高效液相色譜—蒸發(fā)光散射檢測器法測定芪芳氣血顆粒中黃芪甲苷含量分析

趙曉麗

（河南省駐馬店市食品藥品檢驗所，河南 駐馬店463000）

高效液相色譜—蒸發(fā)光散射檢測器法測定芪芳氣血顆粒中黃芪甲苷含量分析

趙曉麗

（河南省駐馬店市食品藥品檢驗所，河南 駐馬店463000）

目的：用高效液相色譜——蒸發(fā)光散的檢測器（HPLC—ELSD）法對芪芳氣血顆粒中黃芪甲苷含量進行測定。方法：運用HPLC法測定芪芳氣血顆粒中的黃芪甲苷含量，其中流速為0.9mL/min，流動相為乙腈-水為（34︰66），色譜柱為Ultimate XB-C18柱（4.6mm×250mm，5μm）。結果：芪芳氣血顆粒中的黃芪甲苷回收率為95.78%，進樣量為2.38～11.85μg，峰面積與范圍內具有良好的線性關系。結論：（HPLC—ELSD）法測定芪芳氣血顆粒中黃芪甲苷含量具有重復性好、準確、操作簡單等優(yōu)點。

高效液相色譜-蒸發(fā)光散射檢測器法；芪芳氣血顆粒；黃芪甲苷

芪芳氣血顆粒由熟地黃、當歸、黃芪等多味中藥組成，具有調經(jīng)止痛、補血和血、益氣補腎功效，被廣泛運用于婦科疾病治療中，尤其是婦女產(chǎn)后氣血虧虛證［1］。通常情況下，測量芪芳氣血顆粒中的黃芪甲苷含量用薄層掃描是常用方法，但是在實際操作中容易受到諸多因素影響，并且結果不穩(wěn)定，需顯色后掃描，重復性也無法滿足要求。蒸發(fā)光散射檢測器（ELSD）作為通用型的一種質量檢測器，能夠對無紫外線吸收或不含共軛結構的物質進行分析，并且其基線穩(wěn)定，能夠獲得比較理想的分辨率［2］。因此，本研究用高效液相色譜——蒸發(fā)光散射檢測器（HPLCELSD）法測定黃芪甲苷的含量，報道如下。

1 儀器與試劑

儀器：選擇上海梅特勒-托利多公司生產(chǎn)的XS-105型電子天平，精密度為0.01mg，美國Wates公司生產(chǎn)的Waters Alliance 2695型高效液相色譜儀，包括2424ELS Detector Empower工作站和e2695溶劑管理系統(tǒng)。

試劑：芪芳氣血顆粒（恒拓集團廣西圣康制藥有限公司生產(chǎn)，國藥準字B20020825，規(guī)格15g）。黃芪甲苷對照品由中國食品藥品檢定研究院提供，含量95.8%，批號110781-201314。水為純化水，乙腈為色譜純。

2 方 法

色譜條件：柱溫為30℃，空氣壓力為20.0psi（1psi=6.895kPa），數(shù)據(jù)率為1PPS，增益為40，漂移管溫度為65℃，流速為0.9mL/min，流動相乙腈-水（34∶66），色譜柱Ultimate XB-C18柱（250mm×4.6mm，5μg）。

制備溶液：按照常規(guī)方法，精密稱取12.38mg黃芪甲苷對照品，放置在25mL容量瓶中，加入適量甲醇直到刻度，制備成對照品溶液，即每1mL含有0.5mg。精密稱取15g芪芳氣血顆粒，加入50mL純化水進行溶解，用水飽和的正丁醇振動搖晃，每次40mL，連續(xù)進行4次提取，然后與正丁醇提取液合并，運用濃氨試液對正丁醇提取液洗滌2次，每次40mL，將洗滌液棄去，蒸干正丁醇液，用甲醇溶液將殘渣轉移至5mL容量瓶中，加入適量甲醇直到刻度，搖晃均勻后，濾過，選擇濾液作為供試品溶液。同時，根據(jù)芪芳氣血顆粒處方比例，選擇缺黃芪方中其他藥材制成陰性樣品，再根據(jù)供試品溶液制備方法，對陰性對照品溶液進行制備。

3 結 果

陰性干擾試驗：分別選擇制備溶液中的3種溶液各20μL，根據(jù)色譜條件進行進樣測定，對色譜圖進行記錄。結果顯示，在供試品溶液色譜中，陰性對照品溶液色譜不存在吸收峰，但是對照品溶液色譜相同保留時間處存在一致的色譜峰，見圖1。

圖1 高效液相色譜圖

1.黃芪甲苷

A.對照品溶液；B.陰性對照品溶液；C.供試品溶液

重復性試驗：選擇批號為130202的芪芳氣血顆粒，按照常規(guī)方法，制備6份供試品溶液，在高效液相色譜儀中注入10μL，對黃芪甲苷的含量進行計算，結果顯示每袋的平均含量為1.41mL，RSD為1.31%，說明這一方法具有較好的重復性。

穩(wěn)定性試驗：選擇批號為130202的供試品溶液，于0、3、6、9、12以及24h時進樣，分別對峰面積進行測定，結果顯示RSD為0.83%，說明在24h內，供試品溶液比較穩(wěn)定。

加樣回收試驗：精密稱取7.5mg樣品，將1.5mL對照品溶液加入，再加入50mL水進行溶解，按照常規(guī)方法，制備6份質量濃度相同的供試品溶液，進樣測定，計算回收率，見表1。

表1 黃芪甲苷加樣回收試驗結果 （n=6）

精密度試驗：選擇10μL對照品溶液，連續(xù)6次進樣，對峰面積積分值進行測定，結果顯示，RSD為0.57%，說明儀器具有良好的精密度。

線性關系考察：分別提取25、20、15、10以及5μg/L對照品溶液，將擬定色譜條件作為基本依據(jù)，對其進行進樣測定，以黃芪甲苷進樣量峰面積的自然對數(shù)（Y）為縱坐標、自然對數(shù)（X）為橫坐標進行線性回歸，得一回歸方程，4.4315+1.4713X=Y，r=0.9995（n=5）。結果顯示，進樣量在2.38～11.85μg范圍內時，峰面積與黃芪甲苷具有較好的線性關系。

4 討 論

蒸發(fā)光散射器作為一種質量型檢測器，適用于測定無紫外吸收或僅有末端吸收的皂苷類化合物，不容易受到流動相溶劑干擾和官能團的影響，具有較高的回收率和分離度，并且前處理比較簡單，是當前測定黃芪甲苷含量的一種有效方法［3］。在本次研究中，運用HPLC-ELSD法對芪芳氣血顆粒中的黃芪甲苷含量進行測定，并且對數(shù)據(jù)率、增益、氣流速以及漂移管溫度等諸多因素對峰形的影響進行優(yōu)化，可以確保檢測結果的準確性和靈敏度［4］。黃芪甲苷為環(huán)菠蘿蜜烷型的一種四環(huán)三萜類皂苷，在戊醇或含水丁醇中，皂苷具有較好的溶解度，并且樣品中已經(jīng)提取黃芪甲苷，加水直接溶解，提取采用水飽和的正丁醇，再加上正丁醇提取液中通常不含多糖、單糖等雜質，有助于分析［5-6］。同時，在對流動相進行選擇時，先對芪芳氣血顆粒和黃芪藥材進行了實驗，通過比較對照品的色譜圖，發(fā)現(xiàn)黃芪甲苷主峰與其他峰的分離度不高，為了更好分離兩個峰，選擇乙腈水作為流動相，這一流動相可以排除干擾，有助于分離其他成分。此外，運用1%氫氧化鈉溶液（每次20mL，4次）及氨試液（每次40mL，2次）與濃氨試液（每次40mL，2次）對正丁醇提取液進行洗滌，結果顯示，與同體積的氨試液相比，1%氫氧化鈉溶液及濃氨試液提取黃芪甲苷的含量較高，并且黃芪皂苷Ⅰ和Ⅱ在堿性的條件下轉化為黃芪甲苷Ⅳ，說明在一定堿性范圍內，黃芪皂苷Ⅰ和Ⅱ轉化為黃芪皂苷Ⅳ與堿性程度呈正比關系，即堿性越強，轉化越完全。

綜上所述，臨床上運用HPLC法測定芪芳氣血顆粒中的黃芪甲苷含量，具有操作簡單、快速、高效等優(yōu)點，有助于提高該制劑的質量標準，值得推廣。

［1］ 吳高芬.高效液相色譜——蒸發(fā)光散射器法測定芪芳氣血顆粒中黃芪甲苷含量［J］.中國藥業(yè)，2015，12（22）：60-62.

［2］ 湯淏，崔恩忠，唐安福，等.高效液相色譜-蒸發(fā)光散射法測定氣血雙補口服液中黃芪甲苷的含量［J］.醫(yī)學研究生學報，2013，3（19）：287-289.

［3］ 許鋒，高華宏.高效液相色譜-蒸發(fā)光散射檢測法測定健天顆粒中黃芪甲苷含量［J］.中國藥業(yè)，2011，5（12）：21-22.

［4］ 龐興壽，牟曉崟.高效液相色譜-蒸發(fā)光散射檢測器法測定仙芪眩寧顆粒中黃芪甲苷含量［J］.中國藥業(yè)，2011，17（20）：32-33.

［5］ 劉正磊，馮素香，李娟，等.高效液相-蒸發(fā)光散射檢測法測定黃芪藥材中黃芪甲苷含量［J］.中醫(yī)學報，2012，27（3）：334-335.

［6］ 謝紫薇，譚天林，王璦萍，等.高效液相色譜-蒸發(fā)光散射檢測器法測定健兒寶顆粒中黃芪甲苷含量［J］.中國藥業(yè)，2016，13（19）：77-79.

Objective：To investigate the clinical effect of HPLC method on the determination of the content of astragaloside in Qifang Qixue Granules. Method：To determine the content of astragaloside in Qifang Qixue Granules by HPLC method，with the flow rate 0.9mL/min and the mobile phase of acetonitrile water（34︰66）.The chromatographic column was Ultimate XB-C18 column（4.6mm×250mm，5μm）. Result：The recovery rate of astragaloside in Qifang Qixue Granules was 95.78% and the injection volume was 2.38～11.85μg，with a good linear relationship between peak area and conclusion range.Conclusion：The clinical application of HPLC method for the determination of the content of astragaloside in Qifang Qixue Granules has the advantages of good repeatability，accuracy，simple operation, and so on.

High performance liquid chromatography evaporative light scattering detector（HPLC）；Qifang Qixue Granules；Astragaloside

R285.5

B

1004-2814（2017）07-0858-03

2017-04-25