通絡活血蟲類藥對乏氧環(huán)境下肺癌血管生成相關細胞因子的影響

李道睿，王苗苗，2，于明薇，林飛，張穎，李蒙，樊慧婷，鄭琦，祁鑫，裴迎霞，張培彤，侯煒，林洪生

1.中國中醫(yī)科學院廣安門醫(yī)院，北京 100053；2.北京中醫(yī)藥大學，北京 100029；3.首都醫(yī)科大學附屬北京中醫(yī)醫(yī)院，北京 100010

通絡活血蟲類藥對乏氧環(huán)境下肺癌血管生成相關細胞因子的影響

李道睿1，王苗苗1，2，于明薇3，林飛1，張穎1，李蒙1，樊慧婷1，鄭琦1，祁鑫1，裴迎霞1，張培彤1，侯煒1，林洪生1

1.中國中醫(yī)科學院廣安門醫(yī)院，北京 100053；2.北京中醫(yī)藥大學，北京 100029；3.首都醫(yī)科大學附屬北京中醫(yī)醫(yī)院，北京 100010

目的觀察通絡活血蟲類藥（全蝎、蜈蚣、守宮）對乏氧環(huán)境下肺癌血管生成相關細胞因子的影響。方法 采用低氧工作站體外模擬腫瘤乏氧微環(huán)境培養(yǎng)A549肺癌細胞，加入不同濃度全蝎、蜈蚣、守宮藥物血清，MTT法檢測細胞增殖，篩選最佳藥物濃度及作用時間。A549肺癌細胞經(jīng)3種藥物血清處理后，收集細胞培養(yǎng)上清液，ELISA檢測上清液中血管內皮生長因子（VEGF）、轉化生長因子-β1（TGF-β1）、堿性成纖維細胞生長因子（bFGF）的含量。結果 3種藥物血清對常氧及乏氧培養(yǎng)的A549肺癌細胞增殖均有一定的抑制作用。最終篩選7.5%濃度藥物血清、作用24 h進行后續(xù)實驗。3種藥物血清較對照組A549細胞VEGF、TGF-β1、bFGF含量均降低（P＜0.05，P＜0.01）。結論 3種蟲類藥在常氧和乏氧狀態(tài)下均有抑制癌細胞和對血管生成相關細胞因子調控的作用。

通絡活血；蟲類藥；肺癌；乏氧

肺癌是當今世界對人類健康與生命危害最大的惡性腫瘤之一，其發(fā)病率、死亡率居惡性腫瘤第1位。目前由于缺乏有效的治療手段，不能很好地控制肺癌的轉移，常常導致治療的失敗。因此，防止和阻斷轉移是肺癌治療取得成功的關鍵。本課題組前期研究顯示，肺癌轉移的形成與肺癌患者普遍存在“絡脈瘀滯”的現(xiàn)象有直接關系[1]，“絡病”可能是肺癌發(fā)生轉移的病機要點和關鍵環(huán)節(jié)，腫瘤乏氧微環(huán)境在這一過程中起著至關重要的作用?；凇跋x蟻通絡”理論，全蝎、蜈蚣、守宮等有通絡活血作用的蟲類藥在臨床中廣泛應用于肺癌轉移的防治中，其發(fā)揮作用的主要環(huán)節(jié)可能是改善腫瘤乏氧微環(huán)境。本研究采用低氧工作站培養(yǎng)肺癌A549細胞模擬腫瘤乏氧微環(huán)境，觀察通絡活血蟲類藥（全蝎、蜈蚣、守宮）藥物血清對乏氧環(huán)境下肺癌血管生成相關細胞因子的干預作用，以期闡釋蟲類藥在干預肺癌轉移方面的具體作用靶點。

1 實驗材料

1.1 動物

健康清潔級雌性Wistar大鼠40只，4周齡，體質量 230～250 g，北京維通利華實驗動物技術有限公司，動物許可證號SCXK（京）2006-0009。飼養(yǎng)于中國中醫(yī)科學院廣安門醫(yī)院清潔級動物室，室溫（20±3）℃、相對濕度 40%～60%，每日人工照明12 h，每籠4只，自由飲水攝食。

1.2 細胞株

高轉移性人肺腺癌A549細胞株，中國醫(yī)學科學院基礎醫(yī)學研究所基礎醫(yī)學細胞中心。

1.3 藥物及藥物血清制備

全蝎、蜈蚣、守宮購自北京市本草方源醫(yī)藥公司，批號20141121，經(jīng)中國中醫(yī)科學院廣安門醫(yī)院張萱鑒定符合藥典標準。將原藥材粉碎成細粉，4 ℃保存?zhèn)溆茫们坝脽o菌水稀釋至所需濃度。全蝎、蜈蚣、守宮大鼠藥物血清制備：按照臨床患者用藥劑量折算大鼠的生物等效劑量（全蝎、蜈蚣、守宮臨床用藥劑量分別按1、1、2.5 g計），制備中藥水溶劑。實驗大鼠采用隨機數(shù)字表法隨機分為4組，每組10只，分別予3種中藥水溶液和生理鹽水灌胃，連續(xù)3 d，前2 d每日2次，第3日給藥1次后腹主動脈取血。末次給藥1 h后2%異戊巴比妥鈉（0.2 mL/100 g）麻醉后腹主動脈取血，室溫靜置2 h，3500 r/min離心20 min，分離分裝血清，56 ℃滅活30 min，-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4 主要試劑與儀器

血管內皮生長因子（VEGF）、轉化生長因子-β1（TGF-β1）試劑盒，MULTISCIENCE公司；堿性成纖維細胞生長因子（bFGF）試劑盒，ELABSCIENCE公司；噻唑藍（MTT），Sigma公司；DMEM（SH30023），Hyclone公司；胎牛血清（FBS，SH30084），Hyclone公司；雙抗（SV30010），Hyclone公司。CO2培養(yǎng)箱，Thermo公司；全波長酶標儀（Multiskan GO），Thermo公司；倒置顯微鏡（TS-100），Nicon公司；全自動多功能酶標儀（Multiskan MK3），Thermo公司；電熱恒溫培養(yǎng)箱，DH4000A，天津泰斯特；低氧工作站，Ruskinn公司。

2 實驗方法

2.1 肺癌細胞常氧培養(yǎng)條件

A549細胞采用含10%FBS、抗生素（100 U/mL青霉素和100 μg/mL鏈霉素）的DMEM培養(yǎng)基，于37 ℃、21%O2和5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，1∶3～1∶5傳代，取對數(shù)生長期細胞用于實驗。

2.2 肺癌細胞乏氧培養(yǎng)條件

A549細胞采用相同成分培養(yǎng)基，37 ℃、1%O2和5%CO2低氧工作站中培養(yǎng)。

2.3 分組

經(jīng)預實驗篩選后，本實驗分為 48組。常氧對照組：細胞置于常氧條件下加入不同濃度大鼠血清（5%、7.5%、10%）培養(yǎng)24、48 h；乏氧對照組：細胞置于乏氧條件下加入不同濃度大鼠血清（5%、7.5%、10%）培養(yǎng)24、48 h；常氧全蝎組：細胞置于常氧條件下加入不同濃度全蝎藥物血清（5%、7.5%、10%）培養(yǎng)24、48 h；乏氧全蝎組：細胞置于乏氧條件下加入不同濃度全蝎藥物血清（5%、7.5%、10%）培養(yǎng)24、48 h；常氧蜈蚣組：細胞置于常氧條件下加入不同濃度蜈蚣藥物血清（5%、7.5%、10%）培養(yǎng)24、48 h；乏氧蜈蚣組：細胞置于乏氧條件下加入不同濃度蜈蚣藥物血清（5%、7.5%、10%）培養(yǎng) 24、48 h；常氧守宮組：細胞置于常氧條件下加入不同濃度守宮藥物血清（5%、7.5%、10%）培養(yǎng)24、48 h；乏氧守宮組：細胞置于乏氧條件下加入不同濃度守宮藥物血清（5%、7.5%、10%）培養(yǎng)24、48 h。

2.4 細胞增殖檢測（藥物最佳劑量和作用時間篩選）

稱取MTT粉250 mg，溶于50 mL PBS，混勻，終濃度5 mg/mL，0.22 μm微孔濾膜過濾，700 μL/支分裝，-20 ℃避光保存。取對數(shù)生長期的 A549細胞，常規(guī)消化，制成單細胞混懸液，調整細胞數(shù)為1×104/mL，接種于96孔板，每孔100 μL，常規(guī)培養(yǎng)過夜，分別加入不同濃度全蝎、蜈蚣、守宮藥物血清（5%、7.5%、10%）及相應濃度大鼠血清作為對照組，每組設6個復孔，繼續(xù)培養(yǎng)24、48 h，培養(yǎng)結束前4 h每孔加入MTT（5 mg/mL）10 μL，繼續(xù)培養(yǎng)4 h后棄培養(yǎng)基，每孔加入150 μL DMSO，充分混勻，于酶標儀波長490 nm處測定吸光度（A），計算細胞增殖抑制率。細胞增殖抑制率（%）＝（1－A給藥組÷A對照組）× 100%。

2.5 細胞因子檢測

A549細胞分別在常氧和乏氧條件下經(jīng)MTT篩選的最佳作用濃度和時間處理后，收集細胞培養(yǎng)上清液，每組設 6個復孔，ELISA檢測細胞培養(yǎng)上清VEGF、TGF-β、bFGF的含量。嚴格按照試劑盒說明書進行檢測。

3 統(tǒng)計學方法

4 結果

4.1 不同濃度藥物血清對A549肺癌細胞增殖的影響

3種中藥藥物血清對常氧及乏氧培養(yǎng)A549肺癌細胞增殖均有抑制作用，其中 7.5%濃度組與對照組比較差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.05，P＜0.01）；同時藥物作用24、48 h細胞增殖抑制率未見明顯差異，見表1、表2。故最終篩選7.5%濃度藥物血清、干預24 h，進行后續(xù)實驗。

表1 常氧及乏氧環(huán)境培養(yǎng)24 h MTT法檢測結果（±s，n＝6）

表1 常氧及乏氧環(huán)境培養(yǎng)24 h MTT法檢測結果（±s，n＝6）

注：與同一濃度大鼠血清對照組比較，*P＜0.05，**P＜0.01

組別 常氧 乏氧A值 抑制率/% A值 抑制率/% 5%大鼠血清對照組 0.345±0.034 0.435±0.079 5%全蝎血清組 0.288±0.044 16.54 0.418±0.091 3.82 5%蜈蚣血清組 0.282±0.046* 18.45 0.377±0.014 13.21 5%守宮血清組 0.265±0.030** 23.18 0.368±0.026 15.37 7.5%大鼠血清對照組 0.533±0.040 0.466±0.052 7.5%全蝎血清組 0.443±0.045** 16.79 0.376±0.040** 19.20 7.5%蜈蚣血清組 0.399±0.024** 25.05 0.357±0.028** 23.32 7.5%守宮血清組 0.379±0.035** 28.84 0.345±0.042** 25.92 10%大鼠血清對照組 0.410±0.094 0.430±0.094 10%全蝎血清組 0.333±0.041 18.70 0.350±0.063 18.70 10%蜈蚣血清組 0.308±0.034* 24.76 0.332±0.039 22.91 10%守宮血清組 0.298±0.038* 27.17 0.323±0.054* 24.98

表2 常氧及乏氧環(huán)境培養(yǎng)48 h MTT法檢測結果（±s，n＝6）

表2 常氧及乏氧環(huán)境培養(yǎng)48 h MTT法檢測結果（±s，n＝6）

注：與同一濃度大鼠血清對照組比較，*P＜0.05，**P＜0.01

組別常氧 乏氧A值 抑制率/ % A值 抑制率/ % 5 %大鼠血清對照組 0 . 7 3 8 ± 0 . 1 5 2 0 . 7 4 9 ± 0 . 0 4 9 5 %全蝎血清組 0 . 6 5 8 ± 0 . 1 2 2 1 0 . 9 4 0 . 7 1 1 ± 0 . 0 4 8 5 . 0 0 5 %蜈蚣血清組 0 . 6 3 1 ± 0 . 0 3 5 1 4 . 5 5 0 . 6 5 2 ± 0 . 0 4 4* 1 2 . 9 2 5 %守宮血清組 0 . 6 1 6 ± 0 . 1 1 5 1 6 . 5 8 0 . 6 4 6 ± 0 . 0 5 3** 1 3 . 7 2 7 . 5 %大鼠血清對照組 1 . 1 0 4 ± 0 . 0 8 5 0 . 7 6 0 ± 0 . 1 2 6 7 . 5 %全蝎血清組 0 . 9 0 5 ± 0 . 1 0 4** 1 8 . 0 7 0 . 6 1 5 ± 0 . 0 3 0* 1 9 . 0 2 7 . 5 %蜈蚣血清組 0 . 8 3 7 ± 0 . 0 8 2** 2 4 . 1 6 0 . 5 8 4 ± 0 . 0 6 0** 2 3 . 0 7 7 . 5 %守宮血清組 0 . 8 0 3 ± 0 . 0 7 7** 2 7 . 2 4 0 . 5 6 8 ± 0 . 0 3 2** 2 5 . 1 8 1 0 %大鼠血清對照組 0 . 9 3 5 ± 0 . 1 2 4 0 . 6 6 0 ± 0 . 1 3 5 1 0 %全蝎血清組 0 . 7 7 5 ± 0 . 0 8 3 1 7 . 0 9 0 . 5 3 0 ± 0 . 0 9 3 1 9 . 6 8 1 0 %蜈蚣血清組 0 . 7 0 3 ± 0 . 1 0 7** 2 4 . 8 1 0 . 5 0 0 ± 0 . 0 6 3 2 4 . 2 2 1 0 %守宮血清組 0 . 6 9 4 ± 0 . 0 9 2** 2 5 . 7 5 0 . 4 9 6 ± 0 . 1 0 1* 2 4 . 9 2

4.2 不同濃度藥物血清對A549肺癌細胞血管生成相關細胞因子的影響

選取7.5%濃度藥物血清作用A549細胞24 h后，全蝎組、蜈蚣組、守宮組A549細胞VEGF、TGF-β1、bFGF含量降低，且該作用在常氧和乏氧狀態(tài)下相同。見表3。

表3 各組細胞上清液相關細胞因子水平比較（±s，pg/mL）

表3 各組細胞上清液相關細胞因子水平比較（±s，pg/mL）

注：與對照組比較，*P＜0.05，**P＜0.01

組別 n常氧b F G F T G F -β 1 V E G F對照組 6 2 6 4 . 6 4 ± 2 3 . 5 4 2 9 7 9 . 9 1 ± 4 0 6 . 9 1 1 0 2 . 7 4 ± 2 2 . 2 1 3 1 9 . 3 0 ± 3 2 . 6 6 3 5 6 5 . 6 5 ± 3 7 2 . 1 1 1 2 1 . 3 4 ± 2 3 . 0 3乏氧 b F G F T G F -β 1 V E G F全蝎組 6 2 1 1 . 1 5 ± 3 0 . 8 4* 2 4 2 2 . 4 4 ± 3 1 8 . 5 7* 5 9 . 9 0 ± 2 1 . 0 3* 2 5 3 . 0 2 ± 4 3 . 2 6* 2 7 4 2 . 7 9 ± 4 8 3 . 6 1* 8 2 . 7 5 ± 2 2 . 1 1*蜈蚣組 6 2 1 4 . 2 9 ± 3 4 . 3 9* 2 3 4 4 . 8 0 ± 3 1 0 . 4 6* 5 8 . 1 4 ± 2 4 . 0 1* 2 5 4 . 1 1 ± 4 9 . 0 8* 2 7 3 8 . 3 3 ± 5 3 8 . 5 2* 7 8 . 9 7 ± 2 3 . 1 7*守宮組 6 2 0 9 . 3 8 ± 2 8 . 8 0* 2 3 6 1 . 4 5 ± 2 9 9 . 0 1* 5 5 . 4 1 ± 2 2 . 7 5** 2 3 8 . 4 6 ± 4 3 . 4 3** 2 6 9 1 . 7 2 ± 5 4 8 . 8 0* 6 9 . 2 2 ± 2 6 . 6 6**

5 討論

乏氧是實體腫瘤中較常見的現(xiàn)象，腫瘤細胞處于乏氧微環(huán)境時，可通過多種細胞機制調節(jié)使癌細胞適應這種不利的環(huán)境，進而使腫瘤細胞更具有抵抗力和生存的能力。這種適應性的改變不僅使腫瘤自身更具侵襲性，容易發(fā)生遠處轉移，而且能使腫瘤對非手術治療的抗拒性增加，降低腫瘤治療的療效。絡脈是經(jīng)脈向臟腑肢節(jié)滲灌氣血與氣機氣化的主要場所，亦為外邪入侵之門徑。結合現(xiàn)代醫(yī)學的認識，肺癌“絡病”有著明確的現(xiàn)代生物學基礎，肺癌絡病可能是中醫(yī)學肺癌發(fā)生與轉移機制的中心環(huán)節(jié)[2]。肺氣虧虛，五臟之毒亦可通過經(jīng)絡傳舍于肺，混處肺絡，留而成積，導致肺癌的發(fā)生。氣為血之帥，氣行則血行，氣機不暢，血行代謝障礙，瘀久而成腫塊；痰濕、邪毒結于臟腑經(jīng)絡，無處不到，同時亦可能以絡脈系統(tǒng)為通路，發(fā)生侵襲與轉移。因此，我們認為腫瘤乏氧微環(huán)境導致瘤轉移與肺癌“絡脈瘀滯”理論有很強的相關性。

中醫(yī)學認為蟲類藥乃血肉有情之品，以咸味、辛味居多，氣溫或平，且多有小毒。辛味“能散，能行”，加之性溫，多能通，可消除壅滯；咸以入血、軟堅散結，故《素問?宣明五氣篇》有“咸走血”，又以取類比象法，認為蟲類藥性善走竄，剔邪搜絡，攻堅破積；吳鞠通言：“以食血之蟲，飛者走絡中氣分，走者走絡中血分，可謂無微不入，無堅不破?！苯袢酥文[瘤常常選擇蟲類藥，皆利用其走竄善行之特點，搜剔血絡。全蝎，辛、咸、平、有毒，為鉗蝎科動物鉗蝎的干燥全蟲；蜈蚣，辛、溫、有毒，為大蜈蚣科動物少棘巨蜈蚣或其近緣動物的干燥全蟲；守宮（又稱壁虎、蝎虎、天龍等），咸、寒、有小毒，為壁虎科動物無蹼壁虎的全體。三者性喜走竄，內入臟腑，外達經(jīng)絡，均具有通絡活血散結之效，在臨床腫瘤治療中常配伍應用，在一些基礎實驗中也初步發(fā)現(xiàn)此3種中藥具有抑制腫瘤轉移及抗腫瘤血管新生的作用[3-5]，故本實驗選取上述中藥作為通絡活血蟲類藥代表藥，研究其對肺癌“絡脈瘀滯”干預的深入作用機理。

在既往的研究中，我們采用Ruskinn低氧工作站體外模擬肺癌乏氧環(huán)境取得了很好的效果。我們將人肺癌PG細胞分別置于常氧環(huán)境、低氧環(huán)境傳代培養(yǎng)，發(fā)現(xiàn)適度的缺氧肺癌細胞增殖明顯增加，并有利于細胞的侵襲[6]。血管生成是腫瘤發(fā)生和轉移的基本條件之一。腫瘤生長迅速，現(xiàn)有血管難以滿足腫瘤對氧氣和營養(yǎng)的需求，缺氧誘導腫瘤微環(huán)境中 VEGF、TGF-β1、bFGF等細胞因子的含量增加[7-9]，進而刺激腫瘤血管新生及轉移的發(fā)生。

本研究結果顯示，全蝎、蜈蚣、守宮藥物血清對常氧及乏氧培養(yǎng)的A549肺癌細胞增殖均有一定的抑制作用。3種中藥藥物血清可降低A549細胞VEGF、TGF-β1、bFGF的含量。3種蟲類藥在常氧和乏氧狀態(tài)下均具有抑制癌細胞和對血管生成相關細胞因子的調控作用，顯示此類中藥對腫瘤獨特的作用特點。本實驗初步證明了對血管生成相關細胞因子的調控是通絡活血蟲類藥改善腫瘤乏氧及轉移的具體作用靶點之一。但由于該類中藥成分和乏氧腫瘤微環(huán)境的復雜性，今后還需要進行更加深入的研究。

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Effects of Dredging Collaterals and Activating Blood Worm Chinese Materia Medica on Angiogenesis Related Factors of Lung Cancer in Hypoxic Environment

LI Dao-rui1, WANG Miao-miao1,2, YU Ming-wei3, LIN Fei1, ZHANG Ying1, LI Meng1, FAN Hui-ting1, ZHENG Qi1, QI Xin1, PEI Ying-xia1, ZHANG Pei-tong1, HOU Wei1, LIN Hong-sheng1(1. Guang’anmen Hospital, China Academy of Chinses Medical Sciences, Beijing 100053, China; 2. Beijing University of Chinese Medicine, Beijing 100029, China; 3. Beijing Hospital of Traditional Chinese Medicine Affiliated to Capital Medical University, Beijing 100010, China)

ObjectiveTo observe the effects of dredging collaterals and activating blood worm Chinese materia medica on angiogenesis related factors of lung cancer in hypoxic environment. Methods The lung cancer A549 cells were cultured in vitro to simulate tumor hypoxia microenvironment by the hypoxia workstation, and different concentrations of Scorpio, Scolopendra and Gecko medicated serum were added. MTT method was used to detect cell proliferation and screen the best medicine concentration and duration of action. Lung cancer A549 cells were administrated by the three kinds of medicated serum, and cells were collected and supernatant was cultured. Contents of VEGF, TGF-β1, and bFGF were detected by ELISA. Results Three kinds of medicated serum had the inhibitory effect on both added normoxia and hypoxia in cultured A549 lung cancer cells. 7.5% concentration of medicated serum was selected, and 24 h later were used in later experiments. Scorpio, Scolopendra and Gecko medicated serum can more reduce the contents of VEGF, TGF-β1 and bFGF in the supernatant of A549 cell compared with the control group (P＜0.05, P＜0.01). Conclusion Dredging collaterals and activating blood worm Chinese materia medica had inhibitory effect on cancer cells and the regulation of angiogenesis related cytokines in the condition of normoxia and hypoxia.

dredging collaterals and activating blood; worm Chinese materia medica; lung cancer; hypoxia

10.3969/j.issn.1005-5304.2017.09.010

R285.5

A

1005-5304(2017)09-0039-04

2017-03-10）

（

2017-03-31；編輯：華強）

國家自然科學基金（81302963）

林洪生，E-mail：dr.linhongsheng@163.com