酪蛋白酸鈉和阿拉伯膠相互作用的研究及納米粒的制備

劉春花,周愛梅,*,楊 苒,彭丹盈,劉 欣,曹 庸

(1.華南農(nóng)業(yè)大學食品學院,廣東廣州 510642; 2.廣東省天然活性物工程技術研究中心,廣東廣州 510642)

酪蛋白酸鈉和阿拉伯膠相互作用的研究及納米粒的制備

劉春花1,2,周愛梅1,2,*,楊 苒1,彭丹盈1,劉 欣1,2,曹 庸1,2

(1.華南農(nóng)業(yè)大學食品學院,廣東廣州 510642; 2.廣東省天然活性物工程技術研究中心,廣東廣州 510642)

酪蛋白酸鈉,阿拉伯膠,相互作用,納米粒,穩(wěn)定性,機制

功能性食品中具有生理功效的活性物質(zhì),如維生素、益生菌、活性多肽等,在進入人體后能夠促進健康,但其在體內(nèi)的生物利用度低[1]。納米技術(nanotechnology)的出現(xiàn)成為解決生物活性物低口服生物利用度問題的一種有效途徑[2]。納米粒制備是納米技術應用于生產(chǎn)的重要途徑之一。納米粒(nanoparticles)是直徑為10～1000 nm的一類聚合物膠體系統(tǒng),由于其微小體積和特殊結構,在胃腸道能成批地被轉(zhuǎn)運,因此除具備傳統(tǒng)活性物輸送體系所具有的諸如提高活性物的溶解度、增加活性物的穩(wěn)定性以及緩釋等優(yōu)點外,還可以大幅度地改變活性成分的組織分布和代謝,提高功能效果并降低毒副作用[3]。

構建納米粒的載體材料要求具有良好的生物相容性和生物可降解性,并且是一般認為安全(Generally recognized as safe,GRAS)級別。以往報道的一些納米粒的構建涉及使用具有潛在毒性的溶劑或不可降解的材料,增加了口服利用的難度[4],因此需要一些更為安全的食品級大分子來應對這一挑戰(zhàn)。蛋白質(zhì)和多糖是食品體系中的兩類重要的大分子,它們通過相互作用形成的納米粒除能滿足上述要求外,還對包埋的活性物具有更為突出的承載效果和靶向傳遞效果,最終實現(xiàn)活性物的緩釋和控釋[5]。因此利用蛋白質(zhì)與多糖之間的相互作用構建納米粒并作為活性物質(zhì)的輸送載體是近年來納米領域的研究熱點[6]。

酪蛋白酸鈉(SC)具有良好的表面活性、穩(wěn)定性、成膠性、親水性和自組裝特性[7],是良好的制備納米載體的材料[8]。同時,阿拉伯膠(GA)具有良好的水溶性和穩(wěn)定性且無毒、生物相容性好、可生物降解,也是理想的載體材料[9]。但目前關于SC和GA相互作用及利用兩者相互作用制備納米粒的研究很少,且現(xiàn)有研究不深入、不系統(tǒng),仍有很多關鍵技術和科學問題需要解決[10-11]。因此本文以SC與GA復合體系作為研究對象,通過調(diào)控體系 pH、SC/GA濃度比、SC與GA總濃度和NaCl濃度,研究不同因素對SC和GA相互作用及納米粒形成的影響,探討SC和GA相互作用形成納米粒的機制,為利用SC與GA復合物制備納米遞送載體提供一定的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

酪蛋白酸鈉(純度98%)和阿拉伯膠(純度97%) 均購自美國Sigma公司,其他試劑均為分析純 來自國藥集團化學試劑有限公司。

AL104萬分之一電子天平、FE20 pH計 梅特勒-托利多儀器有限公司;JK-MSH-Pro-6B多頭獨立控溫磁力加熱攪拌器 上海精學科學儀器有限公司;PC950連續(xù)濁度比色計 美國安東帕(STH)公司;90 plus納米粒度及Zeta電位儀 美國布魯克海文儀器有限公司;JEM-2100F場發(fā)射電子顯微鏡 日本電子株式會社;VERTEX 70傅里葉變換紅外光譜儀 德國BRUKER公司;RF-5301PC熒光分光光度計 島津制作所。

1.2 實驗方法

1.2.1 SC和GA貯藏液的制備 將一定質(zhì)量的SC和GA溶于去離子水中,配制成濃度分別為10 mg/mL和10、100 mg/mL的SC和GA溶液,于600 r/min、室溫下攪拌3 h,然后置于4 ℃靜置過夜,得到SC和GA貯藏液。制備SC-GA復合物時將貯藏液按照對應的配比加入到相應濃度的NaCl體系中。實驗中用到的所有試劑、溶液均用0.45μm濾膜過濾后使用。

1.2.2 不同因素對SC與GA相互作用及納米粒形成的影響 參照Ye等[10]的方法并稍作改進:在轉(zhuǎn)速為400 r/min、25 ℃下攪拌條件下,加入一定濃度的NaCl(0、5、10、20、30、40、50、60、80、100 mmol/L,固定SC/GA濃度比為1∶2,SC與GA總濃度為3 mg/mL),調(diào)節(jié)pH至6.5附近,按照一定SC/GA濃度比(9∶1、5∶1、4∶1、2∶1、1∶1、1∶2、1∶4、1∶5、1∶9,固定SC與GA總濃度為3 mg/mL,NaCl濃度為10 mmol/L)加入SC貯藏液,將GA貯藏液按照對應的比例逐滴加至攪拌的SC溶液中,控制體系中SC和GA的總濃度(4、3、2、1.5、1.2、0.9、0.6、0.3 mg/mL,固定SC/GA濃度比為1∶2,NaCl濃度為10 mmol/L)為一定值,將體系pH從6.5調(diào)節(jié)到2.0左右,在調(diào)節(jié)到一定pH時取樣,靜置24 h,測定復合物的濁度,以pH為橫坐標、濁度為縱坐標繪制相變圖,同時表征復合物的粒徑和Zeta電位,以研究pH、SC/GA濃度比、SC與GA總濃度和NaCl濃度等因素對SC與GA相互作用及納米粒形成的影響。

1.2.3 濁度的測定 按上述方法制備SC-GA復合物,在25 ℃下用PC 950連續(xù)濁度比色計在420 nm波長下對樣品的透光率進行測定,再根據(jù)下式計算濁度(Turbidity,T)。每次測量前均用去離子水將透光率校準到100%。

Turbidity(%)=100%-透光率

1.2.4 動態(tài)光散射粒徑分析 取上述方法制備的SC-GA復合物溶液適量于樣品池中通過動態(tài)光散射法(DLS)測定納米粒復合物在水中的流體力學直徑Dh(Particle size)和多分散指數(shù)(Polydispersity index,PDI)。

1.2.5 Zeta電位分析 利用Zeta電位儀通過耙電極測定樣品通電后的電泳遷移率,計算納米粒復合物的Zeta電位。

1.2.6 微觀形貌分析 采用透射電鏡(transmission electron microscopy,TEM)觀察SC-GA納米粒的表面形態(tài)及大小。將待測樣品滴在干凈的銅網(wǎng)表面,保持2 min,用濾紙擦凈多余的樣品溶液,然后用2%(w/v)的磷鎢酸溶液染色3 min,吸去多余的染液,在空氣中經(jīng)數(shù)分鐘風干后進行電鏡觀察,測試加速電壓為80 kV。

1.2.7 納米粒貯藏穩(wěn)定性研究 在SC/GA濃度比為1∶1,pH4.2,SC與GA總濃度3 mg/mL,10 mmol/L NaCl條件下制備納米粒,于4 ℃下分別貯藏7、15、30 d后進行粒徑和Zeta電位的表征。

1.2.8 傅里葉紅外光譜(FTIR)分析 取少許SC、GA、兩者的混合物(按照質(zhì)量比1∶1研磨,混合均勻)和凍干的SC-GA納米粒樣品,分別按1∶100的比例與溴化鉀混合研磨,經(jīng)壓片機壓成透明的薄片,在4000～400 cm-1的范圍以4 cm-1的分辨率掃描32次,采集樣品圖譜,環(huán)境溫度為25 ℃。在與測試樣品相同的條件下采集背景。

1.2.9 熒光光譜分析 固定SC濃度為0.5 mg/mL,按照SC/GA(濃度比)為0∶1、1∶1、1∶2、1∶4、1∶6、1∶8、1∶10、1∶12、1∶16、1∶20的比例制備SC-GA納米粒復合物,分別在25、35 ℃水浴中保溫3 h后進行測定。測定過程中固定激發(fā)波長λex=280 nm,激發(fā)狹縫和發(fā)射狹縫分別為5、3 nm。熒光掃描速度為1200 nm/min,掃描范圍分別為300～500 nm。

1.2.10 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析 實驗數(shù)據(jù)采用Origin 9.0軟件作圖,SPSS Statistics 17.0.1 軟件進行方差分析,所有實驗均重復3次。

2 結果與分析

2.1 SC與GA溶液的濁度、Zeta電位隨pH的變化

濁度可以有效的表征兩種物質(zhì)復合凝聚的過程,它在一定程度上可以反映分散質(zhì)的大小,濁度越大,說明體系中大分子顆粒物的數(shù)量越多[12]。SC與GA溶液濁度隨pH變化的結果如圖1所示,隨著pH的降低,GA溶液的濁度沒有顯著性變化(p>0.05),說明GA溶液受pH影響小,穩(wěn)定性好。SC卻不同,開始階段,隨著pH的降低,濁度沒有顯著性變化(p>0.05),當 pH<6.0時,濁度開始顯著地增大(p<0.01),這是因為此時SC中的4種酪蛋白按照一定的順序(先κ,β，然后αs1，最后αs2)發(fā)生溶解,同時SC結構中的膠體磷酸鈣從其膠粒中溶解出來,SC的膠束結構傾向于聚集,所以濁度會顯著增大[13];直到pH達到5.1時,濁度達到最大,之后繼續(xù)降低pH,濁度顯著地降低(p<0.01),這是因為SC結構中的膠體磷酸鈣完全溶解,膠體所帶電荷下降導致膠粒間的靜電排斥作用減弱,發(fā)生自聚集形成大顆粒的絮狀沉淀物,此時發(fā)生相分離[14];當pH達到4.6時,濁度最小,這是因為體系此時達到SC的等電點,SC的溶解度最低,沉淀量達到最大,沉降到底部;繼續(xù)降低pH,濁度開始增大(p<0.01),這是因為SC鏈上所帶的正電荷越來越多,靜電斥力逐漸增大致使聚集的沉淀物開始發(fā)生部分解離[15];當pH達到3.5時,濁度達到第二個極值點,說明此時沉淀發(fā)生完全解離;之后降低pH,濁度逐漸降低,這是因為隨著pH的進一步降低,SC分子鏈上帶有更多的正電荷,SC的溶解度增加從而導致體系濁度降低[16]。

圖1 SC與GA濁度隨pH的變化 Fig.1 Change of turbidity of pH of SC and GA under different pH注:SC、GA濃度均為1 mg/mL,NaCl 濃度:0 mmol/L。

對SC和GA在不同pH下的Zeta電位進行表征,結果如圖2所示。圖2顯示SC等電點約為4.6,GA的pKa約為2.4,這與文獻報道的一致[17-18]。

圖2 SC和GA Zeta電位隨pH的變化Fig.2 Change of Zeta potential of SC and GA under differnt pH

2.2 pH對SC和GA相互作用及納米粒形成的影響

pH對SC和GA相互作用的影響見圖3,從圖3可以看出pH大于5.6時(圖中的區(qū)間Ⅰ),濁度比較低且無顯著性變化(p>0.05),溶液基本上呈無色,說明此時體系中SC與GA均帶負電荷,兩者在溶液中呈現(xiàn)共溶狀態(tài)分散于溶液中;pH小于5.6(此pH稱為pHc,為兩者開始發(fā)生結合生成可溶性復合物的pH[19])時,隨著pH的繼續(xù)減小,濁度突然開始快速增長(p<0.01),表明SC開始與GA發(fā)生復合,此階段雖然沒有到達SC的等電點,但其帶正電的支鏈片段已經(jīng)開始與GA帶負電的片段結合[20];pH降至5.2后,繼續(xù)降低pH,濁度緩慢增大(p>0.05),當pH為3.6(此pH稱為pHφ1,為可溶性復合物生成量達到最大的pH[21])時,濁度達到第一個極值點,此階段濁度變化小;當pH小于3.6時,濁度又開始迅速增大(p<0.01),當pH達到3.3(此pH稱為pHopt,表示SC、GA兩者復合物達到靜電平衡、體系發(fā)生相變的pH[22])時,濁度達到最大值,此時有沉淀顆粒出現(xiàn),這是二者解離出的相反電荷數(shù)值相等達到靜電平衡的結果,說明此時體系發(fā)生了相變,可溶性納米復合物聚集形成不溶性沉淀[23],因此pHc-pHopt階段(圖中的區(qū)間Ⅱ)二者形成了可溶性的穩(wěn)定納米粒復合物;繼續(xù)降低pH,濁度急劇降低(p<0.01),這是沉淀沉降分層所導致,之后濁度開始增大(p<0.01),表明不溶性沉淀復合物沉淀開始部分解離,到pH2.3時(此pH稱為pHφ2,為不溶性復合物沉淀完全解離的對四個關鍵pH點進行粒徑和Zeta電位的表征,結果見表1。分析表1,可以得到濁度隨pH的減小先升后降(p<0.05),在pH3.3時達到峰值;粒徑和多分散指數(shù)(PDI)也呈先升后降的趨勢,其中pH5.6和pH3.6粒徑較小(均小于150 nm),二者之間沒有顯著性差異(p>0.05),PDI在pH5.6和pH3.6時具有顯著性差異(p<0.05),而Zeta電位的絕對值卻是先降后升,其中pH5.6和pH3.6時體系Zeta電位較大(均大于15 mV),且二者之間沒有顯著性差異(p>0.05)。pH5.6到pH3.6階段粒徑的增加是因為當pH小于4.8后,SC及GA在體系中帶有相反的電荷,隨著pH的減小,SC所解離出的正電荷電量逐漸增加,有更多的SC能與之通過靜電吸引發(fā)生自組裝而從溶液狀態(tài)向乳液轉(zhuǎn)變,即有一定尺度的粒子形成,表現(xiàn)為粒徑增加[27]。當pH降低到3.3時,粒徑達到最大,此時體系發(fā)生相變,形成不溶性沉淀物,Zeta電位的絕對值達到最小,這是體系正負電荷達到靜電平衡的結果,而此時粒徑達到最大值則主要是因為粒子表面的帶電量不足以產(chǎn)生足夠大排斥力,導致粒子之間發(fā)生聚集產(chǎn)生大顆粒沉淀。同時此時PDI值超過0.5,說明體系中有多種尺寸的聚集物,溶液中的復合物不均一。比較四個關鍵pH點,最佳制備納米粒的pH點為pHφ1。

圖3 SC和GA復合物濁度隨pH的變化Fig.3 Turbidity of SC-GA complexes under different pH

表1 體系不同pH下的SC-GA復合物的表征Table 1 Characterization of SC-GA complexes at different pH values

注：不同的字母表示不同組之間具有顯著性差異(p<0.05),表2～表5同。pH[24])濁度達到第三個極值點,說明此時沉淀完全解離消失,所以pHopt-pHφ2階段(圖中的區(qū)間Ⅲ)二者形成了不溶性沉淀;隨著pH的繼續(xù)降低(小于pHφ2,圖中的區(qū)間Ⅳ),濁度迅速減小(p<0.01),這是因為此時GA(pKa約為2.4)與SC都帶正電,二者產(chǎn)生的靜電斥力使其再次處于溶脹狀態(tài)。以上變化說明SC與GA之間的相互作用以及是否可形成納米粒極大的受到pH的影響,證明SC與GA的復合作用主要是靜電相互作用[25],這與其他蛋白和多糖通過靜電相互作用結合形成納米粒復合物的現(xiàn)象一致[16,18,23,26]。

在pHc至pHopt之間取樣對復合物進行粒徑、Zeta電位表征,結果如圖4所示。從圖4可以看出,隨著pH的減小,粒徑先增大后減小然后再增大,且pH5.2時粒徑最小,而pHφ1(3.6)復合物粒徑與最小值具有顯著性差異(p<0.05);PDI隨著pH的減小先減小后增大,在pH3.6時達到最小;復合物Zeta電位的絕對值隨pH的減小先緩慢減小,到pH小于3.6時急劇減小,表明復合物逐漸趨于不穩(wěn)定的狀態(tài),而pH3.6時復合物Zeta電位的絕對值為18.61 mV,大于15 mV,且與最大值(pH5.2)不具有顯著性差異(p>0.05);濁度隨pH的降低逐漸增大,而復合物濁度的大小可以反映體系中顆粒物的多少,在保證體系中大分子不發(fā)生聚集的前提下可以適當降低pH以提高體系濁度[27],圖4反應pH3.4時濁度達到最大,但此時粒徑達到最大且超過300 nm,PDI達到最大值0.2,Zeta電位絕對值達到最小(小于15 mV),此時體系更趨向于不穩(wěn)定的狀態(tài)。綜上,pH3.6時粒徑小于200 nm,Zeta電位絕對值大于15 mV,PDI最小,體系分布均勻,濁度接近90%,納米顆粒多,體系穩(wěn)定,因此pHφ1是比較適宜制備穩(wěn)定納米粒的pH點,這與Ye[10]等的研究結果一致。

圖4 pH對SC和GA復合物粒徑、PDI(a),濁度、Zeta電位(b)的影響Fig.4 Effects of pH on particle size,PDI,turbidity and zeta potential of SC and GA complexes

2.3 SC/GA濃度比對SC和GA相互作用及納米粒形成的影響

從圖5和圖6可知,當SC、GA兩者濃度比小于1時,隨著SC濃度的增加,pHc變化不大(p>0.05),pHφ1顯著增大(p<0.05),pHopt增大(p<0.05),pHφ2基本保持不變(p>0.05);兩者比例大于1時,隨著SC濃度的增加,pHc變化不大(p>0.05),pHφ1增大(p<0.05),pHopt增大(p<0.05),pHφ2增大(p<0.05)。但比例大于1時,每個GA多糖鏈通過靜電相互作用結合SC的能力達到飽和,剩余的SC在酸化過程中大量聚集產(chǎn)生沉淀,體系穩(wěn)定性下降,所以形成穩(wěn)定復合物的比例應小于2,林柳風[5]在研究溶菌酶與果膠相互作用的時候也得到類似的結論。

圖5 不同濃度比的復合物體系濁度隨pH的變化Fig.5 Change of turbidity with pH under different concentration ratio of SC to GA注:(a)濃度比(SC/GA)≤1(b)濃度比(SC/GA)≥1。

圖6 復合物體系關鍵pH點隨SC和GA濃度比的變化Fig.6 Change of critical pH under different concentration ratios of SC to GA

制備復合物過程中觀察體系狀態(tài)的變化結合相變圖得到各個比例下的pHφ1,在該pH下制備納米粒復合物,對復合物的粒徑、Zeta電位表征結果見表2。由表2可知,隨著SC濃度的增加,納米粒在pHφ1處的粒徑、PDI均呈先減小后增大之后又減小的趨勢,Zeta電位的絕對值先增大后減小之后又增大,濁度逐漸增大;濃度比大于2時,pHφ1超過5,高于SC的等電點,SC和GA的結合程度不高,此外體系在高pH區(qū)域即產(chǎn)生沉淀,體系趨于不穩(wěn)定的狀態(tài);比例1∶1和1∶2在pHφ1處形成的納米粒粒徑均小于150 nm,二者沒有顯著性差異(p>0.05),PDI均小于0.2,且1∶1時小于0.1,二者具有顯著性差異(p<0.05),Zeta電位的絕對值均大于15 mV且具有顯著性差異(p<0.05),濁度在1∶1時大于1∶2且具有顯著性差異(p<0.05),復合物濁度的大小可以反映體系中顆粒物的多少,在保證體系中大分子不發(fā)生聚集的前提下濁度越大說明體系中納米顆粒的數(shù)量越多。綜上,體系1∶2～1∶1范圍在pHφ1形成的粒子粒度分布均一、帶電量大,綜合考慮PDI、Zeta電位和濁度,其中1∶1時形成的粒子粒度分布更均勻,帶電量更大,更穩(wěn)定。

表2 不同濃度比的SC和GA在pHφ1形成的納米粒的的表征Table 2 Characterization of nanoparticles formed at pHφ1 with different concentration ratios of SC and GA

2.4 SC與GA總濃度對SC和GA相互作用及納米粒形成的影響

結合圖7、圖8可知,體系聚合物總濃度≤3 mg/mL時,pHc、pHφ1、pHopt和pHφ2基本不變(p>0.05),且隨著體系聚合物總濃度的增大,各拐點對應的 T增大(p<0.05);體系聚合物濃度達到4 mg/mL時,pHφ1急劇增大(p<0.01),pHc、pHopt和pHφ2基本不變(p>0.05)。過了pHc點,隨著pH的降低,濁度迅速增大(p<0.05),這是因為此時體系發(fā)生相分離,穩(wěn)定性下降。有研究表明蛋白質(zhì)和多糖混合體系中相分離的發(fā)生出現(xiàn)在二者濃度高于某一臨界濃度的情況下[28],所以SC和GA復合體系的臨界濃度為4.0 mg/mL,因此形成穩(wěn)定納米復合物的體系聚合物濃度應小于臨界濃度4.0 mg/mL。

表3 不同SC與GA總濃度體系在pHφ1下形成的納米粒的表征Table 3 Characterization of nanoparticles formed at pHφ1 with different biopolymer concentrations of SC and GA

圖7 不同SC與GA總濃度復合物體系濁度隨pH的變化Fig.7 Change of turbidity with pH under different biopolymer concentration

圖8 關鍵pH點隨SC與GA總濃度的變化 Fig.8 Change of critical pH under different biopolymer concentrations of SC and GA

制備復合物過程中觀察體系狀態(tài)的變化結合相變圖得到各個濃度下的pHφ1,在該pH下制備納米粒復合物,對復合物的粒徑、Zeta電位表征結果見表3。由表3可知,隨著SC與GA總濃度的降低,復合物在pHφ1形成的納米粒粒徑逐漸減小,在3.0 mg/mL濃度以下時粒度小于200 nm,PDI先減小后增大,且在3.0 mg/mL時達到最小,Zeta電位絕對值先增大后減小,且在2.0 mg/mL時達到最大,但3.0 mg/mL時Zeta電位的絕對值與2.0 mg/mL時均超過18 mV且二者沒有顯著性差異(p>0.05),濁度逐漸減小。綜合以上各指標,得到形成納米粒的SC與GA總濃度范圍為1.2～3.0 mg/mL,考慮到形成納米粒的數(shù)量,最佳濃度為3.0 mg/mL。

2.5 NaCl濃度對SC和GA相互作用及納米粒形成的影響

總之，在水利工程建設階段，結合施工合同的各項條款，加強對各種風險的分析，制定切實可行的控制措施，保證施工進度，才有利于確保工程建設的順利開展及社會、經(jīng)濟效益的提升。

結合圖9、圖10可知,與不加NaCl相比,低濃度的鹽(5,10 mmol/L)的加入使得未達到pHφ1之前各點的T減小(p<0.05);NaCl濃度大于10 mmol/L時,pHφ1和pHφ2對應的T增大(p<0.05);NaCl濃度達到50 mmol/L時,相變圖形狀發(fā)生改變,與單獨SC存在時的相變圖類似,這是因為高鹽產(chǎn)生靜電屏蔽作用,對大分子的自組裝聚合行為有抑制作用[29];隨著NaCl濃度的增加,pHc減小(p<0.05),體系形成可溶性復合物的起點發(fā)生左移。這是由于 NaCl 溶解后會在體系中釋放出 Na+和 Cl-離子,兩種帶電離子在電荷相互作用下結合到SC、GA分子上帶相反電荷的區(qū)域上,引起對大分子靜電作用的競爭效應,減少了蛋白質(zhì)和多糖體系中可以發(fā)生作用的電荷的數(shù)目,從而降低SC-GA復合物形成能力[30],所以表現(xiàn)為pHc向更小的pH移動。pHφ1在NaCl濃度≤10 mmol/L時緩慢增大(p>0.05),當NaCl濃度由10 mmol/L增大到20 mmol/L時,pHφ1急劇增大(p<0.01),此后又緩慢增大(p>0.05),pHopt在NaCl濃度≤20 mmol/L時緩慢增大(p>0.05),當NaCl濃度由20 mmol/L增大到30 mmol/L時,pHopt迅速增大(p<0.01),此后又緩慢增大(p>0.05);pHφ2在這個過程中略有增大(p>0.05)。以上實驗結果證實由于氯化鈉的存在,增加了體系離子強度,對復合物的形成起靜電屏蔽作用,進一步說明SC與GA復合作用主要是靜電相互作用[31]。

圖9 不同NaCl濃度的復合物體系濁度隨pH的變化Fig.9 Change of turbidity with pH under different NaCl concentration注:(a)NaCl濃度<50 mmol/L(b)NaCl濃度≥50 mmol/L。

圖10 關鍵點pH隨NaCl濃度的變化Fig.10 Change of critical pH under different NaCl concentrations

制備復合物過程中觀察體系狀態(tài)的變化結合相變圖得到不同NaCl濃度下的pHφ1,在該pH下制備納米粒復合物,對復合物的表征結果見表4。從表4可以看出,隨著NaCl濃度的增加,納米粒復合物的粒徑呈先減小、后增大的趨勢,且在NaCl濃度為10 mmol/L粒徑最小且分布最均勻,Zeta電位的絕對值先增大后減小,且在NaCl濃度為10 mmol/L時達到最大(超過15 mV),濁度逐漸增大,但在0～10 mmol/L范圍內(nèi)沒有顯著性差異(p>0.05)。說明與不加NaCl相比,低濃度的鹽(5,10 mmol/L)的加入使體系趨于更穩(wěn)定的狀態(tài)。這是因為含離子的聚合物(SC)成鹽后,離子強度增加使得復合物形成更加緊密堆積的聚集態(tài),顆粒粒徑減小,所以此時粒徑下降[32],而高濃度的鹽(大于40 mmol/L)的加入使體系使兩者的靜電相互作用逐漸被抑制,體系粒徑逐漸增大,Zeta絕對值減小,體系穩(wěn)定性下降。此外體系NaCl濃度在大于20 mmol/L時Zeta電位絕對值小于15 mV,所以形成穩(wěn)定納米粒的鹽濃度不宜太高(小于20 mmol/L)。綜合比較各個指標,體系在NaCl濃度為10 mmol/L時,粒徑與PDI達到最小,Zeta電位絕對值達到最大,且與其他組具有顯著性差異,同時濁度較大,生成的納米粒數(shù)量多,所以確定的最佳鹽濃度為10 mmol/L。

表4 不同NaCl濃度體系在pHφ1下形成的納米粒的表征Table 4 Characterization of nanoparticles formed at pHφ1 with different NaCl concentrations

2.6 微觀形貌分析

在SC∶GA=1∶1(濃度比),總濃度3 mg/mL,10 mmol/L NaCl,pH4.2條件下制備SC-GA納米粒,并通過透射電鏡觀測SC-GA納米粒在干態(tài)的形貌,如圖11所示。由圖11可以看出,干態(tài)納米粒子呈球形,分散均勻,透射電鏡表征得到的納米粒粒徑分布在150 nm左右,與用激光粒度儀測得平均粒徑(約142 nm)接近。

圖11 SC-GA納米粒的透射電鏡圖Fig.11 Transmission electron micrographs of SC-GA nanoparticles

2.7 納米粒貯藏穩(wěn)定性

納米粒貯藏穩(wěn)定性結果如表5所示,在貯藏7 d時粒徑和Zeta電位與原樣相比無顯著性差異(p>0.05),貯藏30 d時粒徑增大(p<0.05),Zeta電位絕對值降低(p<0.05),但在為期7、15、30 d的貯藏時間內(nèi)納米粒粒徑皆小于200 nm,粒度分散指數(shù)小于0.2,Zeta電位絕對值大于15 mV,處于穩(wěn)定的范圍,說明制備的SC-GA納米顆粒在溶液中可以保持良好的穩(wěn)定性,不易解離與聚集。

表5 納米粒粒徑、Zeta電位隨貯藏時間變化Table 5 Changes of particle size and zeta potential with storage time

圖12 不同樣品的紅外光譜圖Fig.12 FTIR spectra of different samples注:(a)SC,(b)GA,(c)SC與GA混合物,(d)SC-GA納米粒。

2.8.2 熒光光譜分析 蛋白質(zhì)是熒光體,其內(nèi)源性熒光主要來自于色氨酸(Trp)、酪氨酸(Tyr)和苯丙氨酸(Phe)等氨基酸殘基[34]。SC的熒光主要來自于Trp,且在 280 nm波長附近激發(fā)[35]。因此應用主要來源于色氨酸的SC自身熒光的猝滅可以研究水溶液中GA與SC分子間的相互作用的過程。圖13顯示了激發(fā)波長280 nm時,不同溫度、不同濃度GA對SC溶液的熒光發(fā)射光譜的影響。從中可以看出SC中的色氨酸在發(fā)射波長364 nm左右出現(xiàn)峰值且SC與GA的相互作用并沒有使色氨酸的熒光發(fā)射光譜發(fā)生位移,表明SC與GA之間的相互作用并沒有改變色氨酸周圍環(huán)境的極性,所以GA與SC之間的相互作用并沒有使SC的構象發(fā)生改變[36]。相同溫度,隨著GA濃度的增加,色氨酸殘基的熒光強度降低;相同GA濃度,隨著溫度的升高,色氨酸殘基的內(nèi)源熒光強度降低,表明GA與SC的相互作用使SC內(nèi)源熒光規(guī)律性猝滅。

圖13 GA濃度對SC熒光光譜的影響 Fig.13 Fluorescence quenching of SC affected by the concentration of GA注:a:25 ℃,b:35 ℃;SC濃度為0.5 mg/mL,1～10:GA濃度分別為0,0.5,1,2,3,4,5,6,8,10 mg/mL。

熒光猝滅類型有動態(tài)猝滅和靜態(tài)猝滅,猝滅類型可根據(jù) Stern-Volmer 方程進行判斷[37]。

F0/F=Ksv[Q]+1=Kqτ0[Q]+1

式(1)

其中,F0和F分別表示加入和不加入猝滅劑時體系的熒光強度;[Q]為猝滅劑濃度(mol/L),Ksv為 Stern-Volmer 猝滅常數(shù)(L/mol),Kq為雙分子猝滅速率常數(shù)(L·mol-1·s-1),各類熒光猝滅劑對生物大分子的最大猝滅常數(shù)約為2.0×1010L·mol-1·s-1,τ0為不存在猝滅劑時熒光大分子的平均壽命,一般約為10-8s[38]。

根據(jù)Stern-Volmer方程,以[Q]為自變量,F0/F為因變量,通過線性擬合得圖14,由圖中直線的斜率和τ0可得到不同溫度條件下GA與SC相互作用的Ksv和Kq,結果見表6。由圖14和表6可知,不同溫度下,GA對SC熒光發(fā)射光譜的Stern-Volmer曲線都呈現(xiàn)一定的線性關系,且隨著溫度的升高,曲線斜率即Ksv減小,表明GA對SC的熒光猝滅為靜態(tài)猝滅[39]。同時,猝滅劑對生物大分子的最大猝滅速率常數(shù)為2×1010L·mol-1·s-1[40],而不同溫度下GA對SC的熒光猝滅速率常數(shù)Kq均大于此值,進一步說明GA對SC的熒光猝滅為靜態(tài)猝滅。Wang等[41]研究毛木耳多糖和人血清白蛋白(HSA)相互作用時發(fā)現(xiàn)多糖對HAS的的熒光猝滅也為靜態(tài)猝滅。

表6 不同溫度下GA與SC相互作用的Stern-Volmer方程常數(shù)和曲線擬合方程Table 6 Stern-Volmer quenching constants and curves fitted equation of interaction between GA and SC at different temperature

表7 不同溫度下GA與SC相互作用的結合常數(shù)和曲線擬合方程Table 7 Binding constants and curves fitted equation of interaction between GA and SC at different temperature

圖14 不同溫度條件下GA對SC熒光猝滅的Stern-Volmer曲線Fig.14 Stern-Volmer plots of SC quenched by GA at different temperatures

靜態(tài)猝滅過程中,分子之間的結合常數(shù)和結合位點數(shù)可根據(jù)以下雙對數(shù)方程[42]得到:

lg [(F0-F)/F]=lgKa+nlg[Q]

式(2)

其中,F0和F分別表示加入和不加入GA時體系的熒光強度;[Q]為GA濃度(mol/L);Ka為表觀結合常數(shù);n為結合位點數(shù);[Q]為猝滅劑的濃度(mol/L)。

根據(jù)方程式(2),以lg[(F0-F)/F]對lg[Q]作線性擬合得圖15,計算得到不同溫度條件下GA與SC相互作用的表觀結合常數(shù)Ka和結合位點數(shù)n如表7所示。圖15結合表7可知,GA與SC在25 ℃和35 ℃時均形成了結合位點數(shù)接近于1的復合物,且結合位點數(shù)和結合常數(shù)接近,均無顯著差異(p>0.05),說明在常溫下的水相體系中,適當升高溫度對SC和GA相互作用的影響較小,而濁度-pH相圖表明體系pH和離子強度極大地影響了復合物的形成,因此進一步印證了SC與GA之間形成納米粒復合物的主要作用力為靜電相互作用[5]。與此同時,兩個溫度下的水相體系中,二者的結合常數(shù)均在104～105L·mol-1之間,說明與配體-蛋白質(zhì)特異性比較,SC與GA之間的靜電相互作用屬于親和性比較低的[43]。Hu等[44]研究酪蛋白磷酸肽(CPP)和殼聚糖(CS)靜電相互作用形成納米粒時發(fā)現(xiàn)CS和CPP之間的結合也屬于低親和性的。

圖15 不同溫度條件下GA對SC熒光猝滅的雙對數(shù)曲線Fig.15 Double logarithmic curves of SC quenched by GA at different temperature

3 結論

[1]Zimet P,Rosenberg D,Livney Y D. Re-assembled casein micelles and casein nanoparticles as nano-vehicles for omega-3 polyunsaturated fatty acids [J]. Food Hydrocolloids,2011,25(5):1270-1276.

[2]Rodriguez Patino J M,Pilosof A M R. Protein-polysaccharide interactions at fluid interfaces [J]. Food Hydrocolloids,2011,25(8):1925-1937.

[3]Siddiqui I A,Adhami V M,Ahmad N,et al. Nanochemoprevention:Sustained Release of Bioactive Food Components for Cancer Prevention [J]. Nutrition and Cancer-an International Journal,2010,62(7):883-890.

[4]Abalovich A,Jatimliansky C,Diegex E,et al. Pancreatic islets microencapsulation with polylactide-co-glycolide[J]. Transplantation Proceedings,2001,33(1-2):1977-1979.

[5]林柳風. 溶菌酶/果膠復合體系的構建及其在營養(yǎng)與藥物遞送體系中的應用研究[D]. 武漢:華中農(nóng)業(yè)大學,2015.

[6]Narayanan D,Gopikrishna J,Nair S V. Proteins and Carbohydrates as polymeric nanodrug delivery systems:Formulation,properties,and toxicological evaluation [M]. Advances in Polymer Science,Dutta P K,Dutta J,2013:254,241-267.

[7]Elzoghby A O,El-Fotoh W S A,Elgindy N A. Casein-based formulations as promising controlled release drug delivery systems [J]. Journal of Controlled Release,2011,153(3):206-216.

[8]Livney Y D. Milk proteins as vehicles for bioactives [J]. Current Opinion in Colloid & Interface Science,2010,15(1-2):73-83.

[9]Jurasek P,Kosik M,O P G. A chemometric study of the Acacia(gum arabic)and related natural gums[J]. Food Hydrocolloids,1993,7(1):73-85.

[10]Ye A,Flanagan J,Singh H. Formation of stable nanoparticles via electrostatic complexation between sodium caseinate and gum arabic [J]. Biopolymers,2006,82(2):121-133.

[11]Ilyasoglu H,El S N. Nanoencapsulation of EPA/DHA with sodium caseinate-gum arabic complex and its usage in the enrichment of fruit juice [J]. LWT-Food Science and Technology,2014,56(2):461-468.

[12]Avadi M R,Sadeghi A M M,Mohammadpour N,et al. Preparation and characterization of insulin nanoparticles using chitosan and Arabic gum with ionic gelation method[J]. Nanomedicine-Nanotechnology Biology and Medicine,2010,6(1):58-63.

[13]Ould Eleya M M,Desobry Banon S,Hardy J. A comparative study of pH and temperature effects on the acidic coagulation of milks from cows,goats,and sheep[J]. Journal of Dairy Science,1995,78(12):2675-2682.

[14]van Vliet T,Lakemond C,Visschers R W. Rheology and structure of milk protein gels [J]. Current Opinion in Colloid & Interface Science,2004,9(5):298-304.

[15]Mohammadifar M A,Musavi S M,Kiumarsi A,et al. Solution properties of targacanthin(water-soluble part of gum tragacanth exudate from Astragalus gossypinus)[J]. International Journal of Biological Macromolecules,2006,38(1):31-39.

[16]Gorji S G,Gorji E G,Mohammadifar M A. Characterisation of gum tragacanth(Astragalus gossypinus)/sodium caseinate complex coacervation as a function of pH in an aqueous medium[J]. Food Hydrocolloids,2014,34(1):161-168.

[17]Murray B S. Interfacial rheology of food emulsifiers and proteins [J]. Current Opinion in Colloid & Interface Science,2002,7(5):426-431.

[18]Stone A K,Teymurova A,Nickerson M T. Formation and functional attributes of Canola protein isolate-gum arabic electrostatic complexes [J]. Food Biophysics,2014,9(3):203-212.

[19]Ghorbani Gorji S,Ghorbani Gorji E,Mohammadifar M A,et al. Complexation of sodium caseinate with gum tragacanth:Effect of various species and rheology of coacervates[J]. International Journal of Biological Macromolecules,2014,67:503-511.

[20]Girard M,Sanchez C,Laneuville S I,et al. Associative phase separation of beta-lactoglobulin/pectin solutions:a kinetic study by small angle static light scattering [J]. Colloids and Surfaces B:Biointerfaces,2004,35(1):15-22.

[21]Jones O G,McClements D J. Functional biopolymer particles:design,fabrication,and applications [J]. Comprehensive Reviews in Food Science and Food Safety,2010,9(4):374-397.

[22]de Kruif C G,Weinbreck F,de Vries R. Complex coacervation of proteins and anionic polysaccharides[J]. Current Opinion in Colloid & Interface Science,2004,9(5):340-349.

[23]Liu S,Elmer C,Low N H,et al. Effect of pH on the functional behaviour of pea protein isolate-gum Arabic complexes[J]. Food Research International,2010,43(2):489-495.

[24]Dickinson E. Interfacial structure and stability of food emulsions as affected by protein-polysaccharide interactions [J]. Soft Matter,2008,4(5):932-942.

[25]Sarika P R,Pavithran A,James N R. Cationized gelatin/gum arabic polyelectrolyte complex:Study of electrostatic interactions [J]. Food Hydrocolloids,2015,49:176-182.

[26]Coskun A E I,Saglam D,Venema P,et al. Preparation,structure and stability of sodium caseinate and gelatin micro-particles[J]. Food Hydrocolloids,2015,45:291-300.

[27]Schmitt C,Sanchez C,Thomas F,et al. Complex coacervation between beta-lactoglobulin and acacia gum in aqueous medium[J]. Food Hydrocolloids,1999,13(6):483-496.

[28]Bouyer E,Mekhloufi G,Rosilio V,et al. Proteins,polysaccharides,and their complexes used as stabilizers for emulsions:Alternatives to synthetic surfactants in the pharmaceutical field [J]. International Journal of Pharmaceutics,2012,436(1-2):359-378.

[29]Tran T,Rousseau D. Stabilization of acidic soy protein-based dispersions and emulsions by soy soluble polysaccharides [J]. Food Hydrocolloids,2013,30(1):382-392.

[30]Niu F,Su Y,Liu Y,et al. Ovalbumin-gum arabic interactions:Effect of pH,temperature,salt,biopolymers ratio and total concentration [J]. Colloids and Surfaces B:Biointerfaces,2014,113:477-482.

[31]Berger J,Reist M,Mayer J M,et al. Structure and interactions in chitosan hydrogels formed by complexation or aggregation for biomedical applications[J]. European journal of pharmaceutics and biopharmaceutics,2004,57(1):35-52.

[32]孟欣. 殼聚糖-海藻酸鈉聚電解質(zhì)膜的制備及性能調(diào)控研究[D]. 北京:中國人民解放軍軍事醫(yī)學科學院,2010.

[33]牛付閣. 卵白蛋白-阿拉伯膠相互作用及其在油水界面的吸附特性[D]. 無錫:江南大學,2015.

[34]薛瑾. 茶多酚-蛋白納米復合物的研究[D]. 無錫:江南大學,2014.

[35]李艷,鞏世磊,高煥園,等. 單寧酸對酪蛋白酸鈉的作用方式分析[J]. 現(xiàn)代食品科技,2015,31(6):111-115.

[36]Hosseini S M H,Emam-Djomeh Z,Sabatino P,et al. Nanocomplexes arising from protein-polysaccharide electrostatic interaction as a promising carrier for nutraceutical compounds[J]. Food Hydrocolloids,2015,50:16-26.

[37]Bandyopadhyay P,Ghosh A K,Ghosh C. Recent developments on polyphenol-protein interactions:effects on tea and coffee taste,antioxidant properties and the digestive system [J]. Food & function,2012,3(6):592-605.

[38]Wang Q,Zhang X,Zhou X,et al. Interaction of different thiol-capped CdTe quantum dots with bovine serum albumin [J]. Journal of Luminescence,2012,132(7):1695-1700.

[39]Ben Messaoud G,Sanchez-Gonzalez L,Jacquot A,et al. Alginate/sodium caseinate aqueous-core capsules:A pH-responsive matrix[J]. Journal of colloid and interface science,2015,440:1-8.

[40]Tian F,Jiang F,Han X,et al. Synthesis of a novel hydrazone derivative and biophysical studies of its interactions with bovine serum albumin by spectroscopic,electrochemical,and molecular docking methods[J]. Journal of physical chemistry B,2010,114(46):14842-14853.

[41]Wang W,Zhang G,Zou J. The Interaction of polysaccharides isolated from Auricularia polytricha with juman serum albumin [J]. Journal of Applied Biological Chemistry,2014,57(1):33-40.

[42]Gong A,Zhu X,Hu Y,et al. A fluorescence spectroscopic study of the interaction between epristeride and bovin serum albumine and its analytical application[J]. Talanta,2007,73(4):668-673.

[43]Kratochwil N A,Huber W,Müller F,et al. Predicting plasma protein binding of drugs:a new approach [J]. Biochemical Pharmacology,2002,64(9):1355-1374.

[44]Hu B,Wang S S,Li J,et al. Assembly of bioactive peptide-chitosan nanocomplexes [J]. Journal of physical chemistry B,2011,115(23):7515-7523.

Studies on the interaction of sodium caseinate and gum arabic and preparation of nanoparticles

LIU Chun-hua1,2,ZHOU Ai-mei1,2,*,YANG Ran1,PENG Dan-ying1,LIU Xin1,2,CAO Yong1,2

(1.College of Food Science of South China Agricultural University,Guangzhou 510642,China; 2.Guangdong Province Engineering Research Center for Bioactive Natural Products,Guangzhou 510642,China)

In this paper,the effects of pH,the concentration ratio of sodium caseinate(SC)to gum arabic(GA),the total concentration of SC and GA and the ionic strength(the concentration of NaCl)on the interaction between SC and GA and the formation of nanoparticles were investigated by the characterization of turbidity,particle size and zeta potential. The morphological attributes of the nanoparticles were characterized by transmission electron microscopy(TEM)and the storage stability of nanoparticles was studied. Furthermore,the mechanism of the formation of nanoparticles formed by interaction between SC and GA was researched by infrared spectroscopy(FTIR)and fluorescence spectroscopy. The results revealed that pH and ionic strength greatly influenced the interaction between SC and GA and the formation of nanoparticles,indicating that the main force to form nanoparticles between SC and GA was electrostatic interaction. Meanwhile,the formation of stable nanoparticles was achieved under the following conditions:the concentration ratio of SC to GA was 1∶1,pH was 4.2,the total concentration of SC and GA was 3.0 mg/mL and the concentration of NaCl was 10 mmol/L. The particle size of resulted nanoparticles was about 142 nm and zeta potential was about-21.43 mV. Moreover,the nanoparticles remained stable after storage of one month at 4 ℃. TEM results showed that the nanoparticles were spherical in shape. FTIR results confirmed that electrostatic interaction occured in positively charged amino of SC and negatively charged carboxyl of GA. The fluorescence spectra results demonstrated that the combination between SC and GA to form nanoparticles by electrostatic interaction was low affinity.

sodium caseinate;gum arabic;interaction;nanoparticle;stability;mechanism

2017-03-06

劉春花(1992-)，女，碩士研究生，研究方向：食品化學與營養(yǎng)，E-mail：liuch0805@126.com。

*通訊作者:周愛梅(1971-)，女，博士，教授，研究方向：水產(chǎn)品及農(nóng)產(chǎn)品深加工研究，E-mail:zhouam@scau.edu.cn。

TS201.2

A

1002-0306(2017)15-0068-011

10.13386/j.issn1002-0306.2017.15.015