不同蜜炙方法對紅芪中毛蕊異黃酮和芒柄花素含量的影響

牛江濤，曹瑞，司昕蕾，邊甜甜，李越峰

甘肅中醫(yī)藥大學，甘肅省中藥質(zhì)量與標準研究重點實驗室，甘肅 蘭州 730000

不同蜜炙方法對紅芪中毛蕊異黃酮和芒柄花素含量的影響

牛江濤，曹瑞，司昕蕾，邊甜甜，李越峰

甘肅中醫(yī)藥大學，甘肅省中藥質(zhì)量與標準研究重點實驗室，甘肅 蘭州 730000

目的比較不同蜜炙方法對紅芪中毛蕊異黃酮和芒柄花素含量的影響，為其蜜炙最佳工藝的建立提供依據(jù)。方法 采用傳統(tǒng)炒制、烘制、微波制的方法蜜炙紅芪；采用Agilent HC-C18色譜柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流動相為乙腈-0.01%磷酸水溶液，梯度洗脫（0～12 min，30%～33%乙腈；12～13 min，31%～40%乙腈，13～25 min，40%乙腈），流速1.0 mL/min，檢測波長248 nm，柱溫30 ℃，進樣量10 μL。結(jié)果 紅芪不同蜜炙品中毛蕊異黃酮和芒柄花素含量存在差異。紅芪烘制炙品中毛蕊異黃酮和芒柄花素含量最高，分別為7.911 6、49.699 6 μg/g；紅芪傳統(tǒng)炙品中二者含量最低，分別為4.776 7、37.291 0 μg/g；紅芪生品和紅芪微波炙品中二者含量相當，分別為5.080 2、42.798 9 μg/g和3.983 9、42.314 5 μg/g。結(jié)論 不同蜜炙方法對紅芪中毛蕊異黃酮和芒柄花素含量有一定影響，烘制炙法是紅芪蜜炙的最優(yōu)方法。

紅芪；蜜炙；毛蕊異黃酮；芒柄花素

紅芪為豆科植物多序巖黃芪 Hedysarum polybotrys Hand.-Mazz.的干燥根，具有補氣升陽、固表止汗、利水消腫、生津養(yǎng)血、行滯通痹、托毒排膿、斂瘡生肌功效。炙紅芪為紅芪的蜜炙炮制加工品，具有補中益氣功效，用于氣虛乏力、食少便溏[1]。毛蕊異黃酮和芒柄花素具有抗氧化、抗病毒、抗缺血、抗菌、降血脂和改善血象等作用[2-4]，是紅芪的主要活性成分。傳統(tǒng)炙紅芪炮制時火候不易控制，且翻炒不及時或不均勻都會導致受熱不均勻，容易炒焦或炒炙不夠，造成蜜炙紅芪品相不好，某些成分因溫度過高而分解，不利于蜜炙紅芪的質(zhì)量控制和標準化生產(chǎn)。而采用烘制和微波蜜炙紅芪，具有控溫容易、受熱均勻、操作簡便等優(yōu)點，有利于提高炙紅芪質(zhì)量，促進其標準化生產(chǎn)。本研究比較不同蜜炙工藝對紅芪中毛蕊異黃酮和芒柄花素2種異黃酮類含量的影響，為建立最優(yōu)蜜炙炮制工藝提供依據(jù)。

1 儀器與試藥

Agilent 1260高效液相色譜儀（美國 Agilent公司），美的MM721AC8-PW微波爐（佛山市順德區(qū)美的微波爐電器制造有限公司），101-2A型電熱鼓風干燥箱（天津市泰斯特儀器有限公司），AL104萬分之一分析天平（上海梅特勒-托利多儀器有限公司），SB-5200 DTD超聲清洗機（寧波新芝生物科技股份有限公司），BT125D十萬分之一分析天平（北京賽多利斯科學儀器有限公司），2N-04A粉碎機（北京興時利和科技發(fā)展有限公司），HHS11S電熱恒溫水浴鍋（余姚市上通溫控儀器廠）。

試驗所用紅芪藥材樣品采自甘肅省隴南市武都區(qū)米倉山，經(jīng)甘肅中醫(yī)藥大學藥學院中藥鑒定教研室王明偉副教授鑒定為豆科植物多序巖黃芪Hedysarum polybotrys Hand.-Mazz.的干燥根。毛蕊異黃酮對照品（批號150629，HPLC≥98%）、芒柄花素對照品（批號150419，HPLC≥98%），北京北納創(chuàng)聯(lián)生物技術研究院；甲醇（色譜純，批號20160305）、乙腈（色譜純，批號20151201），天津市大茂化學試劑廠；無水乙醇（分析純，批號20151202），天津市富宇精細化工有限公司；磷酸（色譜純，批號20150707），天津市科密歐化學試劑有限公司；水為娃哈哈純凈水，蜂蜜為槐花蜜（桂林周氏順發(fā)食品有限責任公司）。

2 方法與結(jié)果

2.1 炙紅芪的制備

2.1.1 傳統(tǒng)炙品 根據(jù)2015年版《中華人民共和國藥典》，將紅芪藥材按要求切制為0.2～0.4 cm的厚片，取一定量紅芪飲片，加煉蜜悶潤1 h，用文火炒至不粘手、表面紅棕色、略有光澤、具蜜香氣，鏟出放涼即可。每100 g紅芪用煉蜜25 g。

2.1.2 烘制炙品 取一定量紅芪飲片，加煉蜜悶潤1 h，每100 g紅芪加煉蜜25 g。將悶潤好的紅芪飲片置于磁碟中，厚度為3 cm，放入烘箱。烘制溫度為70 ℃，時間2.5 h，烘制完成后，取出放涼即可[5]。

2.1.3 微波炙品 取一定量紅芪飲片，加煉蜜，悶潤1 h，每100 g紅芪加煉蜜25 g。將悶潤好的紅芪飲片置于磁碟中，厚度2 cm，放入微波爐中。微波火力為低火（350 W，輸出功率50%），時間5 min，微波制完成后，取出放涼即可[6]。

2.2 供試品溶液制備

分別精確稱取已過20目篩的紅芪不同炙品粉末各2.0 g，置150 mL錐形瓶中，精密加入甲醇30 mL，75 ℃水浴回流提取1 h，冰箱4 ℃放置冷卻，用定性濾紙過濾于100 mL蒸發(fā)皿中，45 ℃水浴濃縮，精密移至10 mL容量瓶，用甲醇定容至刻度線，搖勻，再過0.45 μm濾膜，搖勻，作為供試品溶液，備用[7]。

2.3 混合對照品溶液制備

分別精密稱取毛蕊異黃酮和芒柄花素對照品0.97、3.99 mg，分別置于10 mL容量瓶中，加甲醇超聲溶解，定容于10 mL容量瓶中，作為貯備液A、B。分別精密吸取2種對照品貯備液2 mL，用甲醇定容至10 mL，制成混合對照品溶液。

我的接近并最終投身文學，近一甲子矣。在此漫漫歲月，雖無驕人成績，所幸終日矻矻，與文學相伴了一生。朋友曾與我談及一同起步的同行許多已巍然成樹，嘆息我等才情有限，始終不成氣候，最多算棵草而已，很沒勁。我同意他的比喻，卻不同意他的自卑。沒有長成樹木，長成了草，也是文學原野上的生命。而且，一粒種子，能長成一棵草，生動地活著，其實也并不容易。說樹不是一天長成的，草又何嘗不是？天時地利人和，一樣不能少。就一個寫作者而言，不說社會歷史那么高大上的原因了，僅僅稿件的發(fā)表就不知耗費了編輯們多少辛勞。

2.4 色譜條件

采用Agilent HC-C18（2）柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流動相為乙腈-0.01%磷酸水溶液，梯度洗脫（0～12 min，30%～33%乙腈；12～13 min，31%～40%乙腈；13～25 min，40%乙腈）；流速1.0 mL/min；檢測波長248 nm；柱溫30 ℃；進樣量10 μL。在此色譜條件下，色譜圖分離度良好（見圖1）。

2.5 標準曲線繪制

分別精密吸取一定量“2.3”項下貯備液A、B，制成系列濃度的混合對照品溶液（其中毛蕊異黃酮濃度為0.242 5、0.485 0、0.727 5、0.970 0、1.455 0、1.940 0 μg/mL，芒柄花素濃度為3.990、5.985、7.980、9.975、11.970、13.965 μg/mL），進樣10 μL，測定峰面積。以濃度為橫坐標，峰面積積分值為縱坐標，繪制標準曲線，得回歸方程及其線性范圍，見表1。

2.6 精密度試驗

精密吸取“2.3”項下毛蕊異黃酮和芒柄花素對照品貯備液，連續(xù)進樣6次，按“2.4”項下色譜條件測定并計算。結(jié)果毛蕊異黃酮、芒柄花素峰面積 RSD分別為0.16%、0.77%，表明儀器精密度良好。

圖1 紅芪生品和不同蜜炙品中毛蕊異黃酮、芒柄花素HPLC圖

表1 毛蕊異黃酮、芒柄花素線性關系考察結(jié)果

2.7 穩(wěn)定性試驗

取同一紅芪供試品溶液，于4℃放置保存，分別于0、4、8、12、20、24 h進樣檢測，測定峰面積積分值并分別計算其RSD。結(jié)果毛蕊異黃酮、芒柄花素峰面積RSD分別為1.56%、0.55%，表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.8 重復性試驗

精密稱取同一份紅芪樣品（烘制，90 ℃，烘制2 h，厚度1cm）粉末6份，按“2.2”項下方法制成6份供試品溶液，按“2.4”項下色譜條件測定，分別計算各成分含量的RSD。結(jié)果毛蕊異黃酮的平均含量為4.44μg/g，RSD＝2.80%；芒柄花素的平均含量為39.91 μg/g，RSD＝0.40%。

2.9 加樣回收率試驗

精密稱取已知毛蕊異黃酮和芒柄花素含量的同一紅芪樣品（紅芪生品）6份，每份約1.0 g，精密加入等量的毛蕊異黃酮和芒柄花素對照品，按“2.2”項下方法制備供試品溶液，按“2.4”項下色譜條件測定。結(jié)果毛蕊異黃酮和芒柄花素平均回收率分別為96.31%和96.29%，RSD分別為0.89%和1.13%。

2.10 樣品含量測定

精密稱取紅芪生品及不同蜜炙品，制備供試品溶液，測定毛蕊異黃酮和芒柄花素含量，結(jié)果見表2。

表2 紅芪生品和不同蜜炙品中毛蕊異黃酮和芒柄花素含量（μg/g）

3 討論

在供試品溶液的制備過程中，參照文獻[7-8]中的提取方法，對提取溶劑的選擇、料液比、提取方法、提取溫度、提取次數(shù)等做了比較和考察，最終優(yōu)選出供試品溶液的制備方法：甲醇為提取溶劑，料液比為1∶15（紅芪樣品粉末2.0 g，甲醇30 mL），回流提取，提取1次，提取溫度為80℃，提取時間為1 h。

色譜條件的選擇，考察了流動相的種類、比例及檢測波長。以甲醇-水為流動相洗脫時，色譜背景吸收較強，基線漂移較重，色譜峰數(shù)目較少，峰形不好。采用乙腈-水為流動相洗脫時，背景吸收較弱，基線較好，色譜峰數(shù)目較多，但仍有部分峰沒有完全分離，峰形不好，存在拖尾現(xiàn)象。采用乙腈-0.01%磷酸水為流動相洗脫時，色譜峰數(shù)目較多，峰形較好，能除去拖尾現(xiàn)象，達到極限分離的目的。故選用乙腈-0.01%磷酸水為流動相。通過190～400 nm全波段掃描發(fā)現(xiàn)，在248 nm處有最大吸收且基線穩(wěn)定，毛蕊異黃酮和芒柄花素峰形最好，峰面積最大，因此確定 248 nm為檢測波長。

樣品含量測定結(jié)果表明，紅芪傳統(tǒng)炙品中毛蕊異黃酮和芒柄花素含量最低，這可能由于炒制過程中受熱不均勻，局部溫度過高，而使毛蕊異黃酮和芒柄花素部分分解。與紅芪生品相比，紅芪微波炙品中2種成分含量也有所降低，可能由于這2種異黃酮類成分在微波輻射下部分分解。紅芪烘制炙品中毛蕊異黃酮和芒柄花素含量最高，可能由于烘制過程中紅芪飲片受熱均勻且溫度較低（70 ℃），防止了毛蕊異黃酮和芒柄花素分解，且烘制過程使紅芪飲片變得酥脆，有利于有效成分的溶出。可見，不同的蜜炙工藝對紅芪中毛蕊異黃酮和芒柄花素含量有一定的影響。本研究表明，烘制法蜜炙紅芪控溫容易、受熱均勻、操作簡便，是紅芪蜜炙的最優(yōu)方法。

[1]國家藥典委員會.中華人民共和國藥典：一部[M].北京：中國醫(yī)藥科技出版社,2015：152-153.

[2]張鑫,楊英杰,呂慶章.黃芪異黃酮類化合物抗氧化活性的密度泛函理論研究[J].化學研究與應用,2012,24(11)：1662-1669.

[3]張薔,高文遠,滿淑麗.黃芪中有效成分藥理活性的研究進展[J].中國中藥雜志,2012,37(21)：3203-3207.

[4]李成義,王燕,強正澤,等.紅芪與黃芪中兩個異黃酮類成分含量的比較研究[J].中國現(xiàn)代中藥,2014,16(7)：534-537.

[5]朱衛(wèi)星,李愛光,陳方,等.正交實驗優(yōu)選恒溫干燥法蜜炙甘草的工藝研究[J].時珍國醫(yī)國藥,2006,17(8)：1407-1408.

[6]李越峰,嚴興科.正交試驗法優(yōu)選甘草最佳微波炮制工藝[J].中藥材, 2012,35(2)：202-203.

[7]王燕.甘肅地產(chǎn)藥材紅芪的質(zhì)量評價研究[D].蘭州：甘肅中醫(yī)藥大學, 2015.

[8]封士蘭,胡芳弟,趙健雄,等.高效液相色譜法研究紅芪指紋圖譜[J].分析化學,2004,32(6)：710-714.

Effects of Different Honey Sunburn Methods on Calycosin and Formononetin in Hedysari Radix

NIU Jiang-tao, CAO Rui, SI Xin-lei, BIAN Tian-tian, LI Yue-feng (Gansu University of Chinese Medicine, Key Laboratory of Standard and Quality of Chinese Medicine Research of Gansu Province, Lanzhou 730000, China)

ObjectiveTo compare the effects of different methods of honey sunburn on the contents of calycosin and formononetin in Hedysari Radix; To provide the basis for the establishment of the optimum processing technology. Methods By frying (traditional method), baking, and microwave methods put Hedysari Radix under honey sunburn. Agilent HC-C18 column (4.6 mm × 250 mm, 5 μm) was used; the mobile phase was acetonitrile-0.01% phosphoric acid solution, gradient elution (0–12 min, 30%–33% acetonitrile; 12–13 min, 31%–40% acetonitrile; 13–25 min, 40% acetonitrile) with velocity of 1.0 mL/min; detection wavelength was 248 nm; the column temperature was 30 ℃; sample volume was 10 μL. Results There was statistical significance in the contents of calycosin and formononetin of different methods of honey sunburn for Hedysari Radix. Among them, the contents of calycosin and formononetin in Hedysari Radix processed by honey roast were the highest, 7.911 6 and 49.699 6 μg/g, respectively; the contents of calycosin and formononetin in Hedysari Radix processed by traditional method were the lowest, 4.776 7 and 37.291 0 μg/g, respectively; the contents of calycosin and formononetin in raw Hedysari Radix and Hedysari Radix by honey microwave method were the same, 5.080 2, 42.798 9 μg/g, and 3.983 9, 42.314 5 μg/g, respectively. Conclusion Different honey sunburn methods for the contents of calycosin and formononetin in Hedysari Radix have certain effects, and honey roast method is the optimum method.

Hedysari Radix; honey sunburn; calycosin; formononetin

10.3969/j.issn.1005-5304.2017.09.015

R283.3

A

1005-5304(2017)09-0059-04

2017-01-14）

（

2017-02-21；編輯：陳靜）

國家自然科學基金（81460611）；教育部科學技術研究重點項目（212186）；甘肅省自然科學研究基金計劃（1010RJZA212、145RJZA076）；甘肅省高等學?；究蒲袠I(yè)務費專項資金（2013-2）；甘肅省中醫(yī)藥管理局科研立項項目（GZK-2015-57）；蘭州市科技計劃項目（2014-1-188）

李越峰，E-mail：lyfyxk@126.com