及Western blotting法檢測(cè)常規(guī)培養(yǎng)的CCC-HSF-1、A375細(xì)胞以及CON組、Fascin-1-shRNA組Fascin-1 mRNA和蛋白表達(dá)。分別采用Dye67染色法、Annexin V/PI染色法檢測(cè)CON組、Fascin-1-shRNA組細(xì)胞增殖指數(shù)及凋亡率，采用Western blotting法檢測(cè)Bcl-2、Bax、Bad蛋白表達(dá)。結(jié)果 常規(guī)培養(yǎng)的CCC-HSF-1、A375細(xì)胞中Fascin-1 mRNA相對(duì)表達(dá)量分別為0.21±0.015、1.00±0.01，F(xiàn)ascin-1蛋白相對(duì)表達(dá)量分別為0.12±0.04、0.75±0.11，二者比較P均<0.01。CON組、Fascin-1-shRNA組Fascin-1 mRNA相對(duì)表達(dá)量分別為1.00±0.01 、0.19±0.04，F(xiàn)ascin-1蛋白相對(duì)表達(dá)量分別為1.28±0.17、0.24±0.10，兩組比較P均<0.01。Fascin-1-shRNA組培養(yǎng)3、4天時(shí)細(xì)胞增殖指數(shù)均低于CON組同期(P均<0.05)。Fascin-1-shRNA組細(xì)胞凋亡率高于CON組(P<0.01)。Fascin-1-shRNA組Bcl-2蛋白相對(duì)表達(dá)量低于CON組，Bax、Bad蛋白相對(duì)表達(dá)量高于CON組(P均<0.01)。結(jié)論 Fascin-1表達(dá)下調(diào)可抑制惡性黑色素瘤細(xì)胞增殖并誘導(dǎo)其凋亡，其機(jī)制可能與下調(diào)細(xì)胞中Bcl-2表達(dá)及上調(diào)Bax、Bad表達(dá)有關(guān)。

惡性黑色素瘤；Fascin-1；細(xì)胞增殖；細(xì)胞凋亡；Bcl-2家族

惡性黑色素瘤是一種由痣轉(zhuǎn)變而來的皮膚惡性腫瘤[1]，近年來其發(fā)病率不斷上升[2,3]。惡性黑色素瘤患者預(yù)后主要取決于是否發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移[4]。研究證實(shí)，惡性黑色素瘤細(xì)胞分裂速度、瘤體厚度與腫瘤侵襲和轉(zhuǎn)移密切相關(guān)[5,6]。Fascin-1蛋白是一種在肌動(dòng)蛋白中具有捆綁作用的蛋白，通常在上皮細(xì)胞中低表達(dá)或不表達(dá)[7,8]。研究發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)ascin-1可改變肺癌、結(jié)腸癌、胃癌等腫瘤細(xì)胞的增殖狀態(tài)，并促進(jìn)其遷移和侵襲[9～12]。但目前關(guān)于Fascin-1與惡性黑色素瘤發(fā)生、發(fā)展的關(guān)系鮮見報(bào)道。2015年1月～2016年1月，我們觀察了Fascin-1對(duì)惡性黑色素瘤細(xì)胞增殖和凋亡的影響，現(xiàn)分析結(jié)果并探討其作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料 人皮膚成纖維細(xì)胞系CCC-HSF-1和人惡性黑色素瘤細(xì)胞系A(chǔ)375，購(gòu)自北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院細(xì)胞庫(kù)。Fascin-1-shRNA序列：5′-ACTATAACAAGGTGGCCAT-3′，非識(shí)別對(duì)照shRNA序列(CON序列)：5′-GTTCTCCGAACGTGTCACGT-3′，由美國(guó)Sigma公司設(shè)計(jì)合成。Western blotting檢測(cè)相關(guān)儀器，美國(guó)Bio-Rad公司；流式細(xì)胞儀、Dye670染料，美國(guó)BD公司；Annexin V/PI凋亡檢測(cè)試劑盒，天津三箭生物技術(shù)股份有限公司；Fascin-1、Bcl-2、Bax、Bad一抗，美國(guó)Cell Signal Technology公司；辣根過氧化物酶偶聯(lián)二抗，北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司。慢病毒包裝體系為Addgene第3代慢病毒包裝系統(tǒng)，以空載質(zhì)粒包裝CON病毒，F(xiàn)ascin-1-shRNA包裝Fascin-1-shRNA病毒，收集慢病毒包裝48 h時(shí)病毒上清，PEG純化，進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.2 CCC-HSF-1、A375細(xì)胞Fascin-1表達(dá)檢測(cè) 將CCC-HSF-1細(xì)胞、A375細(xì)胞接種于RPMI 1640培養(yǎng)基，置于37 ℃、5% CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱培養(yǎng)48 h，收集兩種細(xì)胞，分別檢測(cè)其Fascin-1 mRNA和蛋白表達(dá)。①Fascin-1 mRNA表達(dá)：采用qRT-PCR法。按Qiagen RNeasy Mini Kit試劑盒說明提取細(xì)胞總RNA，按TaKaRa cDNA Synthesis Kit試劑盒說明將總RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA，然后進(jìn)行PCR擴(kuò)增。引物序列：Fascin-1上游引物：5′-AAGAAGAAGCAGATCTGGAC-3′，下游引物：5′-CACGATGAGGAAACGGCAGT-3′；GAPDH上游引物：5′-TATGCTCTCCTCATGCATTG-3′，下游引物：5′-GGGACGACCTTCGATCTACC-3′。所有操作嚴(yán)格按TaKaRa SYBR Premix Ex Taq試劑盒說明進(jìn)行。以GAPDH為內(nèi)參，2-ΔΔCt法計(jì)算Fascin-1 mRNA相對(duì)表達(dá)量。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，取平均值。②Fascin-1蛋白表達(dá)：采用Western blotting法。取兩種細(xì)胞，RIPA冰上裂解30 min，BCA法蛋白定量，取部分蛋白加入5×上樣緩沖液，100 ℃水浴10 min，然后行SDS-PAGE，50 V恒壓，待溴酚藍(lán)跑至濃縮膠與分離膠分界處時(shí)，切換至120 V恒壓；當(dāng)溴酚藍(lán)跑至膠板底部時(shí)，400 mA恒流將蛋白轉(zhuǎn)印至PVDF膜上；分別加入Fascin-1(1∶200)與β-actin(1∶1 000)一抗，37 ℃孵育4 h；加入辣根過氧化物酶偶聯(lián)二抗(1∶1 000)孵育過夜；ECL發(fā)光后顯影。采用Quantity One 1-D軟件分析各蛋白電泳條帶灰度值。以β-actin為內(nèi)參，目的蛋白電泳條帶灰度值/β-actin蛋白電泳條帶灰度值作為目的蛋白相對(duì)表達(dá)量。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，取平均值。

1.3 轉(zhuǎn)染Fascin-1-shRNA對(duì)A375細(xì)胞增殖和凋亡影響的觀察

1.3.1 CON、Fascin-1-shRNA病毒轉(zhuǎn)染 將A375細(xì)胞接種于RPMI 1640培養(yǎng)基，37 ℃、5% CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱培養(yǎng)48 h。隨機(jī)將細(xì)胞分為CON組、Fascin-1-shRNA組，按照10 MOI(病毒∶細(xì)胞=10∶1)的感染復(fù)數(shù)加入CON病毒和Fascin-1-shRNA病毒，繼續(xù)培養(yǎng)48 h。收集兩組細(xì)胞，分別采用qRT-PCR法、Western blotting法檢測(cè)Fascin-1 mRNA和蛋白表達(dá)，方法同1.2。結(jié)果顯示，CON組、Fascin-1-shRNA組Fascin-1 mRNA相對(duì)表達(dá)量分別為1.00±0.01、0.19±0.04，F(xiàn)ascin-1蛋白相對(duì)表達(dá)量分別為1.28±0.17、0.24±0.10，兩組比較P均<0.01。證實(shí)Fascin-1-shRNA病毒能夠抑制Fascin-1表達(dá)，可進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.3.2 細(xì)胞增殖指數(shù)檢測(cè) 采用Dye670染色法。取CON組、Fascin-1-shRNA組轉(zhuǎn)染48 h細(xì)胞，制成單細(xì)胞懸液(細(xì)胞密度為1×107個(gè)/mL)，然后加入適量Dye670染料，使其終濃度為10 μmol/L，37 ℃避光染色10 min，再加入5倍體積的完全培養(yǎng)基，冰上孵育5 min，完全培養(yǎng)基沖洗3次。將標(biāo)記后的細(xì)胞接種于24孔板，每孔1×106個(gè)，37 ℃孵育，分別于培養(yǎng)0、1、2、3、4天時(shí)采用BD Calibur流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞增殖指數(shù)。

1.3.3 細(xì)胞凋亡檢測(cè) 采用Annexin V/PI染色法。取CON組、Fascin-1-shRNA組轉(zhuǎn)染48 h細(xì)胞，制成單細(xì)胞懸液(細(xì)胞密度為1×107個(gè)/mL)，PBS清洗2次，Binding Buffer重懸，加入相應(yīng)比例(1∶1 000)的Annexin V抗體避光染色10 min，然后加入適量PBS溶液及PI染液混勻，流式細(xì)胞儀檢測(cè)Annexin V陽(yáng)性細(xì)胞比例，即為細(xì)胞凋亡率。

1.3.4 Bcl-2、Bax、Bad蛋白表達(dá) 采用Western blotting法。一抗分別為Bcl-2(1∶200)、Bax(1∶200)、Bad(1∶200)、β-actin(1∶200)，二抗為辣根過氧化物酶偶聯(lián)二抗(1∶1 000)，具體操作步驟同1.2。

2 結(jié)果

2.1 CCC-HSF-1、A375細(xì)胞Fascin-1 mRNA和蛋白表達(dá)比較 CCC-HSF-1、A375細(xì)胞Fascin-1 mRNA相對(duì)表達(dá)量分別為0.21±0.02、1.00±0.01，F(xiàn)ascin-1蛋白相對(duì)表達(dá)量分別為0.12±0.04、0.75±0.11，二者比較P均<0.01。

2.2 轉(zhuǎn)染Fascin-1-shRNA或CON對(duì)A375細(xì)胞增殖和凋亡影響的觀察

2.2.1 兩組轉(zhuǎn)染不同時(shí)間細(xì)胞增殖指數(shù)和細(xì)胞凋亡率比較 見表1。

表1 兩組轉(zhuǎn)染不同時(shí)間細(xì)胞增殖指數(shù)和細(xì)胞凋亡率比較±s)

注：與CON組比較，*P<0.05，△P<0.01。

2.2.2 兩組Bcl-2、Bax、Bad蛋白表達(dá)比較 見表2。

表2 兩組Bcl-2、Bax、Bad蛋白相對(duì)表達(dá)量比較

注：與CON組比較，*P<0.01。

3 討論

Fascin-1定位于染色體7p22，可與F-肌動(dòng)蛋白結(jié)合，參與調(diào)節(jié)細(xì)胞運(yùn)動(dòng)等[13]。Fascin-1蛋白的第39位絲氨酸是蛋白激酶C的磷酸化位點(diǎn)，該位點(diǎn)磷酸化后可調(diào)節(jié)Fascin-1蛋白與F-肌動(dòng)蛋白的結(jié)合活性，抑制Fascin-1肌鈣蛋白的組裝功能，并影響細(xì)胞膜表面?zhèn)巫愫臀⒓纬蒣14]。Fascin-1在非小細(xì)胞肺癌組織中高表達(dá)，參與調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖與遷移，并與腫瘤臨床分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移相關(guān)[15]。在結(jié)腸癌組織中，F(xiàn)ascin-1通過caspase介導(dǎo)的失巢凋亡，發(fā)揮癌基因作用[16]。Fascin-1在胃癌組織中高表達(dá)，是影響胃癌患者預(yù)后的獨(dú)立危險(xiǎn)因子[17]。miR-429通過靶向下調(diào)FSCN1表達(dá)抑制胃癌細(xì)胞增殖、遷移和侵襲[18,19]。Fascin-1在卵巢癌組織中高表達(dá)，且隨著TNM分期升高而表達(dá)增高，可能參與卵巢癌的惡性轉(zhuǎn)化[20]。以上研究說明，F(xiàn)ascin-1可作為癌基因參與多種惡性腫瘤的發(fā)生、發(fā)展。

本研究以人惡性黑色素瘤細(xì)胞系A(chǔ)375為研究對(duì)象，以人皮膚成纖維細(xì)胞CCC-HSF-1為對(duì)照，結(jié)果顯示，常規(guī)培養(yǎng)的A375細(xì)胞Fascin-1 mRNA和蛋白相對(duì)表達(dá)量均高于CCC-HSF-1細(xì)胞，提示Fascin-1高表達(dá)可能與人惡性黑色素瘤的發(fā)生有關(guān)。進(jìn)一步將A375細(xì)胞給予空載質(zhì)粒包裝的CON病毒和Fascin-1-shRNA包裝的Fascin-1-shRNA病毒轉(zhuǎn)染發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)ascin-1-shRNA組Fascin-1 mRNA和蛋白相對(duì)表達(dá)量均低于CON組，提示慢病毒處理可敲低A375細(xì)胞Fascin-1表達(dá)；Fascin-1敲低后，A375細(xì)胞的增殖受到抑制，其凋亡率顯著高于CON組，提示Fascin-1低表達(dá)可誘導(dǎo)A375細(xì)胞凋亡。

Bcl-2家族是目前研究最廣泛的凋亡調(diào)控基因之一，包括抑制凋亡基因與促進(jìn)凋亡基因兩大類，抑制凋亡基因主要有Bcl-2、Bcl-w等，促進(jìn)凋亡基因主要有Bax、Bad、Bid等[21]。本研究結(jié)果顯示，與CON組比較，F(xiàn)ascin-1-shRNA組Bcl-2表達(dá)下降，Bax、Bad表達(dá)增加，表明Fascin-1對(duì)A375細(xì)胞增殖和凋亡的影響與其調(diào)控Bcl-2家族相關(guān)基因的表達(dá)有關(guān)。

綜上所述，F(xiàn)ascin-1表達(dá)下調(diào)可抑制惡性黑色素瘤細(xì)胞增殖并誘導(dǎo)其凋亡，其機(jī)制可能與下調(diào)Bcl-2表達(dá)及上調(diào)Bax、Bad表達(dá)有關(guān)。

[1] Naveh HP, Rao UN, Butterfield LH. Melanoma-associated leukoderma-immunology in black and white[J]. Pigment Cell Melanoma Res, 2013,26(6):796-804.

[2] Vecchiato A, Zonta E, Campana L, et al. Long-term survival of patients with invasive ultra-thin cutaneous melanoma: a single-center retrospective analysis[J]. Medicine, 2016,95(2):e2452.

[3] Kyrgidis A, Tzellos T, Mocellin S, et al. Sentinel lymph node biopsy followed by lymph node dissection for localised primary cutaneous melanoma[J]. Cochrane Database Syst Rev, 2015,16 (5):CD010307.

[4] Jaukovic L, Sijan G, Rajovic′ M, et al. Lymphoscintigraphy and sentinel lymph node biopsy, in cutaneous melanoma staging and treatment decisions[J]. Hell J Nucl Med, 2014,18(2):146-151.

[5] Speijers MJ, Bastiaannet E, Sloot S, et al. Tumor mitotic rate added to the equation: melanoma prognostic factors changed[J]. Ann Surg Oncol, 2015,22(9):2978-2987.

[6] Stanelle EJ, Busam KJ, Rich BS, et al. Early-stage non-Spitzoid cutaneous melanoma in patients younger than 22 years of age at diagnosis: long-term follow-up and survival analysis[J]. J Pediatr Surgery, 2015,50(6):1019-1023.

[7] Gungor-Ordueri NE, Celik-Ozenci C, Cheng CY. Fascin 1 is an actin filament-bundling protein that regulates ectoplasmic specialization dynamics in the rat testis[J]. Am J Physiol Endocrinol Metab, 2014,307(9):E738-E753.

[8] Ma Y, Reynolds LE, Li A, et al. Fascin 1 is dispensable for developmental and tumour angiogenesis[J]. Biology Open, 2013,2(11):1187-1191.

[9] Zhao W, Gao J, Wu J, et al. Expression of Fascin-1 on human lung cancer and paracarcinoma tissue and its relation to clinicopathological characteristics in patients with lung cancer[J]. OncoTargets Ther, 2015(8):2571-2576.

[10] Kanaan Z, Qadan M, Eichenberger MR, et al. The actin-cytoskeleton pathway and its potential role in inflammatory bowel disease-associated human colorectal cancer[J]. Genetic Test Mol Biomarkers, 2010,14(3):347-353.

[11] Tsai WC, Jin JS, Chang WK, et al. Association of cortactin and fascin-1 expression in gastric adenocarcinoma: correlation with clinicopathological parameters[J]. J Histochem Cytochem, 2007,55(9):955-962.

[12] Ma Y, Li A, Faller W J, et al. Fascin 1 is transiently expressed in mouse melanoblasts during development and promotes migration and proliferation[J]. Development, 2013,140(10):2203-2211.

[13] Adams JC. Fascin-1 protrusions in cell interactions[J]. Trends Cardiovasc Med, 2004,14(6):221-226.

[14] Larsson C. Protein kinase C and the regulation of the actin cytoskeleton[J]. Cell Signal, 2006,18(3): 276-84.

[15] Liang Z, Wang Y, Shen Z, et al. Fascin 1 promoted the growth and migration of non-small cell lung cancer cells by activating YAP/TEAD signaling[J]. Tumor Biol, 2016,37(8):10909-10915.

[16] Kanda Y, Kawaguchi T, Kuramitsu Y, et al. Fascin regulates chronic inflammation-related human colon carcinogenesis by inhibiting cell anoikis[J]. Proteomics, 2014,14(9):1031-1041.

[17] Tu L, Xu J, Wang M, et al. Correlations of fascin-1 and cadherin-17 protein expression with clinicopathologic features and prognosis of patients with gastric cancer[J]. Tumor Biol, 2016,37(7):8775-8782.

[18] Zhang M, Dong B, Lu M, et al. miR-429 functions as a tumor suppressor by targeting FSCN1 in gastric cancer cells[J]. OncoTargets Therapy, 2016(9):1123-1133.

[19] Xue M, Zhao L, Yang F, et al. MicroRNA145 inhibits the malignant phenotypes of gastric carcinoma cells via downregulation of fascin 1 expression[J]. Mol Me Rep, 2016,13(1):1033-1039.

[20] 王永來,鄭玉霞,陳雙,等.子宮內(nèi)膜癌中人類Fascin1基因的表達(dá)及臨床意義[J].山東醫(yī)藥,2007,47(27):52-54.

[21] Buranabunwong N, Ruangrungsi N, Chansriniyom C, et al. Ethyl acetate extract from Glycosmis parva leaf induces apoptosis and cell-cycle arrest by decreasing expression of COX-2 and altering BCL-2 family gene expression in human colorectal cancer HT-29 cells[J]. Pharmaceutical Biology, 2015,53(4):540-547.

李靈毅(E-mail： 1114395480@qq.com)

10.3969/j.issn.1002- 266X.2017.28.012

R739.5

A

1002- 266X(2017)28- 0043- 03

2016-10-29)