干巴菌多糖對(duì)急性酒精損傷小鼠的抗氧化作用

徐菘陽,陸文娟,陶明煊,史 靜,任仕露

(南京師范大學(xué)金陵女子學(xué)院,江蘇南京 210097)

干巴菌多糖對(duì)急性酒精損傷小鼠的抗氧化作用

徐菘陽,陸文娟,陶明煊*,史 靜,任仕露

(南京師范大學(xué)金陵女子學(xué)院,江蘇南京 210097)

目的:研究干巴菌多糖(Refined polysaccharide fromThelephoraganbajun,RPTG)對(duì)急性酒精損傷小鼠心臟、脾臟及腎臟的保護(hù)作用。方法:經(jīng)超聲波輔助熱水浸提及去蛋白得到干巴菌多糖。將小鼠隨機(jī)分為空白對(duì)照組、模型組、陽性對(duì)照組、RPTG各劑量組,建立小鼠急性酒精肝損傷模型。取小鼠心臟、脾臟及腎臟,測定其丙二醛(malondialdehyde,MDA)、還原型谷胱甘肽(glutathione,GSH)含量;超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)、谷胱甘肽過氧化物酶(glutathione peroxidase,GSH-Px)及過氧化氫酶(catalase,CAT)活性。結(jié)果:與模型對(duì)照組相比,RPTG高、中、低劑量組均可以顯著或極顯著提高心臟、脾臟和腎臟的GSH含量、SOD活性、GSH-Px活性、CAT活性(p<0.05或p<0.01);均可以顯著或極顯著降低心臟、脾臟和腎臟的MDA含量(p<0.05或p<0.01)。結(jié)論:RPTG對(duì)酒精性肝損傷小鼠心臟、脾臟及腎臟具有明顯的抗氧化作用。

干巴菌多糖,酒精肝損傷,抗氧化,心臟,脾臟,腎臟

適量飲酒有助于減少心血管等疾病的發(fā)生,但過量飲酒卻嚴(yán)重威脅機(jī)體健康,特別是對(duì)心臟、脾臟及腎臟等內(nèi)臟造成不同程度的損傷[1-3]。酒精進(jìn)入人體后,大部分在肝臟內(nèi)被氧化為乙醛,最后生成二氧化碳和水,約5%的酒精由腎臟排出,這些水溶性的外源物質(zhì)在腎臟細(xì)胞和間質(zhì)內(nèi)積累、濃縮,對(duì)腎臟可能造成一定程度的損害[4-5]。酒精還可改變心肌細(xì)胞膜的通透性,破壞細(xì)胞的完整性,導(dǎo)致一系列心血管疾病[6]。此外,酒精對(duì)哺乳動(dòng)物的脾臟生長發(fā)育具有抑制作用,會(huì)使脾臟重量減輕,脾臟細(xì)胞發(fā)生脂質(zhì)過氧化,增強(qiáng)細(xì)胞通透性,導(dǎo)致膜表面受體受損,進(jìn)而影響機(jī)體的免疫機(jī)能[7]。

干巴菌(Thelephoraganbajun)也叫繡球菌、馬牙菌等,為云南所特有,是一種極其珍貴的野生食藥用真菌[8]。同其它食用菌相比,干巴菌不僅味道鮮美,同時(shí)也含有多糖、蛋白質(zhì)、抗生素等多種營養(yǎng)物質(zhì),具有很高的營養(yǎng)保健價(jià)值[9-10]。研究表明,干巴菌有抗氧化、抗腫瘤、提高免疫力等功效[11-12],但目前國內(nèi)外關(guān)于干巴菌的研究報(bào)道仍然較少。本實(shí)驗(yàn)以干巴菌為原料,研究干巴菌多糖(Refined polysaccharide fromThelephoraganbajun,RPTG)對(duì)急性酒精性損傷小鼠心臟、脾臟及腎臟的抗氧化作用,為天然藥物或保健食品的研制、開發(fā)提供理論和實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 主要材料

干巴菌子實(shí)體干品 云南納西田野食品店;蛋白試劑盒 南京建成生物工程研究所;四乙氧基丙烷 美國Fluka公司;還原性谷胱甘肽 美國sigma公司;氯化硝基四氮唑藍(lán)(nitroblue tetrazolium,NBT),甲硫氨酸,核黃素,EDTA-2 Na,磷酸鹽,硫代巴比妥酸(TBA),十二烷基硫酸鈉(SDS),乙酸鹽,H2O2,疊氮鈉磷酸鹽,偏磷酸,三氯乙酸,磷酸氫二鈉(Na2HPO4),2-硝基苯甲酸(DTNB)等生化試劑為國產(chǎn)分析純。ICR健康雄性小鼠 6周齡左右,體重(26±2) g,在江蘇省中醫(yī)院動(dòng)物飼養(yǎng)中心飼養(yǎng),實(shí)驗(yàn)動(dòng)物許可證號(hào)(SYXK(蘇)2012-0047)。飼養(yǎng)實(shí)驗(yàn)室環(huán)境溫度為(23±2) ℃,濕度50%±5%,每日照明12 h,晝夜12 h交替。

JA5003N電子天平、HH-6數(shù)顯恒溫水浴鍋GL-22M高速冷凍離心機(jī) 湖南賽特湘儀離心機(jī)儀器有限公司;DHG-9140電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱 上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司;754紫外可見分光光度計(jì) 上海光譜儀器有限公司;722可見分光光度計(jì) 上海精密科學(xué)儀器有限公司;JY92-II超聲細(xì)胞破碎儀 寧波新芝生物科技有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 干巴菌子實(shí)體預(yù)處理 去除雜質(zhì),于60 ℃低溫烘干至恒重,粉碎,過80目篩,制成干巴菌細(xì)粉。細(xì)粉冰水浴中經(jīng)超聲波破碎(600 W)、89 ℃熱水浸提、6000 r/min離心10 min、取上清濃縮、4倍體積乙醇沉淀、低溫干燥等步驟后,得到粗多糖。取粗多糖溶液4 mL,與預(yù)先配制成體積比為4∶1混合液的氯仿-正丁醇溶液1 mL混合,置于具塞試管中,充分振搖30 min后,經(jīng)離心機(jī)4000 r/min 4 ℃離心15 min,然后將水相與氯仿相分開。將水相再加入相當(dāng)于其體積1/4的氯仿-正丁醇溶液,重復(fù)上述過程,共計(jì)重復(fù)三次(Sevage法脫蛋白)。脫蛋白后透析一晝夜、乙醇沉淀、-80 ℃冷凍干燥后得干巴菌精多糖(RPTG),經(jīng)測定多糖含量為67.61%,蛋白含量為1.71%。

1.2.2 酒精誘導(dǎo)急性肝損傷動(dòng)物模型的建立 66只小鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)3 d后,隨機(jī)分為空白對(duì)照組、模型對(duì)照組、聯(lián)苯雙酯陽性對(duì)照組(150 mg/kg·bw)、RPTG各劑量組(100、200、400 mg/kg·bw),每組11只。聯(lián)苯雙酯滴丸及RPTG均用蒸餾水配制,每天同一時(shí)間段(上午九至十點(diǎn)之間)灌胃一次,連續(xù)灌胃30 d,實(shí)驗(yàn)期間供給小鼠全價(jià)顆粒飼料,不限制飲食飲水,每天更換墊料1次并對(duì)小鼠進(jìn)行稱重,以調(diào)整受試樣品的劑量。實(shí)驗(yàn)第31 d時(shí),各組小鼠禁食不禁水12 h后,模型組、陽性對(duì)照組及RPTG各劑量組均灌予50%的乙醇溶液(12 mL/kg),建立小鼠急性酒精肝損傷模型,用等體積的生理鹽水對(duì)空白對(duì)照組小鼠進(jìn)行灌胃。12 h后,除去死亡小鼠,各組取10只小鼠,脫臼處死后,迅速解剖取出心臟、脾臟及腎臟,用生理鹽水洗凈,-20 ℃下冷藏備用,測定抗氧化指標(biāo)。

1.2.3 臟器勻漿的制備 取小鼠臟器,用冰生理鹽水漂洗,除去污血,濾紙拭干后準(zhǔn)確稱取0.1 g,剪碎并加入0.9 mL的生理鹽水中,冰水浴中進(jìn)行超聲破碎(400 W,20 s,6次)后,于4 ℃條件下10000 r/min離心10 min,取上清液即為10%臟器勻漿液,用于測定MDA、GSH含量;10%臟器勻漿液與飽和硫酸銨溶液按3∶1 (v/v)混合,離心取上清液,用于測定SOD、GSH-px、CAT活性。

1.2.4 蛋白質(zhì)的測定 小鼠臟器勻漿中的蛋白含量嚴(yán)格按蛋白試劑盒說明書提供的方法測定。

1.2.5 SOD活性的測定 采用NBT法[13]測定SOD活性。

1.2.6 GSH含量的測定 測定方法參照陸文蔚等人[14]所做相關(guān)實(shí)驗(yàn)。

1.2.7 MDA含量的測定 采用TBA法[15]測定MDA含量。

1.2.8 GSH-Px活性的測定 采用DTNB法[16]測定GSH-Px活性。

在動(dòng)物屠宰前，采集其新鮮尿液樣本3 mL，若屠宰后得不到尿液樣本，可以取酮體肌肉5 g，制備為末，將其放置于試管中，加入10 mL蒸餾水，煮沸2 min，待溶液冷卻后，用吸管吸取上層清澈液體3 mL，進(jìn)行測試卡檢測[2]。經(jīng)過煮沸后，如果發(fā)現(xiàn)液體較為渾濁，可以將試管放置在離心機(jī)，離心處理5 min，或者選擇濾紙進(jìn)行過濾處理，直到得到的溶液清澈為止。

1.2.9 CAT活性的測定 采用紫外吸收法[17]測定CAT活性。

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

2 結(jié)果與分析

2.1 RPTG對(duì)酒精所致急性損傷小鼠心臟、脾臟及腎臟SOD活性的影響

SOD是生物體內(nèi)重要的抗氧化酶,能有效清除代謝過程中產(chǎn)生的氧自由基,減緩細(xì)胞衰老進(jìn)程,測定其活性可間接反映機(jī)體的抗氧化能力。由表1可知,酒精造模后,與空白對(duì)照組相比,模型對(duì)照組小鼠各臟器SOD活性顯著降低,并呈極顯著差異(p<0.01),提示酒精造模成功。喂飼RPTG后,小鼠各臟器SOD活性隨著RPTG劑量的增加而不斷的提高,呈一定的量效關(guān)系。RPTG高劑量組小鼠心臟、脾臟和腎臟SOD活性值相比于模型對(duì)照組分別提高了50.44%、29.44%、21.51%。其中腎臟的SOD活性達(dá)到陽性對(duì)照組水平(p>0.05)。表明RPTG可有效提高小鼠心臟、脾臟及腎臟的SOD活性,增強(qiáng)自由基清除能力,減輕酒精對(duì)其的損害。

表1 RPTG對(duì)小鼠心臟、脾臟及腎臟SOD活性(U/mg prot)的影響(n=10)Table 1 Effects of RPTG on SOD activity(U/mg prot)in heart,spleen and kidney of mice(n=10)

注：同列數(shù)據(jù)尾標(biāo)不同小寫字母表示在5%水平差異顯著(p<0.05),不同大寫字母表示在1%水平差異顯著(p<0.01);表2～表5同。

表2 RPTG對(duì)小鼠心臟、脾臟及腎臟GSH含量(μmol/g prot)的影響(n=10)Table 2 Effects of RPTG on GSH content(μmol/g prot)in heart,spleen and kidney of mice(n=10)

表3 RPTG對(duì)小鼠心臟、脾臟及腎臟MDA含量(nmol/g prot)的影響(n=10)Table 3 Effects of RPTG on MDA content(nmol/g prot)in heart and spleen and kidney of mice(n=10)

2.2 RPTG對(duì)酒精所致急性損傷小鼠心臟、脾臟及腎臟GSH含量的影響

GSH是由谷氨酸、半胱氨酸、甘氨酸組成的小分子肽,是一種重要的抗氧化劑,其結(jié)構(gòu)中含有極其活潑的巰基,容易氧化脫氫,從而可清除自由基。由表2可知,模型對(duì)照組小鼠各臟器GSH含量明顯低于空白對(duì)照組,且呈極顯著差異(p<0.01),喂飼RPTG后,小鼠各臟器GSH含量隨著RPTG劑量的增加而不斷的提高,呈一定的量效關(guān)系。RPTG高劑量組小鼠心臟、脾臟和腎臟GSH含量相比于模型組分別提高了63.49%、146.47%、216.98%。其中脾臟、腎臟GSH含量達(dá)到陽性對(duì)照組水平(p>0.05),且與空白對(duì)照組無顯著性差異(p>0.01)。表明RPTG可有效提高小鼠脾臟、心臟及腎臟的GSH含量,提高其抗氧化能力,對(duì)酒精性臟器損傷具有一定的保護(hù)作用。

2.3 RPTG對(duì)酒精所致急性損傷小鼠心臟、脾臟及腎臟MDA含量的影響

MDA是生物體內(nèi)脂質(zhì)過氧化反應(yīng)的終產(chǎn)物,其含量可反映機(jī)體內(nèi)脂質(zhì)過氧化的程度,間接地反映出細(xì)胞損傷程度。由表3可知,與空白對(duì)照組相比,模型對(duì)照組小鼠各臟器MDA含量顯著升高(p<0.01),喂飼RPTG后,小鼠各臟器MDA含量隨著RPTG劑量的增加而不斷的降低,且呈一定的量效關(guān)系。RPTG高劑量組小鼠心臟、脾臟和腎臟MDA含量相比于模型組分別降低了47.53%、62.35%、73.13%。其中腎臟、心臟MDA含量達(dá)到陽性對(duì)照組水平(p>0.05),脾臟MDA含量甚至好于陽性對(duì)照組水平。表明RPTG可降低小鼠脾臟、心臟及腎臟的MDA含量,提高臟器抗氧化水平,減少脂質(zhì)過氧化,對(duì)酒精性臟器損傷具有一定的改善作用。

2.4 RPTG對(duì)酒精所致急性損傷小鼠心臟、脾臟及腎臟GSH-Px活性的影響

GSH-Px是廣泛存在于機(jī)體內(nèi)的一種含硒酶,可催化H2O2分解,保護(hù)細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)和功能的完整。由表4可知,模型對(duì)照組小鼠各臟器GSH-px活性較空白對(duì)照組明顯降低,并呈極顯著差異(p<0.01)。喂飼RPTG后,小鼠各臟器GSH-px活性隨著RPTG劑量的增加而不斷的提高,且呈一定的量效關(guān)系。RPTG高劑量組小鼠心臟、脾臟和腎臟的GSH-px活性值相比于模型組分別提高了41.59%、83.65%、57.09%。其中心臟、腎臟GSH-Px活性達(dá)到陽性對(duì)照組水平(p>0.05),說明RPTG可提高小鼠心臟、脾臟及腎臟的GSH-Px活性,提高其清除自由基能力,減輕酒精對(duì)其的損害。

表4 RPTG對(duì)小鼠心臟、脾臟及腎臟GSH-px活性(U/mg prot)的影響(n=10)Table 4 Effects of RPTG on GSH-Px activity(U/mg prot)in heart and spleen and kidney of mice(n=10)

表5 RPTG對(duì)小鼠心臟、脾臟及腎臟CAT活性(U/mg)的影響(n=10)Table 5 Effects of RPTG on CAT activity(U/mg)in heart and spleen and kidney of mice(n=10)

2.5 RPTG對(duì)酒精所致急性損傷小鼠心臟、脾臟及腎臟CAT活性的影響

CAT可催化H2O2分解為水和分子氧,從而清除機(jī)體內(nèi)的過氧化氫,減輕其對(duì)細(xì)胞的損害。由表5可知,與空白對(duì)照組相比,模型對(duì)照組小鼠各臟器CAT活性顯著降低,并呈極顯著差異(p<0.01),提示酒精造模成功。喂飼RPTG后,小鼠各臟器CAT活性隨著RPTG劑量的增加而不斷的提高,呈一定的量效關(guān)系。RPTG高劑量組小鼠心臟、脾臟和腎臟CAT活性值相比于模型組分別提高了90.51%、150.15%、69.96%,其中脾臟CAT活性與陽性對(duì)照組水平相接近。以上結(jié)果表明RPTG可提高小鼠心臟、脾臟及腎臟的CAT活性,增強(qiáng)自由基清除能力,對(duì)酒精性臟器損傷具有一定的改善作用。

3 結(jié)論與討論

過量攝入酒精,對(duì)哺乳動(dòng)物脾臟的生長發(fā)育具有顯著性抑制作用,它會(huì)使哺乳動(dòng)物脾臟的重量降低,引起脾臟細(xì)胞發(fā)生脂質(zhì)過氧化,并增強(qiáng)細(xì)胞膜通透性,導(dǎo)致膜表面受體受損[18];也會(huì)改變心肌細(xì)胞膜的通透性,破壞細(xì)胞的完整性,抑制心肌收縮力[19-20];同時(shí)腎臟氧化排泄的酒精代謝產(chǎn)物會(huì)在腎臟細(xì)胞和間質(zhì)內(nèi)積累、濃縮,對(duì)腎臟造成一定程度的損害[4-5]。而且乙醇在機(jī)體代謝過程中會(huì)產(chǎn)生大量的活性氧(ROS),如羥自由基(·OH)、超氧陰離子自由基等[21]。這些自由基氧化能力極強(qiáng),可破壞體內(nèi)氧化體系動(dòng)態(tài)平衡,極易造成氧化應(yīng)激、破壞脂質(zhì)氧化-抗氧化進(jìn)程,導(dǎo)致生物膜嚴(yán)重受損,促進(jìn)脂質(zhì)氧化過程[22-23]。自由基還會(huì)導(dǎo)致蛋白質(zhì)、DNA等生物大分子發(fā)生修飾、交聯(lián),破壞其正常結(jié)構(gòu)和功能,導(dǎo)致細(xì)胞的功能性與完整性被破壞,對(duì)心臟、脾臟及腎臟等器官均存在一定危害[24-26]。

SOD、CAT、GSH-Px、MDA、GSH水平是衡量臟器抗氧化程度的重要指標(biāo),其中SOD、CAT、GSH-px為機(jī)體內(nèi)重要的抗氧化酶類,GSH為體內(nèi)非酶促系統(tǒng)重要的抗氧化劑[27]。大量研究表明,多糖具有較好的清除自由基能力。多糖可以通過提高機(jī)體抗氧化酶類的活性,間接起到抗氧化作用。多糖是由多個(gè)單糖以糖苷鍵連接而成的高分子碳水化合物,其碳?xì)滏溕系臍湓涌梢耘c羥自由基(·OH)結(jié)合生成穩(wěn)定的化合物水,達(dá)到直接清除自由基、阻斷自由基反應(yīng)鏈的目的。此外,多糖上的羥基可以絡(luò)合產(chǎn)生活性氧所必需的金屬離子,抑制自由基的生成,阻止脂質(zhì)過氧化物的分解。而且多糖可以通過促進(jìn)SOD從細(xì)胞表面釋放以清除自由基,進(jìn)而阻止自由基引發(fā)一系列連鎖反應(yīng),達(dá)到抗氧化作用[28-31]。

本實(shí)驗(yàn)以干巴菌為原材料提取多糖,并通過建立小鼠急性酒精性臟器損傷模型,測定各組小鼠臟器SOD、CAT、GSH-px、MDA、GSH水平,研究RPTG對(duì)小鼠心臟、脾臟及腎臟酒精性損傷的保護(hù)作用,其機(jī)制是過量乙醇進(jìn)入機(jī)體,代謝產(chǎn)生大量活性氧自由基,導(dǎo)致SOD、GSH、GSH-Px、CAT耗竭,機(jī)體抗氧化防御機(jī)能降低,細(xì)胞膜脂質(zhì)過氧化,最終導(dǎo)致其產(chǎn)物MDA含量升高。結(jié)果表明,造模后,與空白組相比,模型組小鼠臟器中SOD、CAT、GSH-px活性及GSH含量顯著降低,而MDA含量顯著升高,表明大量飲酒后,小鼠臟器存在著明顯的氧化應(yīng)激,提示酒精造模成功。與模型組相比,預(yù)先喂飼RPTG各劑量組可不同程度提高小鼠臟器中SOD、CAT、GSH-Px活性及GSH含量,降低MDA含量,并有一定的量效關(guān)系,其機(jī)制可能是RPTG具有一定的抗氧化作用,可有效提高抗氧化酶或抗氧化因子的活性,清除酒精代謝過程中產(chǎn)生的氧自由基,抑制體內(nèi)有害反應(yīng),增強(qiáng)臟器脂質(zhì)代謝能力,從而減輕臟器受損程度[32-33]。

綜上,實(shí)驗(yàn)結(jié)果說明RPTG能夠提高急性酒精性損傷小鼠心臟、脾臟和腎臟的抗氧化酶活性,增強(qiáng)機(jī)體抗氧化能力,減輕酒精對(duì)以上臟器的毒害。RPTG具有較好的抗酒精性臟器損傷作用,機(jī)制與其較強(qiáng)的抗氧化作用有關(guān),因此RPTG有望被開發(fā)成一種抗化學(xué)性臟器損傷的保健食品。

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Antioxidant effects of polysaccharides fromThelephoraganbajunin mice with acute alcoholic injury

XU Song-yang,LU Wen-juan,TAO Ming-xuan*,SHI Jing,REN Shi-lu

(Ginling College,Nanjing Normal University,Nanjing 210097,China)

Objective:To research the protective effiect of dry fungus polysaccharides(refined polysaccharide fromThelephoraganbajun,RPTG)on acute alcohol injury to the heart,spleen and kidney of mice. Methods:Dry fungus polysaccharides were gained after hot water extraction assisted by the ultrasonic as well as deproteinization. The mice were randomly divided into groups as follows:normal control group,model group,positive control group and RPTG groups to establish the mouse model of acute liver injury. The mice heart,spleen and kidney were removed to determine superoxide dismutase(superoxide dismutase,SOD),malondialdehyde(malondialdehyde,MDA),glutathione(glutathione,GSH)content,glutathione peroxidase(glutathione peroxidase GSH-Px)and catalase activity(catalase,CAT). Results:Comparing with the model control group,RPTG groups in high,middle and low doses all can on the one hand remarkably or extremely remarkably enhance the GSH content and the SOD,GSH-Px,CAT activities(p<0.05 orp<0.01),as well as on the other hand significantly or extremely significantly reduce the MDA content(p<0.05 orp<0.01)in the heart,spleen and kidney. Conclusion:RPTG has significant antioxidant effect on the heart,spleen and kidney of mice which suffer from alcoholic liver injury.

Thelephoraganbajunpolysaccharide;alcoholic liver injury;antioxidant;heart;spleen;kidney

2017-02-21

徐菘陽(1993-)，男，碩士研究生，研究方向：生物活性物質(zhì)與保健功能因子，E-mail：elijahhsu@hotmail.com。

*通訊作者:陶明煊(1970-)，男，碩士，副教授，研究方向：生物活性物質(zhì)與保健功能因子，E-mail：45017@njnu.com。

TS201.4

A

1002-0306(2017)15-0314-05

10.13386/j.issn1002-0306.2017.15.059