不同日齡仔豬外周血T淋巴細(xì)胞的檢測與分析

鄒 璐，張景艷，張 凱，王 磊，張 康，王旭榮，王學(xué)智，余四九，楊志強，*，李建喜，*

(1.甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué) 動物醫(yī)學(xué)院， 甘肅 蘭州 730050； 2.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院 蘭州畜牧與獸藥研究所，甘肅省中獸藥工程技術(shù)研究中心，甘肅 蘭州 730050)

不同日齡仔豬外周血T淋巴細(xì)胞的檢測與分析

鄒 璐1，2，張景艷2，張 凱2，王 磊2，張 康2，王旭榮2，王學(xué)智2，余四九1，楊志強2，*，李建喜2，*

(1.甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué) 動物醫(yī)學(xué)院， 甘肅 蘭州 730050； 2.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院 蘭州畜牧與獸藥研究所，甘肅省中獸藥工程技術(shù)研究中心，甘肅 蘭州 730050)

為建立健康仔豬外周血淋巴細(xì)胞亞群的臨床參考范圍，試驗分析不同生長階段仔豬的免疫系統(tǒng)功能水平，分別在健康仔豬斷奶后第1、7、21和35天采取外周血，分離外周血單個核細(xì)胞，采用三色流式細(xì)胞術(shù)的方法檢測各類主要T淋巴細(xì)胞亞群所占外周血單個核細(xì)胞的比例，及其占CD3+T淋巴細(xì)胞亞群中的比例，計算CD4+/CD8+的比值。結(jié)果表明，隨著日齡的增加公母仔豬CD3+T淋巴細(xì)胞亞群占外周血單個核細(xì)胞的比例逐漸升高，分別從(38.00±10.94)% 和(38.17±15.39)%上升至(55.43±12.30)%和(51.57±10.60)%。在斷奶后1 d和7 d公母仔豬CD3+T淋巴細(xì)胞比例無顯著性差異(P>0.05)，至斷奶后21 d母仔豬CD3+T淋巴細(xì)胞比例顯著增加(P<0.05)，公仔豬至35 d時CD3+T淋巴細(xì)胞比例顯著增加(P<0.05)。隨著日齡的增長，公母仔豬CD4+T淋巴細(xì)胞亞群占外周血單個核細(xì)胞的比例分別由(10.29±2.71)% 和(10.3±2.17)%上升至(22.2±5.87)%和(23.4±6.84)%。公母仔豬CD4+T淋巴細(xì)胞的比例逐漸升高，且各個時間點公母仔豬結(jié)果無明顯差異(P>0.05)。公母仔豬CD8+T淋巴細(xì)胞占外周血單個核細(xì)胞的比例在各時間點分別為(23.80±6.67)%、(17.14±10.64)%、(25.46±12.32)%、(33.33±8.93)%和(28.55±6.75)%、(23.62±11.51)%、(37.37±13.18)%、(38.31±15.66)%。隨著日齡的增加公母斷奶仔豬CD8+T淋巴細(xì)胞呈現(xiàn)先下降后升高的趨勢。斷奶仔豬各淋巴細(xì)胞亞群分布會隨著斷奶時間的增加而呈現(xiàn)不同的變化，并且存在著性別上的差異。結(jié)合兩種不同的細(xì)胞圈定方法，能夠更準(zhǔn)確地反映出仔豬體內(nèi)各淋巴細(xì)胞亞群數(shù)量和比例的變化。

仔豬；T淋巴細(xì)胞亞群；流式細(xì)胞術(shù)；細(xì)胞圈定

仔豬在斷奶初期，由于免疫器官尚未完全發(fā)育，對環(huán)境的劇烈變化抵抗能力較弱，很容易感染某些疾病，造成產(chǎn)量的巨大損失[1]。越來越多的研究表明，T淋巴細(xì)胞作為機體免疫系統(tǒng)內(nèi)功能最重要的一類細(xì)胞，維持著機體正常的免疫功能[2-3]。在各種臨床疾病如自身免疫性疾病、免疫缺陷性疾病、變態(tài)反應(yīng)性疾病、再生障礙性貧血、病毒感染、惡性腫瘤等，T淋巴細(xì)胞亞群及其表型都有異常改變。因此，T淋巴細(xì)胞亞群(如CD3、CD4 和CD8 T淋巴細(xì)胞)的檢測對控制疾病的發(fā)生、發(fā)展，了解發(fā)病機制、指導(dǎo)臨床治療都有極其重要的意義，是臨床檢驗的一項重要指標(biāo)[3-4]。T淋巴細(xì)胞亞群的檢測一般為檢測動物體內(nèi)免疫狀態(tài)，主要是通過檢測IFN-γ及IL-4等細(xì)胞因子的含量間接地反映CD4+和CD8+淋巴細(xì)胞的含量，這種方法不能直接地反映動物體內(nèi)T淋巴細(xì)胞的詳細(xì)比值，而流式細(xì)胞術(shù)作為一種在細(xì)胞水平上對單個細(xì)胞或其他生物粒子進(jìn)行定量分析和分選的方法，現(xiàn)已被廣泛應(yīng)用于檢測各種免疫細(xì)胞表面標(biāo)志及細(xì)胞內(nèi)各種細(xì)胞因子等[5-6]。目前，國內(nèi)外有關(guān)不同日齡仔豬外周血T淋巴細(xì)胞亞群的報道較少，缺乏針對不同生長階段健康仔豬的免疫系統(tǒng)功能狀態(tài)的臨床研究。本研究利用三色流式細(xì)胞術(shù)的方法對不同日齡仔豬外周血T淋巴細(xì)胞亞群進(jìn)行測定，旨在為建立健康仔豬外周血淋巴細(xì)胞亞群的臨床參考范圍提供參考，比較仔豬在不同生長階段外周血淋巴細(xì)胞亞群的變化趨勢，從而為臨床更有效地采用預(yù)防治療措施提供理論依據(jù)和臨床評價標(biāo)準(zhǔn)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試驗動物

平均體質(zhì)量8.5 kg且無明顯差異(P>0.05)的“杜洛克×長白×大白”三元雜交21日齡斷奶仔豬24頭，公母各半，購自甘肅省蘭州市永登縣天欣養(yǎng)殖有限公司養(yǎng)殖場。

飼養(yǎng)管理：試驗于中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院蘭州畜牧與獸藥研究所實驗動物基地進(jìn)行。仔豬飼養(yǎng)于全封閉式豬舍的水泥地面，飼喂顆粒料，少量多次，自由采食、飲水，不進(jìn)行后續(xù)的免疫及驅(qū)蟲。

1.1.2 主要試劑及儀器

豬外周血淋巴細(xì)胞分離液試劑盒(天津市灝洋生物制品科技有限責(zé)任公司)、小鼠抗豬CD3-FITC、小鼠抗豬CD4-SPRD、小鼠抗豬CD8-PE、小鼠IgG-FITC、小鼠IgG-PE、小鼠IgG-SPRD(Southernbiotech公司)、小鼠封閉血清(北京索萊寶科技有限公司)、PBS(上海碧云天生物技術(shù)公司)。臺式高速冷凍水平離心機、流式細(xì)胞儀FC500(美國貝克曼庫爾特有限公司)。

1.2 方法

1.2.1 仔豬生長速率統(tǒng)計

試驗開始后，分別在斷奶后第1、7、21、35天四個時間點的前一天對仔豬進(jìn)行空腹處理，次日稱量公母仔豬體質(zhì)量，統(tǒng)計公母仔豬的生長速率。

1.2.2 斷奶仔豬單個核細(xì)胞制備

隨機挑選24頭仔豬，雌雄各半，分別在斷奶后第1、7、21、35天，從前腔靜脈采集空腹斷奶仔豬的外周血，肝素鈉抗凝。按照豬外周血淋巴細(xì)胞分離試劑盒說明書分離外周血淋巴細(xì)胞。并在收集到的細(xì)胞液加入紅細(xì)胞裂解液，裂解至澄清透明，離心棄上清液，D-PBS清洗細(xì)胞2遍。采用小鼠封閉血清4 ℃ 孵育30 min，離心棄上清，D-PBS清洗細(xì)胞2遍，獲得斷奶仔豬外周血單個核細(xì)胞。

1.2.3 流式細(xì)胞儀檢測方法

(1)同型對照管的制備。配制1×106cells·mL-1的單個核細(xì)胞，加入三種同型對照抗體，4 ℃ 抗體孵育30 min，離心棄液體，PBS清洗兩遍，500 μL PBS重懸細(xì)胞。

(2)單染管的制備。配制1×106cells·mL-1的單個核細(xì)胞3管，分別加入小鼠抗豬CD3-FITC抗體、小鼠抗豬CD4-SPRD抗體、小鼠抗豬CD8-PE標(biāo)記抗體，4 ℃抗體孵育30 min，離心棄液體，PBS清洗2遍，500 μL PBS重懸細(xì)胞。

(3)樣本管的制備。所有樣本細(xì)胞濃度稀釋到1×106cells·mL-1，加入3種小鼠抗豬抗體，剩余處理同上。

(4)數(shù)據(jù)分析。采用Beckman FC500流式細(xì)胞儀獲取細(xì)胞，應(yīng)用CXP軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，測得外周血各淋巴細(xì)胞的組成及比例。

1.2.4 統(tǒng)計學(xué)處理

使用SPSS22.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析，計量資料用Means±SD表示，組間差異顯著性用t檢驗進(jìn)行比較，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果與分析

2.1 斷奶仔豬體質(zhì)量統(tǒng)計結(jié)果

分別在仔豬斷奶后第1、7、21、35天稱量仔豬體質(zhì)量，統(tǒng)計公母仔豬斷奶后體質(zhì)量，對結(jié)果(圖1)進(jìn)行分析。

通過對公母斷奶仔豬體質(zhì)量數(shù)據(jù)的分析可知，公母斷奶仔豬在斷奶后第1天、第7天體質(zhì)量差異不顯著，在第21天時公母仔豬體質(zhì)量分別為(16.02±2.41)、(18.02±3.7)kg，體質(zhì)量差異顯著(P<0.05)，至斷奶后35 d公母仔豬體質(zhì)量分別為(20.25±3.48)、(21.98±3.93)kg，差異不顯著。在斷奶后7～21 d，母仔豬的生長速率大于公仔豬；在斷奶后21～35 d，公仔豬的生長速率大于母仔豬。

2.2 斷奶仔豬外周血CD3+T淋巴細(xì)胞統(tǒng)計

通過分析圖2中數(shù)據(jù)可知，公母斷奶仔豬在斷奶開始時CD3+T淋巴細(xì)胞所占外周血單個核細(xì)胞的比例分別為(38.00±3.94)%和(38.17±3.39)%。仔豬在斷奶后CD3+T淋巴細(xì)胞逐漸上升，至斷奶第7天公母斷奶仔豬CD3+T淋巴細(xì)胞分別為(40.46±3.71)%、(41.05±2.17)%，差異不顯著。至斷奶第21 天公母仔豬CD3+T淋巴細(xì)胞亞群比例差異顯著，母仔豬CD3+T淋巴細(xì)胞亞群的比例高于公仔豬，分別為(47.36±1.89)%、(42.91±2.83)%。說明在仔豬生長發(fā)育過程中，母仔豬比公仔豬CD3+T淋巴細(xì)胞較早快速增長，同時在斷奶35日齡時公仔豬CD3+T淋巴細(xì)胞比例較21 d時顯著上升，此時公母仔豬CD3+T淋巴細(xì)胞亞群比例差異不顯著。

圖1 公母仔豬斷奶后體質(zhì)量變化Fig.1 Weight statistics of male and female weaned piglets

每組樣品數(shù)為12個；帶有不同小寫字母標(biāo)記的數(shù)據(jù)間差異顯著(P<0.05)The above values are the average of 12 samples. The values with different letters showed significant difference at P<0.05 level.圖2 仔豬外周血CD3+ T淋巴細(xì)胞統(tǒng)計Fig.2 CD3+ T lymphocyte percentage in peripheral blood of piglets

2.3 斷奶仔豬外周血CD4+、CD8+淋巴細(xì)胞統(tǒng)計

分析圖3中數(shù)據(jù)可知，仔豬斷奶后0～7 d，斷奶仔豬體內(nèi)CD4+T淋巴細(xì)胞持續(xù)維持在較低水平，公母仔豬CD4+T淋巴細(xì)胞亞群占外周血單個核細(xì)胞的比例差異不顯著，約為10%～11%。至斷奶21 d時，仔豬體內(nèi)的CD4+淋巴細(xì)胞才有明顯的增長，所占比例約為14%。至斷奶35 d時，斷奶仔豬CD4+淋巴細(xì)胞亞群已有較高的比例，達(dá)到23%左右，故隨著斷奶日齡的增加，仔豬CD4+T淋巴細(xì)胞亞群的比例逐漸增加。

分析圖4中的數(shù)據(jù)可知，在仔豬開始斷奶時母仔豬CD8+淋巴細(xì)胞比例高于公豬，分別為(28.55±1.75)%、(23.8±1.67)%。隨著斷奶時間的延長，仔豬斷奶7 d時仔豬體內(nèi)CD8+淋巴細(xì)胞出現(xiàn)明顯下降，且公仔豬相較于母仔豬下降更明顯，分別為(17.14±2.64)%、(23.62±1.51)%。至第21天，公母仔豬CD8+T淋巴細(xì)胞出現(xiàn)明顯上升，但母仔豬上升的更加明顯，公母仔豬CD8+T淋巴細(xì)胞亞群所占外周血單個核細(xì)胞的比例分別為(25.46±2.32)%、(37.37±2.18)%。公仔豬至斷奶35日齡時，CD8+T淋巴細(xì)胞亞群的比例為(33.33±2.93)%，仍低于母仔豬所占比例，差異不顯著，說明公仔豬CD8+T淋巴細(xì)胞的發(fā)育增長稍遲于母仔豬。

圖3 仔豬外周血CD4+ 淋巴細(xì)胞統(tǒng)計Fig.3 CD4+ lymphocyte percentage in peripheral blood of piglets

圖4 仔豬外周血CD8+ 淋巴細(xì)胞統(tǒng)計Fig.4 CD8+ lymphocyte percentage in peripheral blood of piglets

2.4 斷奶仔豬外周血CD3+CD4+、CD3+CD8+、CD4+CD8+T淋巴細(xì)胞統(tǒng)計及CD4+/CD8+比值統(tǒng)計

通過分析表1中的數(shù)據(jù)可知，仔豬在斷奶第1周CD3+CD4+T淋巴細(xì)胞會出現(xiàn)顯著下降，公母仔豬CD3+CD4+T淋巴細(xì)胞亞群的比例分別由(6.03±1.41)%、(5.92±1.56)%降低至(2.22±0.24)%、(3.42±0.85)%，且這種減少的趨勢在外周血單個核細(xì)胞及CD3+T淋巴細(xì)胞亞群中是一致的。在外周血單個核細(xì)胞群中，公仔豬CD3+CD4+T淋巴細(xì)胞下降的比例高于母仔豬，但在CD3+T淋巴細(xì)胞亞群中公仔豬CD3+CD4+T淋巴細(xì)胞亞群所占的比例高于母仔豬。21 d時公母仔豬CD3+CD4+T淋巴細(xì)胞所占比例有所回升，不同的細(xì)胞圈定方法，會準(zhǔn)確地體現(xiàn)出其數(shù)量及比例的變化。在母仔豬外周血淋巴細(xì)胞中CD3+CD4+T淋巴細(xì)胞亞群比例高于公仔豬，但在CD3+T淋巴細(xì)胞亞群中則相反。

通過分析表2中的數(shù)據(jù)，隨著仔豬斷奶時間的增加，外周血中仔豬CD3+CD8+T淋巴細(xì)胞數(shù)量逐漸增加，公母斷奶仔豬CD3+CD8+T淋巴細(xì)胞亞群占外周血單個核細(xì)胞中的比例由斷奶開始時的(4.33±1.57)%、(5.02±1.55)%上升到斷奶35 d時的(9.59±2.06)%、(16.54±2.30)%。其占總外周淋巴細(xì)胞的比例逐漸增加，但其占CD3+T淋巴細(xì)胞的比例在21 d時會有顯著的下降，可能是由于CD3+T淋巴細(xì)胞亞群中其他亞群細(xì)胞的增長速率快于CD3+CD8+T淋巴細(xì)胞。在外周血淋巴細(xì)胞中，公母仔豬從斷奶開始時公仔豬CD3+CD8+T淋巴細(xì)胞亞群的含量持續(xù)低于母仔豬。

表1 仔豬外周血CD3+CD4+T淋巴細(xì)胞比例的統(tǒng)計

Table 1 Statistical results of CD3+ CD4+ T lymphocytes percentage in peripheral blood of piglets %

同一細(xì)胞圈定方法中無相同字母的數(shù)據(jù)間差異顯著(P<0.05)。
The values without the same letters in the same cell delineation method indicate significant difference atP<0.05 statistical level. The same as below.

表2 仔豬外周血CD3+CD8+T淋巴細(xì)胞比例的統(tǒng)計

Table 2 Statistical results of CD3+ CD8+ T lymphocyte percentage in peripheral blood of piglets %

分析表3中的數(shù)據(jù)可知，公母仔豬外周血中CD4+CD8+T淋巴細(xì)胞隨著日齡的增加，CD4+CD8+T淋巴細(xì)胞所占的比例逐漸增加，其主要在第21～35天大量升高，分別由(8.55±1.19)%、(7.75±2.41)%上升至(14.44±3.82)%、(14.10±3.12)%。但在CD3+T淋巴細(xì)胞亞群中CD4+CD8+T淋巴細(xì)胞亞群的比例變化則有所不同，仔豬在斷奶第7天的CD4+CD8+T淋巴細(xì)胞比例較其他日齡顯著下降，差異明顯。說明可能是在第7天時CD4+CD8+T淋巴細(xì)胞增長的速率明顯低于其他T淋巴細(xì)胞亞群。

通過分析表4中的數(shù)據(jù)可知，公母仔豬在斷奶初期CD4+/CD8+比值會出現(xiàn)顯著性的下降，分別從斷奶開始時的(1.33±0.23)%、(1.00±0.26)%，下降至斷奶7 d時的(0.39±0.25)%、(0.35±0.22)%，這種下降趨勢在CD3+T淋巴細(xì)胞亞群中是一致的。至斷奶21 d時，CD4+/CD8+會出現(xiàn)顯著性升高，且公仔豬上升的幅度較母仔豬高，至斷奶35 d時公母仔豬比值差異不顯著，此時CD4+/CD8+比值約為0.9。在斷奶初期時CD4+/CD8+有較高的比值，可能是由于在斷奶前注射疫苗引起的仔豬免疫細(xì)胞CD3+CD4+淋巴細(xì)胞的增加，因而比值較大，后期隨著斷奶時間的延長，且由于斷奶應(yīng)激導(dǎo)致CD3+CD4+T淋巴細(xì)胞減少。因此，CD4+CD8+比值下降。

表3 仔豬外周血CD4+CD8+T淋巴細(xì)胞比例的統(tǒng)計

Table 3 Statistical results of CD4+ CD8+ T lymphocytes percentage in peripheral blood of piglets %

表4 仔豬外周血CD4+/CD8+值的統(tǒng)計

Table 4 CD4+ /CD8+ values of peripheral blood in piglets %

2.5 斷奶仔豬外周血CD4-CD8-細(xì)胞占比例

由表5可知，仔豬在斷奶開始時有著較高比例的CD4-CD8-T淋巴細(xì)胞，隨著斷奶天數(shù)的增加，至斷奶21 d時逐漸下降，隨后逐漸回升，但仍然低于開始斷奶時的比例。隨著斷奶仔豬CD3+淋巴細(xì)胞亞群的增加，可推測斷奶仔豬CD4-CD8-淋巴細(xì)胞在斷奶開始至斷奶35 d之間其比例變化不大。

表5 仔豬CD3+T淋巴細(xì)胞亞群CD4-CD8-T淋巴細(xì)胞的比例

Table 5 The proportion of CD4-CD8-T lymphocyte subsets of CD3+T lymphocyte subsets in piglets unit

斷奶后時間Timeafterweaning/d仔豬CD3+T淋巴細(xì)胞亞群CD4-CD8-T比例CD4-CD8-TlymphocyteproportioninCD3+Tlymphocytesubsets/%母Female公Male113.04±3.22a14.44±3.51a710.64±5.91c12.26±5.81b216.76±3.19e9.10±7.82d3510.68±9.02c11.66±8.73b

3 討論

3.1 不同日齡公母斷奶仔豬外周血T淋巴細(xì)胞亞群數(shù)量

本試驗主要是為研究公母仔豬從斷奶開始至斷奶35 d，仔豬外周血主要T淋巴細(xì)胞亞群的比例變化。T淋巴細(xì)胞是機體免疫應(yīng)答中的重要細(xì)胞，在T淋巴細(xì)胞亞群中，CD4+細(xì)胞數(shù)量的減少和功能的低下是仔豬發(fā)病的重要因素[7-8]。由統(tǒng)計數(shù)據(jù)的結(jié)果可知，隨著斷奶天數(shù)的增加，CD4+淋巴細(xì)胞數(shù)量逐漸增加，但在斷奶后前7 d，仔豬CD4+淋巴細(xì)胞持續(xù)維持在較低的水平，且CD4+淋巴細(xì)胞包含有CD3+CD4+T淋巴細(xì)胞以及其他CD4+淋巴細(xì)胞，本試驗結(jié)果發(fā)現(xiàn)，CD3+CD4+T淋巴細(xì)胞在斷奶7 d時會出現(xiàn)顯著性下降，此時仔豬容易受到外部病原菌的感染，需要加強日常管理。同時，在CD3+T淋巴細(xì)胞亞群中，CD3+CD4+T淋巴細(xì)胞所占比例的變化與外周血淋巴細(xì)胞中其所占的比例變化趨勢一致，以上結(jié)果說明了在斷奶初期由于應(yīng)激及其他原因仔豬CD3+CD4+T淋巴細(xì)胞亞群比例出現(xiàn)顯著下降。因此，CD4+淋巴細(xì)胞的上升可能是由于其他表達(dá)CD4分子的淋巴細(xì)胞增長所造成的。

CD3+CD8+細(xì)胞主要是殺傷性細(xì)胞，含有細(xì)胞溶解酶，用來破壞被感染或受應(yīng)激的靶細(xì)胞；靶細(xì)胞的識別一定程度上是受到刺激，如應(yīng)激和感染，細(xì)胞表面表達(dá)的非典型MHC分子識別完成的[9]。在對CD8+淋巴細(xì)胞亞群數(shù)據(jù)分析時，發(fā)現(xiàn)在仔豬斷奶7 d后外周血CD8+淋巴細(xì)胞的比例會出現(xiàn)顯著性下降，至斷奶21 d時CD8+淋巴細(xì)胞比例較之第7天又會顯著上升。仔豬在出生及斷奶后逐漸接觸到外界環(huán)境，受到外界環(huán)境中各種細(xì)菌等微生物的影響其CD3+CD8+T淋巴細(xì)胞逐漸上升，并且需要維持在一定的比例水平[8]。分析CD3+CD8+T淋巴細(xì)胞亞群比例時發(fā)現(xiàn)，隨著斷奶時間的延長呈增長趨勢，同時期公母仔豬CD3+CD8+T淋巴細(xì)胞比例差異顯著，公仔豬低于母仔豬，說明在仔豬發(fā)育的過程中，母仔豬CD3+CD8+T淋巴細(xì)胞的發(fā)育先于公仔豬。在斷奶仔豬的飼養(yǎng)過程中，需要特別注意防范公仔豬感染某些病毒病。

T淋巴細(xì)胞亞群除CD3+CD4+、CD3+CD8+兩大類，還有CD4+CD8+及CD4-CD8-兩類細(xì)胞亞群。通過分析可知，仔豬在斷奶初期，有著較高比例的CD4-CD8-T淋巴細(xì)胞。隨著斷奶時間的增加，比例有所降低。但結(jié)合CD3+T淋巴細(xì)胞數(shù)量增加的趨勢，可推測CD4-CD8-T淋巴細(xì)胞占所有外周血單個核細(xì)胞中的比例變化不大。同時，CD4+CD8+占所有外周血單個核細(xì)胞的比例也逐漸上升，此類細(xì)胞多為記憶性細(xì)胞/效應(yīng)細(xì)胞[10-11]，因此這類細(xì)胞對于動物機體抵抗外部病原的再次入侵具有重要作用。在斷奶仔豬CD3+T淋巴細(xì)胞亞群中CD4+CD8+T淋巴細(xì)胞占有很大的一部分，隨著斷奶時間的延長，仔豬CD4+CD8+淋巴細(xì)胞在外周血淋巴細(xì)胞中所占的比例逐漸增大，這與豬的CD4+CD8+T細(xì)胞隨著日齡增加而大量增加的結(jié)果[12]相一致。CD4+CD8+細(xì)胞能夠產(chǎn)生IL-10，而IL-10可以激活B細(xì)胞，使其生長和分化，并參與抗體的產(chǎn)生，另外豬CD4+CD8+細(xì)胞亞群能產(chǎn)生高水平的IFN-γ[13-14]，因此對于此類細(xì)胞還有待更多的研究。

3.2 仔豬外周血CD4+/CD8+比值分析

在T淋巴細(xì)胞亞群中，CD3+CD4+細(xì)胞數(shù)量和功能的低下是仔豬發(fā)病的重要因素，CD3+CD4+是CD3+CD8+功能發(fā)揮的必需輔助因子，CD3+CD4+與CD3+CD8+合適的比例是維持機體健康的重要因素，其中CD3+CD4+/CD3+CD8+比值的減少是免疫缺陷的重要指征[15]。本試驗中通過分析所得結(jié)果可知，在仔豬斷奶第7天時，CD4+/CD8+比值低于剛開始斷奶時的比值，說明此時斷奶仔豬由于斷奶應(yīng)激導(dǎo)致其免疫細(xì)胞數(shù)量及比例的變化。在人醫(yī)臨床中，當(dāng)CD4+/CD8+比值降至1.5以下時就標(biāo)志著進(jìn)入亞健康狀態(tài)，并可能成為免疫抑制的重要原因和標(biāo)志[16-18]，豬外周血淋巴細(xì)胞亞群的組成和比例與其他動物比較有其特殊性。研究表明，豬外周血淋巴細(xì)胞亞群中CD8+細(xì)胞比例大于CD4+細(xì)胞，因此CD4+/CD8+比值也小于人類相應(yīng)的比值[15]。在仔豬斷奶初期CD4+/CD8+大于1，可能是因為仔豬還未斷奶時的免疫程序致使其CD3+CD4+比例高于CD3+CD8+的比例。因此在評價動物的健康狀態(tài)時僅僅用CD3+CD4+/CD3+CD8+的比值是有局限性的，因此用CD3+CD4+和CD3+CD8+的絕對量及CD4+/CD8+比值作為依據(jù)才更加合理。

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(責(zé)任編輯 盧福莊)

Analysis of T lymphocytes in peripheral blood of piglets in different growth stages

ZOU Lu1，2， ZHANG Jingyan2， ZHANG Kai2， WANG Lei2，ZHANG Kang2， WANG Xurong2， WANG Xuezhi2， YU Sijiu1， YANG Zhiqiang2，*， LI Jianxi2，*

(1.CollegeofVeterinaryMedicine，GansuAgriculturalUniversity，Lanzhou730050，China; 2.Engineering&TechnologyResearchCenterofTraditionalChineseVeterinaryMedicineofGansuProvince，LanzhouInstituteofHusbandryandPharmaceuticalScienceofCAAS，Lanzhou730050，China)

To establish healthy piglets of peripheral blood lymphocyte subsets in clinical reference range， and analyze the level of immune system in different growth stages of piglets， the blood samples were collected on the 1st day， 7th day， 21st day and 35th day after weaning， respectively， and the mononuclear cells were isolated from the peripheral blood. Three color flow cytometry was used to detect the proportion of primary kinds of T lymphocyte subsets in peripheral blood mononuclear cells and in CD3+T lymphocyte subsets， then the ratio of CD4+/CD8+was calculated. The proportion of CD3+T lymphocyte subsets for peripheral blood mononuclear cells in male and female piglets were gradually increased from (38.00±10.94)% to (55.43±12.30)% and from (38.17±15.39)% to (51.57±10.60)% ， respectively with the increase of age. On the 1st day and 7th day after weaning， the CD3+T lymphocyte ratio had no significant difference between male and female piglets (P>0.05). On the 21st day after weaning， the CD3+T lymphocyte ratio showed significant increase in male piglets(P<0.05). On the 35th day， the percentage of CD3+T cells showed a significant increase (P<0.05). With the increase of age， the proportion of CD4+T lymphocyte subsets in peripheral blood mononuclear cells of male and female piglets increased from (10.29±2.71)% to( 22.2±5.87)% and from (10.3±2.17)% to (23.4±6.84)%， respectively. The proportions of CD4+T lymphocytes in male and female piglets were gradually increasing， and there was no significant difference between male and female piglets at different time points(P>0.05). The proportions of CD8+T lymphocytes in peripheral blood mononuclear cells at the four time points were(23.80±6.67)%， (17.14±10.64)%， (25.46±12.32)%， (33.33±8.93)% in male piglets and (28.55±6.75)%， (23.62±11.51)%， (37.37±13.18)%， (38.31±15.66)% in female piglets. With the increase of age， the CD8+T lymphocytes showed a trend of firstly decrease and then increase. The distribution of lymphocyte subsets in weaned piglets showed different changes with the increase of weaning time， and was influenced by gender. The combination of two different cell delineation methods could reflect more accurate changes of the number and proportion of lymphocyte subsets in piglets.

piglets; T lymphocyte subsets; flow cytometry; cell delineation

10.3969/j.issn.1004-1524.2017.08.05

2016-12-30

公益性行業(yè)專項(201303040-15)；國家自然科學(xué)基金面上項目(31472233)；甘肅省科技支撐計劃(1604NKCA069-03)

鄒璐(1990—)，男，河南潢川人，碩士研究生，主要從事中獸藥的研究。E-mail: 1406832500@qq.com

*通信作者，楊志強， E-mail: zqycaas@126.com；李建喜，E-mail: lijianxigs@126.com

S811.2

A

1004-1524(2017)08-1253-08

鄒璐，張景艷，張凱，等. 不同日齡仔豬外周血T淋巴細(xì)胞的檢測與分析[J].浙江農(nóng)業(yè)學(xué)報，2017，29(8): 1253-1260.