細(xì)胞因子LIF和IL-10在體外卵巢癌微環(huán)境影響樹(shù)突狀細(xì)胞前體細(xì)胞分化和功能中的作用研究

陳麗莉，潘子旻，盧曉男，俞 穎，胡東曉

（浙江大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬婦產(chǎn)科醫(yī)院婦科，浙江 杭州 310000）

?實(shí)驗(yàn)研究?

細(xì)胞因子LIF和IL-10在體外卵巢癌微環(huán)境影響樹(shù)突狀細(xì)胞前體細(xì)胞分化和功能中的作用研究

陳麗莉，潘子旻，盧曉男，俞 穎，胡東曉

（浙江大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬婦產(chǎn)科醫(yī)院婦科，浙江 杭州 310000）

目的 探討白血病抑制因子（LIF，leukemia inhibitory factor）和白介素-10（Interleukin-10）在卵巢癌細(xì)胞微環(huán)境中對(duì)樹(shù)突狀細(xì)胞（Dendritic cell，DC）前體細(xì)胞分化及其功能的影響。方法 分離健康捐贈(zèng)者外周血白細(xì)胞中的單個(gè)核細(xì)胞，采用全自動(dòng)磁選儀分選Lin-CD45RA- DC前體細(xì)胞，用GM-CSF和TNF-α聯(lián)合誘導(dǎo)成熟DC生成。在培養(yǎng)過(guò)程中加入細(xì)胞因子LIF及IL-10及其抗體組合，研究LIF和IL-10在卵巢癌細(xì)胞SKOV3培養(yǎng)上清中對(duì)Lin-CD45RA-DC前體細(xì)胞分化和成熟的影響。結(jié)果 在空白組中，IL-10聯(lián)合LIF能降低培養(yǎng)系統(tǒng)中mDC的比例，增高pDC的比例，同時(shí)成熟DC 表達(dá)的表面分子HLA-DR和CD80明顯降低，刺激CD3+T細(xì)胞增殖的能力同時(shí)降低，培養(yǎng)上清中免疫活性分子IL-12的分泌水平也下降。結(jié)論 卵巢癌SKOV3培養(yǎng)上清也下調(diào)mDC比例并上調(diào)pDC比例。但在卵巢癌SKOV3 細(xì)胞培養(yǎng)上清中加入抗IL-10及LIF細(xì)胞因子抗體，培養(yǎng)體系中mDC的下調(diào)和pDC的上調(diào)沒(méi)有變化，IL-12的水平仍然是下降的。

細(xì)胞因子；IL-10；LIF；上皮性卵巢癌；樹(shù)突狀細(xì)胞

上皮性卵巢癌（epithelium ovarian carcinoma，EOC）是婦科惡性腫瘤中惡性程度最高的一類(lèi)，五年生存率僅為30%左右。目前認(rèn)為EOC的臨床特點(diǎn)，極易發(fā)生局部擴(kuò)散和盆腹腔內(nèi)播散性轉(zhuǎn)移，且70%的患者在發(fā)現(xiàn)時(shí)已經(jīng)為晚期，這與腫瘤局部微環(huán)境免疫缺陷具有密切的相關(guān)性，并認(rèn)為是治療的重要環(huán)節(jié)。構(gòu)成腫瘤的免疫微環(huán)境包括了癌細(xì)胞，基質(zhì)細(xì)胞，浸潤(rùn)的炎癥細(xì)胞，如樹(shù)突狀細(xì)胞（dendritic cell，DC）、T細(xì)胞，組織液，微血管以及細(xì)胞因子等，并認(rèn)為這些因素在腫瘤免疫及免疫耐受中起重要作用[1]。

樹(shù)突狀細(xì)胞是DC是生物體內(nèi)功能最強(qiáng)大的專(zhuān)職抗原提呈細(xì)胞，而抗原提呈是機(jī)體特異性免疫應(yīng)答過(guò)程中的必要步驟，因此DC在機(jī)體抗腫瘤免疫中起到至關(guān)重要的作用。在人類(lèi)外周血中，DC通常分為兩種亞群，CD11c+CD123-DC，具有單個(gè)核細(xì)胞的特性，稱(chēng)為“髓樣DC”（MDC）；CD11c-CD123+DC，具有漿細(xì)胞的特性，稱(chēng)為“漿細(xì)胞樣DC”（PDC）。前者誘導(dǎo)Th1免疫反應(yīng)，刺激CTL細(xì)胞的增殖和免疫效應(yīng)；后者對(duì)于免疫反應(yīng)具有雙向調(diào)節(jié)作用，特別是在腫瘤微環(huán)境中，認(rèn)為其能誘導(dǎo)CD8+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞的產(chǎn)生，該類(lèi)T細(xì)胞趨化至腫瘤區(qū)域淋巴結(jié)，分泌IL-10，抑制抗腫瘤特異性反應(yīng)[2]。目前眾多的研究發(fā)現(xiàn)，卵巢癌的免疫微環(huán)境中存在著樹(shù)突狀細(xì)胞的分化和功能缺陷：如在上皮性卵巢癌患者中，在腫瘤部位浸潤(rùn)功能成熟的mDC缺乏，在患者腹水中，mDC/pDC的比例下降，有利于免疫耐受[2-4]，但是相關(guān)機(jī)制并不明確。

我們既往的研究發(fā)現(xiàn)，和正常卵巢上皮細(xì)胞培養(yǎng)上清相比較，EOC細(xì)胞培養(yǎng)上清中的白血病抑制因子（LIF， leukemia inhibitory factor）顯著升高[5-6]。

LIF是IL-6家族中的一員，廣泛參與細(xì)胞的增生、分化等各個(gè)環(huán)節(jié)，在很多的實(shí)體瘤中都有高水平表達(dá)，在體外調(diào)節(jié)性T細(xì)胞的培養(yǎng)中也發(fā)現(xiàn)LIF和免疫抑制性的FoxP3蛋白同步升高，因此認(rèn)為L(zhǎng)IF在腫瘤微環(huán)境的局部免疫抑制反應(yīng)中可能起到重要作用[7]。而LIF在上皮性卵巢癌中的表達(dá)和臨床特征具有密切的相關(guān)性[8]?；谏鲜龅难芯?，我們有理由認(rèn)為L(zhǎng)IF是EOC局部微環(huán)境缺陷的一個(gè)重要組成部分，同時(shí)也可能是EOC局部微環(huán)境中，抑制mDC分化，促進(jìn)pDC分化，并抑制DC成熟和功能的重要因子。本研究進(jìn)一步探討LIF和IL-10在卵巢癌微環(huán)境中對(duì)DC前體分化的影響。

1 材料與方法

1.1 研究對(duì)象

①健康捐贈(zèng)者外周血白細(xì)胞。②上皮性卵巢癌SKOV3細(xì)胞株購(gòu)自于美國(guó)模式培養(yǎng)物研究所，由浙江大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬婦產(chǎn)科醫(yī)院中心實(shí)驗(yàn)室提供。

1.2 研究方法

1.2.1 收集健康捐贈(zèng)者外周血白細(xì)胞，采用密度梯度離心法收獲單個(gè)核細(xì)胞。

1.2.2 采用全自動(dòng)磁性細(xì)胞分選儀分選Lin-CD45RADC為前體細(xì)胞，采用GM-CSF+TNF-α聯(lián)合誘導(dǎo)成熟DC的產(chǎn)生。

1.2.3 進(jìn)行上皮性卵巢癌細(xì)胞株SKOV3的傳代培養(yǎng)，在細(xì)胞培養(yǎng)至鋪滿(mǎn)培養(yǎng)瓶80%左右，更換為無(wú)血清培養(yǎng)基，36 h后收獲培養(yǎng)上清，離心去除沉淀，置于-70度保存待用。

1.2.4 實(shí)驗(yàn)分組：①空白組：RPMI 1640+GM-CSF（50 ng/mL）和TNF-a（20 ng/mL）。②SKOV3培養(yǎng)上清組：RPMI 1640+GM-CSF（50 ng/mL）和TNF-a（20 ng/mL）+SKOV3培養(yǎng)上清（30%v/v）。③SKOV3培養(yǎng)上清+抗體組：RPMI 1640+GM-CSF（50 ng/mL）和TNF-a（20 ng/mL）+SKOV3培養(yǎng)上清（30%v/v）+IL-10抗體（20 ng/mL）+LIF抗體（20 ng/mL）。④細(xì)胞因子聯(lián)合組：RPMI 1640+GMCSF（50 ng/mL）和TNF-a（20 ng/mL）+IL-10（20 ng/mL）+LIF（20 ng/mL）。

1.2.5 流式細(xì)胞分析測(cè)定細(xì)胞成熟的表面分子HLA-DR及CD80的表達(dá)，mDC（HLA-DR+CD11c+CD123-）以及pDC（HLA-DR+CD11c-CD123+）的比例，同種異體T細(xì)胞增殖反應(yīng)檢測(cè)培養(yǎng)系統(tǒng)中的DC對(duì)于T細(xì)胞的增殖刺激活性，培養(yǎng)上清中IL-12的測(cè)定采用ELISA的方法，檢測(cè)細(xì)胞分泌活性物質(zhì)的能力。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

用“均數(shù)±SD”表示三次實(shí)驗(yàn)的結(jié)果。采用SPSS 11.0統(tǒng)計(jì)軟件中的獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)。P＜0.05被認(rèn)為差異有顯著意義。

2 結(jié) 果

四組培養(yǎng)系統(tǒng)中均有成熟DC的擴(kuò)增，鏡下觀(guān)察細(xì)胞為圓形，表面樹(shù)突狀多個(gè)突起及毛刺狀，大部分呈集簇狀生長(zhǎng)，各組之間細(xì)胞生長(zhǎng)趨勢(shì)及形態(tài)均無(wú)明顯差異。

DC前體細(xì)胞經(jīng)過(guò)不同的條件培養(yǎng)后，代表細(xì)胞成熟度的表面分子HLA-DR和CD80的表達(dá)均有不同程度的升高。在空白組和SKOV3培養(yǎng)上清組中，兩類(lèi)表面分子的表達(dá)均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。而在空白組中加入IL-10和LIF因子組合后，HLA-DR及CD80的表達(dá)均下降，和其余組別相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。在SKOV3組中加入抗IL-10和抗LIF抗體后，HLA-DR和CD80無(wú)明顯改變（表1）。

與空白組相比較，SKOV3培養(yǎng)上清能改變mDC和pDC的比例，mDC組成下降，pDC比例上調(diào)。而與空白組相比，細(xì)胞因子IL-10+LIF聯(lián)合也使培養(yǎng)系統(tǒng)中mDC比例下降并上調(diào)pDC比例，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；這一效應(yīng)與SKOV3上清相比，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。在SKOV3中加入抗IL-10及LIF抗體，所生成的mDC/pDC比例與不加抗體組相比較并無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，與細(xì)胞因子組相比較也明顯改變，但與對(duì)照空白組相比較mDC仍然下調(diào)，pDC組成上升，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見(jiàn)表1、圖1所示。

表1 不同培養(yǎng)系統(tǒng)中的細(xì)胞分群及細(xì)胞表面標(biāo)記

圖1 不同組別mDC及pDC細(xì)胞分群的柱狀圖

觀(guān)察不同培養(yǎng)系統(tǒng)處理后的DC產(chǎn)生具有生物活性的IL-12的能力的變化。SKOV3培養(yǎng)上清處理后的DC分泌的IL-12（1.4±0.4）pg/mL，較空白組的成熟DC（2.7±0.9）pg/mL明顯下降。加入IL-10+LIF聯(lián)合培養(yǎng)處理后DC產(chǎn)生的IL-12（1.3±0.1）pg/mL也有下降，差異有顯著性意義，P=0.023。在SKOV3中加入細(xì)胞因子抗體后，IL-12（1.6±0.4）pg/mL的濃度仍低于空白組，有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，P=0.005。其余各組之間IL-12的濃度均無(wú)明顯差異。見(jiàn)圖2。

圖2 IL-12(P70)的濃度

3 討 論

IL-10是一類(lèi)免疫抑制因子，研究表明，IL-10對(duì)于DC功能的影響表現(xiàn)在多個(gè)方面，比如，與IL-10共培養(yǎng)后，DC對(duì)于脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）的刺激存在很多缺陷，不能分泌具有免疫刺激效應(yīng)等炎癥性因子；不能上調(diào)共刺激分子的表達(dá)。在IL-10的作用下，DC會(huì)保持在未成熟狀態(tài)，并誘導(dǎo)調(diào)節(jié)性T細(xì)胞的產(chǎn)生[9-10]。而目前對(duì)于LIF的研究較少。雖然文獻(xiàn)報(bào)道LIF在某些方面影響到DC的分化，但是LIF基因敲除后裸鼠中抗原提呈細(xì)胞細(xì)胞的抗原處理、提呈和共刺激能力均沒(méi)有受到影響[11]。因此LIF的具體效應(yīng)仍需要進(jìn)一步研究明確。

我們研究發(fā)現(xiàn)，該兩種細(xì)胞因子聯(lián)合應(yīng)用能夠明顯抑制DC前體細(xì)胞的成熟，提示IL-10和LIF對(duì)DC前體的成熟具有相同或協(xié)同的抑制作用，但不是拮抗作用，從而確定了IL-10和LIF在DC前體成熟水平具有免疫抑制效應(yīng)。本研究同時(shí)發(fā)現(xiàn)，IL-10和LIF共同作用明顯影響了DC前體細(xì)胞的分化，使mDC比例下降，而pDC比例增加，并且明顯降低了DC的免疫刺激功能。這種作用與卵巢癌細(xì)胞培養(yǎng)上清的作用十分相似，提示卵巢癌細(xì)胞對(duì)DC前體細(xì)胞分化的影響極可能通過(guò)IL-10和LIF而實(shí)現(xiàn)。但是，當(dāng)用特異性抗體同時(shí)阻斷這兩種細(xì)胞因子時(shí)，并未發(fā)現(xiàn)能逆轉(zhuǎn)SKOV3培養(yǎng)上清對(duì)于DC的抑制作用，提示除IL-10和LIF外，卵巢癌細(xì)胞還通過(guò)其他途徑影響DC的分化。我們的結(jié)果還表明，在卵巢癌微環(huán)境中存在一個(gè)復(fù)雜的細(xì)胞因子網(wǎng)絡(luò)，多種細(xì)胞因子和多條調(diào)控途徑同時(shí)影響DC的分化，單一的細(xì)胞因子阻斷可能無(wú)法有效地逆轉(zhuǎn)腫瘤細(xì)胞誘導(dǎo)的免疫抑制。

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本文編輯：趙小龍

R737.31

A

ISSN.2095-8242.2017.034.6557.03

浙江省自然基金項(xiàng)目（LY12H16009）；浙江省教育廳科技項(xiàng)目（Y200909448）；浙江省自然基金項(xiàng)目資助項(xiàng)目（編號(hào)：LY12H16024）

陳麗莉（1974-），女，漢族，浙江省杭州市，博士，副主任醫(yī)師，婦科腫瘤婦科腫瘤臨床