齊墩果酸通過VEGF-Src通路對蛛網(wǎng)膜下腔出血大鼠模型血管內(nèi)皮緊密連接表達(dá)的影響

韓雨薇，劉秀娟，高 陽，李曉明

·論著·

齊墩果酸通過VEGF-Src通路對蛛網(wǎng)膜下腔出血大鼠模型血管內(nèi)皮緊密連接表達(dá)的影響

韓雨薇，劉秀娟，高 陽，李曉明*

目的 探討齊墩果酸對蛛網(wǎng)膜下腔出血后早期腦損傷的保護(hù)作用，闡釋其可能的機(jī)制。方法 54只成年雄性SD大鼠分成3組(假手術(shù)組、SAH模型組、齊墩果酸給藥組)，每組18只。采用頸內(nèi)動(dòng)脈穿刺法建立大鼠SAH模型，造模1 h后給藥，24 h后進(jìn)行神經(jīng)功能損傷評分；檢測腦水含量及腦伊文思藍(lán)浸出；并利用Western blot方法檢測腦組織Src、VEGF、ZO-1、Claudin-5、Occludin蛋白的表達(dá)量。結(jié)果 齊墩果酸高劑量給藥可有效改善神經(jīng)功能損傷(P<0.01)；降低腦組織含水量和腦血管通透性(P<0.01)；增加ZO-1、Claudin-5、Occludin蛋白的表達(dá)，降低VEGF水平，抑制Src激活(P<0.05)。結(jié)論 齊墩果酸對SAH后早期腦損傷有顯著的保護(hù)作用，可改善腦水腫，其作用機(jī)制可能與增加腦組織緊密連接蛋白的表達(dá)有關(guān)。

齊墩果酸；蛛網(wǎng)膜下腔出血；腦水腫；緊密連接

0 引言

維持血管屏障功能的關(guān)鍵在于內(nèi)皮細(xì)胞之間的相互作用，內(nèi)皮細(xì)胞之間通過緊密連接結(jié)構(gòu)結(jié)合在一起調(diào)控血管通透性[7]。BBB緊密連接結(jié)構(gòu)組成主要是由跨膜蛋白Occludin、Claudin及胞質(zhì)附著蛋白ZO家族組成的復(fù)合體。屏障功能的破壞、通透性的改變與細(xì)胞間的緊密連接狀態(tài)密不可分。

齊墩果酸(3b-hydroxy-olea-12-en-28-oic acid，OA)是廣泛存在于食品和藥用植物中的五環(huán)三萜類化合物，具有多種生物活性，有潛在的抗炎和神經(jīng)保護(hù)作用。本研究采用動(dòng)脈刺破方法建立SAH模型，考察齊墩果酸在SAH大鼠模型中能否通過改善緊密連接保護(hù)屏障功能從而減輕早期腦損傷，探討其發(fā)揮藥效的可能機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 主要試劑 藥物齊墩果酸購自天津士蘭科技有限公司；p-Src和Src抗體購自Cell Signaling Technology公司；VEGF、ZO-1，Claudin-5、Occludin抗體購自Santa Cruz公司；HRP二抗均購自Santa Cruz公司；BCA蛋白定量試劑盒、RIPA裂解液及5×loading buffer均購自碧云天公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物和分組 雄性清潔級(jí)SD大鼠(280～350 g)購自沈陽軍區(qū)總醫(yī)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物合格證號(hào)0005095。動(dòng)物飼養(yǎng)于18～22 ℃恒溫室中，12 h/12 h光暗周期，實(shí)驗(yàn)前自由進(jìn)食、水。54只大鼠隨機(jī)分成3組，每組18只：假手術(shù)組、模型組、齊墩果酸給藥組(20 mg/kg)。術(shù)前禁食，自由飲水，在模型制作完成后1 h給藥，24 h后進(jìn)行取材。

1.3 模型建立 手術(shù)前，10%水合氯醛腹腔麻醉，于頸部正中縱向切開后，分離出頸總動(dòng)脈、頸外動(dòng)脈及頸內(nèi)動(dòng)脈，結(jié)扎頸外動(dòng)脈遠(yuǎn)端，并以手術(shù)線臨時(shí)阻斷頸總動(dòng)脈和頸內(nèi)動(dòng)脈，在頸內(nèi)動(dòng)脈端用手術(shù)剪刀剪一小口，將魚線(直徑0.261 mm)從小口送入頸內(nèi)動(dòng)脈，推進(jìn)至大鼠大腦前動(dòng)脈和中動(dòng)脈分叉處，并穿破動(dòng)脈建立SAH模型。假手術(shù)組中進(jìn)行類似的操作，但不穿破動(dòng)脈。

1.4 SAH嚴(yán)重性評價(jià) SAH的嚴(yán)重性根據(jù)Sugawara[8]評分標(biāo)準(zhǔn)對SAH血凝塊進(jìn)行0～3級(jí)評分。評分越高表示SAH越嚴(yán)重。

1.5 死亡率和神經(jīng)功能缺失的評價(jià) 記錄死亡率，并根據(jù)Sugawara[8]評分標(biāo)準(zhǔn)對SAH 24 h 后的各組大鼠進(jìn)行神經(jīng)功能缺陷評分，即對大鼠自發(fā)性活動(dòng)、四肢運(yùn)動(dòng)對稱、前肢伸展、攀登、雙側(cè)軀干的觸碰反應(yīng)以及觸須反應(yīng)6個(gè)項(xiàng)目進(jìn)行測試，并給予0～3分的評價(jià)。各項(xiàng)之和作為總評分，得分越低表明神經(jīng)功能損傷越嚴(yán)重。平衡木測驗(yàn)：平衡木為長80 cm、寬2.5 cm的方木棒，平放于距地面10 cm處，將大鼠放在平衡木上，能堅(jiān)持91～120 s計(jì)6分，61～90 s計(jì)5分，31～60 s計(jì)4分，21～30 s計(jì)3分，11～20 s計(jì)2分，1～10 s計(jì)1分，將大鼠放上平衡木會(huì)掉下來計(jì)0分[9]。

1.6 腦組織含水量測定 每組取6只大鼠，造模24 h后，取出大鼠腦組織，將其切分為左右半腦及小腦三部分，擦去表面血跡分別稱量其濕重后，放入110 ℃烘箱內(nèi)烘干72 h。稱量其干重，按照公式計(jì)算其腦含水率：腦含水率(%)=(濕重-干重)/濕重]×100%。

1.7 腦血管通透性測定 每組取6只大鼠，于取材前1 h尾靜脈給予2%伊文思藍(lán)溶液(5 mL/kg)，全身循環(huán)1 h后，進(jìn)行生理鹽水灌注，迅速取出腦組織，將其切分為左右半腦及小腦三部分，即稱重。按10 mL/g的體積將組織浸潤到甲酰胺溶液中，60 ℃恒溫孵育24 h待伊文思藍(lán)浸出，收集浸出液于酶標(biāo)儀620 nm處測定其OD值。

④遙感技術(shù)具有數(shù)據(jù)穩(wěn)定、方法科學(xué)、手段先進(jìn)等特點(diǎn)，隨著國產(chǎn)自主高分辨率衛(wèi)星技術(shù)的發(fā)展以及生態(tài)清潔小流域規(guī)劃審批新工作模式的實(shí)踐與完善，其在北京市生態(tài)清潔小流域建設(shè)審批工作中的應(yīng)用效果也將不斷提升，并可進(jìn)一步向其他生態(tài)建設(shè)工程的規(guī)劃評審工作推廣。

1.8 Western blot檢測蛋白表達(dá) 大鼠過量麻醉致死，取大鼠患側(cè)大腦皮層，稱重后加入1 mL裂解液(含PMSF)，勻漿裂解30 min后，4 ℃、12 000 r/min離心10 min，取上清即為蛋白溶液；BCA法測定蛋白濃度，按照蛋白溶液體積的1/4加入5×loading buffer混合，100 ℃煮沸5 min，卻后-70 ℃保存；用10% SDS-聚丙烯胺凝膠電泳，向加樣孔中加入40 μg總蛋白樣品，恒流轉(zhuǎn)至PVDF膜；5%脫脂牛奶室溫封閉1 h；一抗VEGF和ZO-1、Claudin-5、Occludin的稀釋比例為1∶200，Src稀釋比例為1∶600，p-Src稀釋比例為1∶400，β-actin一抗的稀釋比例為1∶1 000，4 ℃過夜；將HRP標(biāo)記的二抗用TBST稀釋，與膜室溫孵育1 h；TBST洗后經(jīng)Pro-light HRP化學(xué)發(fā)光檢測試劑盒發(fā)光，用X-ray顯影。

2 結(jié)果

2.1 齊墩果酸對大鼠SAH分級(jí)的影響 如圖1所示，SAH模型組蛛網(wǎng)膜下腔出血嚴(yán)重，SAH評分顯著降低，而齊墩果酸給藥能夠減輕SAH出血的發(fā)生，降低SAH的評分。

圖1 齊墩果酸給藥對蛛網(wǎng)膜下腔出血24 h后SAH評分的影響

2.2 齊墩果酸對SAH大鼠神經(jīng)功能損傷的影響 依照行為學(xué)評分標(biāo)準(zhǔn)，分值越低表明神經(jīng)損傷越嚴(yán)重，反之亦然。與假手術(shù)組相比，SAH模型組大鼠均出現(xiàn)了嚴(yán)重的神經(jīng)損傷癥狀(P<0.001)。而齊墩果酸給藥(20 mg/kg)能夠顯著改善大鼠的神經(jīng)功能(P<0.01)。見圖2。

圖2 齊墩果酸給藥對蛛網(wǎng)膜下腔出血24 h后神經(jīng)功能損傷的影響

2.3 齊墩果酸對SAH大鼠腦水腫和腦血管通透性的影響 與假手術(shù)相比，SAH模型組腦含水量明顯增加，而齊墩果酸給藥組能夠顯著降低腦含水量(P<0.01)。SAH模型后，伊文思藍(lán)浸出明顯增加，說明腦血管通透性增強(qiáng)，齊墩果酸給藥降低腦內(nèi)伊文思藍(lán)含量，對腦血管通透性具有顯著的改善作用(P<0.01)。見圖3。

圖3 齊墩果酸對SAH大鼠腦組織含水量

2.4 齊墩果酸對SAH大鼠VEGF-Src信號(hào)通路的影響 如圖4所示，SAH組大鼠腦組織中VEGF表達(dá)明顯增加，而齊墩果酸給藥后，VEGF的表達(dá)顯著降低(P<0.01)。對p-Src和Src的表達(dá)進(jìn)行檢測發(fā)現(xiàn)，SAH模型組大鼠腦組織Src活化，磷酸化Src表達(dá)增加，而齊墩果酸給藥組顯著抑制Src的磷酸化。

圖4 齊墩果酸對SAH大鼠VEGF-Src信號(hào)通路的影響

2.5 齊墩果酸對SAH大鼠腦組織黏附連接蛋白表達(dá)的影響 如圖5所示，與假手術(shù)組相比，SAH組ZO-1、Claudin-5、Occludin蛋白表達(dá)顯著降低(P<0.01)。與模型組相比，齊墩果酸給藥后能夠顯著恢復(fù)這種變化，增加ZO-1、Claudin-5、Occludin蛋白的表達(dá)(P<0.05)。

3 討論

蛛網(wǎng)膜下腔出血是一種常見的出血性腦血管疾病，多見于動(dòng)脈瘤的破裂。SAH發(fā)生后，可引起一系列的并發(fā)癥，如腦水腫、腦血管基底動(dòng)脈痙攣、肺水腫等。其中腦水腫是SAH后較嚴(yán)重的并發(fā)癥，也是蛛網(wǎng)膜下腔出血患者致死致殘、預(yù)后差的主要原因之一。齊墩果酸具有多種生物活性，有潛在的抗炎和神經(jīng)保護(hù)作用。本研究采用顱內(nèi)動(dòng)脈穿刺法建立大鼠SAH模型，該模型比較接近人類動(dòng)脈瘤性蛛網(wǎng)膜下腔出血的病理生理過程，但缺點(diǎn)是難以控制出血速度與出血量，由于出血量的不同，SAH的程度不一致，影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果的可靠性。出血量的多少可通過改變尼龍絲尖端直徑的大小來控制[10]，本研究采用相同的尼龍線進(jìn)行實(shí)驗(yàn)操作，盡量避免手術(shù)差異，并選取SAH損傷程度相近的模型進(jìn)行實(shí)驗(yàn)和統(tǒng)計(jì)。本研究結(jié)果顯示，齊墩果酸對SAH大鼠的神經(jīng)功能損傷具有顯著的改善作用。大鼠SAH后24 h腦含水量和伊文思藍(lán)滲出明顯增加，而齊墩果酸給藥后，大鼠腦含水量和伊文思藍(lán)滲透率明顯降低，說明齊墩果酸能有效減輕SAH引起的腦水腫和腦血管通透性的破壞。

圖5 齊墩果酸對SAH大鼠腦組織ZO-1蛋白表達(dá)的影響

腦血管內(nèi)皮屏障主要與腦血管內(nèi)皮細(xì)胞間的通透性相關(guān)。緊密連接是維持內(nèi)皮細(xì)胞選擇滲透性屏障功能的關(guān)鍵要素，緊密連接蛋白ZO-1、Claudin-5、Occludin是構(gòu)成緊密連接的重要成分，其表達(dá)、功能和結(jié)構(gòu)的改變可引起緊密連接解離，細(xì)胞間隙加大，從而增加血管通透性。研究表明，實(shí)驗(yàn)性蛛網(wǎng)膜下腔出血可以損傷內(nèi)皮屏障功能，導(dǎo)致通透性增加，引起組織或器官水腫和功能障礙。并且，大量研究發(fā)現(xiàn)，在大鼠SAH模型中，ZO-1、Claudin-5、Occludin表達(dá)顯著減低，緊密連接破壞，通透性顯著增加，加重腦水腫的發(fā)生。因而保護(hù)屏障功能，降低血管通透性，可能是減輕SAH后早期腦損傷的關(guān)鍵環(huán)節(jié)之一。血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)是一種多效細(xì)胞因子，具有促有絲分裂和通透性相關(guān)的多種功能。一些研究已經(jīng)證明，VEGF的表達(dá)上調(diào)是實(shí)驗(yàn)性SAH后BBB破壞腦水腫形成的發(fā)病機(jī)制[11]，并且VEGF活化導(dǎo)致Src酪氨酸激酶的磷酸化[12]。Src介導(dǎo)VEGF對BBB通透性的改變，抑制Src可減弱血管通透性，減少腦水腫及缺血性中風(fēng)后的腦梗死的發(fā)生[13-14]。

本研究針對齊墩果酸對SAH后大鼠腦組織中ZO-1、Claudin-5、Occludin的表達(dá)變化及可能的作用機(jī)制進(jìn)行了考察，發(fā)現(xiàn)假手術(shù)組ZO-1、Claudin-5、Occludin蛋白表達(dá)明顯，在SAH組大鼠腦組織中其表達(dá)顯著減少，而齊墩果酸(20 mg/kg)可以改善SAH 后大鼠腦組織中ZO-1、Claudin-5、Occludin表達(dá)降低的情況，增加其蛋白的表達(dá)，進(jìn)而改善腦水腫，對SAH后早期腦損傷有保護(hù)作用。

￣綜上所述，齊墩果酸能夠減輕SAH后早期腦水腫，并改善神經(jīng)功能損傷，在SAH后早期腦損傷治療中有良好的應(yīng)用前景。本文為齊墩果酸改善SAH早期腦損傷、保護(hù)屏障功能、減輕腦水腫的可能的作用機(jī)制提供了參考依據(jù)，其具體機(jī)制仍有待深入研究。

[1] Dority JS,Oldham JS.Subarachnoid hemorrhage:an update[J].Anesthesiol Clin,2016,34(3):577-600.

[3] Fujii M,Yan J,Rolland WB,et al.Early brain injury,an evolving frontier in subarachnoid hemorrhage research[J].Transl Stroke Res,2013,4(4):432-446.

[4] Zhang T,Su J,Guo B,et al.Apigenin protects blood-brain barrier and ameliorates early brain injury by inhibiting TLR4-mediated inflammatory pathway in subarachnoid hemorrhage rats[J].Int Immunopharmacol,2015,28(1):79-87.

[5] Li Z,Liang G,Ma T,et al.Blood-brain barrier permeability change and regulation mechanism after subarachnoid hemorrhage[J].Metab Brain Dis,2015,30(2):597-603.

[6] Zhang C,Lee JY,Keep RF,et al.Brain edema formation and complement activation in a rat model of subarachnoid hemorrhage[J].Acta Neurochir Suppl,2013,118:157-161.

[7] Chattopadhyay R,Dyukova E,Singh NK,et al.Vascular endothelial tight junctions and barrier function are disrupted by 15(S)-hydroxyeicosatetraenoic acid partly via protein kinase C ε-mediated zona occludens-1 phosphorylation at threonine 770/772[J].J Biol Chem,2014,289(6):3148-3163.

[8] Sugawara T,Ayer R,Jadhav V,et al.A new grading system evaluating bleeding scale in filament perforation subarachnoid hemorrhage rat model[J].J Neurosci Methods,2008,167(2):327-334.

[9] Thal SC,Mebmer K,Schmid-Elsaesser R,et al.Neurological impairment in rats after subarachnoid hemorrhage-a comparison of functional tests[J].J Neurol Sci,2008,268(1-2):150-159.

[10]Schwartz AY,Masago A,Sehba FA,et al.Experimental models of subarachnoid hemorrhage in the rat:a refinement of the endovascular filament model[J].J Neurosci Methods,2000,96(2):161-167.

[11]Liu L,Fujimoto M,Kawakita F,et al.Vascular endothelial growth ractor in brain edema formation after subarachnoid hemorrhage[J].Acta Neurochir Suppl,2016,121:173-177.

[12]Song H,Zheng G,Shen XF,et al.Reduction of brain barrier tight junctional proteins by lead exposure:role of activation of nonreceptor tyrosine kinase src via chaperon GRP78[J].Toxicol Sci,2014,138(2):393-402.

[13]Hu G,Minshall RD.Regulation of transendothelial permeability by Src kinase[J].Microvasc Res,2009,77(1):21-25.

[14]Liu L,Fujimoto M,Kawakita F,et al.Anti-vascular endothelial growth factor treatment suppresses early brain injury after subarachnoid hemorrhage in mice[J].Mol Neurobiol,2016,53(7):4529-4538.

Effect of oleanolic acid on tight junctions of rat model after subarachnoid hemorrhage through VEGF-Src pathway

HAN Yu-wei,LIU Xiu-juan,GAO Yang,LI Xiao-ming*

(Institute of Neurology,General Hospital of Shenyang Military Command,Shenyang 110016,China)

Objective To explore the effect of oleanolic acid (OA) on early brain injury following subarachnoid hemorrhage (SAH) and explain its possible mechanism.Methods Totally 54 male SD rats were divided into 3 groups:sham group (n=18),SAH group (n=18) and OA-treated SAH group (n=18).The endovascular puncture model was used to induce SAH.Neurological score,brain water content and blood-brain barrier (BBB) were evaluated at 24 h after SAH.The protein expression of ZO-1,VEGF and Src was determined by Western blot.Results High-dose OA administration could significantly improve the neurological scores (P<0.01),reduce the brain water content and BBB permeability (P<0.01),up-regulate the expression of ZO-1,Claudin-5 and Occludin,and inhibit the expression of VEGF and Src phosphorylation (P<0.01).Conclusion OA can protect against the early brain injury after SAH and improve brain edema by increasing the expression of tight junctions.

Oleanolic acid;Subarachnoid hemorrhage;Brain edema;Tight junctions

2017-03-10

沈陽軍區(qū)總醫(yī)院神經(jīng)外科，沈陽 110016

*通信作者

10.14053/j.cnki.ppcr.201708001