蘋果白蘭地釀造中釀酒酵母與異常漢遜酵母的相互作用

曾朝珍，康三江，李明澤，張霽紅，張海燕，張 芳

(甘肅省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)產(chǎn)品貯藏加工所，甘肅蘭州730070)

蘋果白蘭地釀造中釀酒酵母與異常漢遜酵母的相互作用

曾朝珍，康三江，李明澤，張霽紅，張海燕，張 芳

(甘肅省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)產(chǎn)品貯藏加工所，甘肅蘭州730070)

通過構(gòu)建釀酒酵母與異常漢遜酵母在富士蘋果汁中的共培養(yǎng)發(fā)酵體系，采用兩種酵母混合接種和順序接種的發(fā)酵方式，比較不同培養(yǎng)體系中的生物量和發(fā)酵力的變化，分析兩種酵母之間的相互作用。結(jié)果表明，共培養(yǎng)發(fā)酵體系中，異常漢遜酵母的生長受到了釀酒酵母生長的抑制，釀酒酵母的接種方式對(duì)共培養(yǎng)體系發(fā)酵力的影響大于異常漢遜酵母。

蘋果白蘭地； 釀酒酵母； 異常漢遜酵母； 混菌發(fā)酵； 相互作用

傳統(tǒng)食品發(fā)酵中大都具有多種微生物共同參與發(fā)酵的特征，微生物間的相互作用對(duì)食品的質(zhì)量起著至關(guān)重要的作用[1]。非釀酒酵母曾被認(rèn)為是果酒釀造過程中的腐敗酵母，對(duì)酒的品質(zhì)起到不利的作用[2]，但是隨著對(duì)果酒釀造研究的深入，非釀酒酵母對(duì)果酒品質(zhì)至關(guān)重要的作用已得到肯定[3]。蘋果白蘭地是以蘋果汁為原料經(jīng)釀酒酵母發(fā)酵并蒸餾后得到的一種新型水果類白酒[4]，單一菌種發(fā)酵對(duì)蘋果白蘭地酒的品質(zhì)雖有一定程度的保證，卻降低了蘋果白蘭地酒產(chǎn)品的獨(dú)特性和風(fēng)味的多樣性。多種酵母在發(fā)酵過程中的相互協(xié)作，可以有效增加蘋果白蘭地酒風(fēng)味的多樣性，但也可能影響蘋果白蘭地酒質(zhì)量的穩(wěn)定性[5-7]?；炀l(fā)酵中微生物之間的相互作用最終導(dǎo)致在發(fā)酵不同階段酵母菌特定的生長規(guī)律，通過鑒別培養(yǎng)基了解這種動(dòng)態(tài)的變化規(guī)律有利于蘋果白蘭地酒自然發(fā)酵過程中的微生物學(xué)控制，也可以為后續(xù)發(fā)酵風(fēng)味的調(diào)節(jié)提供依據(jù)。本文研究異常漢遜酵母與釀酒酵母間的相互作用特征，不僅可為蘋果白蘭地的釀造工藝提供理論基礎(chǔ)，而且對(duì)實(shí)現(xiàn)蘋果白蘭地液態(tài)發(fā)酵的穩(wěn)定性和可操控性打下堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

菌種：釀酒酵母32168和異常漢遜酵母31399，由中國工業(yè)微生物菌種保藏管理中心(CICC)提供。

培養(yǎng)基：種子培養(yǎng)基為麥芽汁培養(yǎng)基；發(fā)酵培養(yǎng)基為富士蘋果汁。

試劑：蛋白胨、酵母浸粉、生化試劑，北京奧博星生物技術(shù)有限責(zé)任公司；葡萄糖、分析純，天津凱通化學(xué)試劑有限公司。

儀器設(shè)備：2WY-2102型恒溫培養(yǎng)箱、ZHJHC11128型超凈工作臺(tái)，上海智城分析儀器制造有限公司；TD50002型電子天平，余姚市金諾天平儀器有限公司；B204LED型生物顯微鏡，重慶奧特光學(xué)儀器有限公司；YXQ-LS-75G型立式壓力蒸汽滅菌鍋，上海博迅實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠；Breville-BJE500F型榨汁機(jī)，澳大利亞鉑富公司。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 釀酒酵母與異常漢遜酵母的相互作用研究

（1）釀酒酵母與異常漢遜酵母的純培養(yǎng)及共培養(yǎng)體系中生長特征的測定。在蘋果汁發(fā)酵培養(yǎng)基中分別接入異常漢遜酵母和釀酒酵母及混合接入發(fā)酵培養(yǎng)基中，接種濃度均為1×106cfu/mL，在25℃下厭氧靜置發(fā)酵直至發(fā)酵結(jié)束。

（2）不同接種比例對(duì)釀酒酵母與異常漢遜酵母相互作用的影響。在蘋果汁發(fā)酵培養(yǎng)基中接入異常漢遜酵母和釀酒酵母，異常漢遜酵母接種濃度為1×106cfu/mL，釀酒酵母接種濃度分別為1×104cfu/mL、1×105cfu/mL、1×106cfu/mL，即釀酒酵母與異常漢遜酵母分別以1∶1、1∶10、1∶100的比例，在25 ℃下厭氧靜置發(fā)酵直至發(fā)酵結(jié)束。

（3）接種方式對(duì)釀酒酵母與異常漢遜酵母相互作用的影響。①將異常漢遜酵母與釀酒酵母分別以1×106cfu/mL、1×105cfu/mL同時(shí)接入蘋果汁發(fā)酵培養(yǎng)基中進(jìn)行混合發(fā)酵（同時(shí)接種），作為對(duì)照；②先接入濃度為1×106cfu/mL的異常漢遜酵母培養(yǎng)2 d，以達(dá)到其旺盛生長期，后接入濃度為1×105cfu/mL的釀酒酵母進(jìn)行混合發(fā)酵（順序接種Ⅰ）；③先接入濃度為1×105cfu/mL的釀酒酵母培養(yǎng)1 d，以達(dá)到其旺盛生長期，后接入濃度為濃度為1×106cfu/mL的異常漢遜酵母進(jìn)行混合發(fā)酵（順序接種Ⅱ）。

（4）接種量對(duì)釀酒酵母與異常漢遜酵母相互作用的影響。在不同培養(yǎng)方式條件下，將釀酒酵母與異常漢遜酵母以6%、7%、8%的不同接種量接入到蘋果汁發(fā)酵培養(yǎng)基中進(jìn)行酒精發(fā)酵，在25℃下厭氧靜置發(fā)酵直至發(fā)酵結(jié)束。

1.2.2 分析方法

酵母菌落總數(shù)的測定：參照GB 4789.2—2010[8]菌落總數(shù)計(jì)數(shù)方法，直接采用稀釋涂布YPD平板測定發(fā)酵過程中兩種酵母的數(shù)量變化。

酵母發(fā)酵力的測定[9]：采用失重法，以二氧化碳揮發(fā)產(chǎn)生的失重來衡量酵母發(fā)酵力的大小，每隔24 h稱重1次，直至發(fā)酵結(jié)束。

2 結(jié)果與分析

釀酒酵母與異常漢遜酵母的相互作用研究。

2.1 釀酒酵母與異常漢遜酵母的純培養(yǎng)及共培養(yǎng)體系中生長特征的測定

在蘋果汁發(fā)酵培養(yǎng)基中等量（接種量6%，接種比例1∶1）接種異常漢遜酵母和釀酒酵母，并以各自的純培養(yǎng)為對(duì)照，在25℃條件下發(fā)酵7 d后，測定純培養(yǎng)及共培養(yǎng)體系中不同酵母的生物量及二氧化碳失重量，結(jié)果見圖1、圖2、圖3。

圖1 純培養(yǎng)及共培養(yǎng)體系中異常漢遜酵母細(xì)胞總數(shù)的變化

圖2 純培養(yǎng)及共培養(yǎng)體系中釀酒酵母細(xì)胞總數(shù)的變化

圖3 純培養(yǎng)及共培養(yǎng)體系中酵母發(fā)酵力的變化

純培養(yǎng)及共培養(yǎng)發(fā)酵過程中兩種酵母細(xì)胞數(shù)量的動(dòng)態(tài)變化過程見圖1、圖2。由于共培養(yǎng)發(fā)酵時(shí)兩種酵母競爭利用碳源[10]，釀酒酵母優(yōu)先利用葡萄糖而迅速增殖，異常漢遜酵母營養(yǎng)不足導(dǎo)致其生長緩慢,故共培養(yǎng)發(fā)酵時(shí)釀酒酵母數(shù)量較高；當(dāng)異常漢遜酵母單獨(dú)培養(yǎng)時(shí),由于沒有生長所需營養(yǎng)物質(zhì)的競爭壓力，異常漢遜酵母能夠較好的繁殖并獲得較高的細(xì)胞水平；此外，當(dāng)異常漢遜酵母和釀酒酵母在共培養(yǎng)體系中發(fā)酵時(shí)，由于營養(yǎng)物質(zhì)和生存空間的限制，各自的最大生物細(xì)胞總量都低于單菌種純培養(yǎng)的水平。

當(dāng)釀酒酵母與非釀酒酵母混合發(fā)酵時(shí)，非釀酒酵母會(huì)抑制釀酒酵母的發(fā)酵性能。圖3結(jié)果表明，釀酒酵母單菌種發(fā)酵整個(gè)系統(tǒng)的發(fā)酵力最強(qiáng)，而共培養(yǎng)發(fā)酵整個(gè)系統(tǒng)的發(fā)酵力與釀酒酵母單菌種培養(yǎng)相近但相對(duì)略低，異常漢遜酵母單菌種培養(yǎng)發(fā)酵性能相對(duì)最差。

2.2 不同接種比例對(duì)共培養(yǎng)體系中異常漢遜酵母生長及發(fā)酵力的影響

由于等比例接種時(shí)，釀酒酵母表現(xiàn)出對(duì)異常漢遜酵母較強(qiáng)的抑制作用。因此，通過降低釀酒酵母的接種量來研究不同接種比例條件下釀酒酵母對(duì)異常漢遜酵母生長的作用及酵母發(fā)酵力的影響。結(jié)果見圖4、圖5（注：對(duì)照是指異常漢遜酵母的純培養(yǎng)；接種比例為異常漢遜酵母與釀酒酵母的接種濃度之比）。

圖4 不同接種比例對(duì)共培養(yǎng)體系中異常漢遜酵母生長量變化的影響

圖5 不同接種比例對(duì)共培養(yǎng)體系中酵母發(fā)酵力變化的影響

由于釀酒酵母對(duì)異常漢遜酵母的抑制作用，因此，降低釀酒酵母的接種濃度，研究了不同接種比例對(duì)共培養(yǎng)體系中酵母生物量及發(fā)酵力的影響。由圖4可知，即使將釀酒酵母的接種量降低100倍，共培養(yǎng)體系中異常漢遜酵母的生長仍會(huì)受到很強(qiáng)的抑制作用。導(dǎo)致這一現(xiàn)象的原因可能是由于酵母的快速增殖而導(dǎo)致發(fā)酵環(huán)境呈酸性[11]，從而導(dǎo)致異常漢遜酵母生長受抑制。圖5結(jié)果表明，隨著釀酒酵母的接種量降低倍數(shù)增加，共培養(yǎng)發(fā)酵整個(gè)系統(tǒng)的發(fā)酵力也隨之降低，但都強(qiáng)于異常漢遜酵母單菌種培養(yǎng)的發(fā)酵力，說明釀酒酵母對(duì)共培養(yǎng)發(fā)酵整個(gè)系統(tǒng)的發(fā)酵力影響大于異常漢遜酵母。

2.3 不同接種方式對(duì)共培養(yǎng)體系中酵母菌生物量變化及發(fā)酵力的影響

當(dāng)非釀酒酵母與釀酒酵母混合發(fā)酵時(shí)，因?yàn)槠洳荒途凭皩?duì)營養(yǎng)物質(zhì)的低競爭力等原因，其生物細(xì)胞會(huì)在接種的3～4 d后出現(xiàn)大量衰亡，而其過早衰亡對(duì)蘋果白蘭地香氣形成的貢獻(xiàn)就很有限。因此，本試驗(yàn)為了延長非釀酒屬酵母的生長時(shí)間，在接種順序上進(jìn)行了對(duì)比試驗(yàn)，研究了不同接種方式對(duì)共培養(yǎng)體系中酵母菌生物量變化及發(fā)酵力的影響，結(jié)果見圖6、圖7。

圖6 不同接種方式對(duì)共培養(yǎng)體系中酵母生長量變化的影響

由圖6結(jié)果可以看出，同時(shí)接種與順序培養(yǎng)Ⅱ體系中的異常漢遜酵母與釀酒酵母的生長規(guī)律相近，兩個(gè)培養(yǎng)體系中釀酒酵母的生物細(xì)胞量都在發(fā)酵前兩天迅速增殖，而異常漢遜酵母都呈現(xiàn)生物細(xì)胞量下降的趨勢，說明在釀酒酵母強(qiáng)發(fā)酵力的體系中，非酵母屬酵母的生長確實(shí)受到抑制；而先接種異常漢遜酵母的順序培養(yǎng)Ⅰ體系中，異常漢遜酵母能在發(fā)酵前期迅速增殖，之后隨著發(fā)酵進(jìn)行及釀酒酵母的接入，異常漢遜酵母生物細(xì)胞量開始下降。這可能與混合發(fā)酵體系中營養(yǎng)物質(zhì)的競爭效應(yīng)、有毒物質(zhì)的形成濃度[12-14]以及細(xì)胞的群體感應(yīng)[15]等因素有關(guān)，這從生物量的角度說明混合培養(yǎng)發(fā)酵時(shí)以非酵母屬酵母先接種、培養(yǎng)一段時(shí)間后再接入發(fā)酵力強(qiáng)的釀酒酵母的方式是非常必要的。而圖7結(jié)果表明，順序培養(yǎng)Ⅰ體系的發(fā)酵力明顯弱于同時(shí)培養(yǎng)與順序培養(yǎng)Ⅱ體系的發(fā)酵力，說明釀酒酵母的接種方式對(duì)共培養(yǎng)體系的發(fā)酵力影響大于異常漢遜酵母。

圖7 不同接種方式對(duì)共培養(yǎng)體系中酵母發(fā)酵力變化的影響

2.4 釀酒酵母接種量對(duì)發(fā)酵過程中異常漢遜酵母生長及發(fā)酵力的影響

2.4.1 同時(shí)培養(yǎng)方式下釀酒酵母接種量對(duì)異常漢遜酵母生長及發(fā)酵力的影響

本研究就釀酒酵母初始接種量對(duì)發(fā)酵過程中異常漢遜酵母生長及發(fā)酵力的影響開展試驗(yàn)，采用逐漸提高釀酒酵母接種量的方式，在同時(shí)培養(yǎng)條件下研究非釀酒酵母與釀酒酵母在3種初始接種量下它們的相互作用。結(jié)果見圖8、圖9。

由圖8結(jié)果可以看出，3種釀酒酵母接種量方式的發(fā)酵體系中，盡管異常漢遜酵母的接種量也在隨著增加，但是異常漢遜酵母生物細(xì)胞量卻隨著釀酒酵母接種量的增加而降低，說明和純培養(yǎng)相比較，共培養(yǎng)體系中異常漢遜酵母的生長同樣受到釀酒酵母的抑制；而圖9結(jié)果表明，共培養(yǎng)體系的發(fā)酵力隨著釀酒酵母接種量的增加而增加；純培養(yǎng)體系的發(fā)酵力隨著異常漢遜酵母接種量的增加而增加，但整體發(fā)酵能力低于對(duì)應(yīng)的共培養(yǎng)體系。

2.4.2 順序培養(yǎng)方式下釀酒酵母接種量對(duì)異常漢遜酵母生長及發(fā)酵力的影響

圖8 同時(shí)培養(yǎng)體系中不同接種量對(duì)異常漢遜酵母生長量變化的影響

圖9 同時(shí)培養(yǎng)體系中不同接種量對(duì)酵母發(fā)酵力變化的影響

本研究在順序培養(yǎng)方式下，采用逐漸提高釀酒酵母的接種量的方式，研究非釀酒酵母與釀酒酵母在3種初始接種量下的相互作用。結(jié)果見圖10、圖11。

圖10、圖11結(jié)果表明，順序培養(yǎng)方式下異常漢遜酵母生長及酵母發(fā)酵力的變化規(guī)律與同時(shí)培養(yǎng)方式下的相似，但就生物細(xì)胞量及發(fā)酵力而言，順序培養(yǎng)方式下的異常漢遜酵母的生物細(xì)胞量與對(duì)應(yīng)的發(fā)酵力大小都高于同時(shí)培養(yǎng)方式下相對(duì)應(yīng)的量。

3 結(jié)論

圖10 順序培養(yǎng)體系中不同接種量對(duì)異常漢遜酵母生長量變化的影響

圖11 順序培養(yǎng)體系中不同接種量對(duì)酵母發(fā)酵力的影響

3.1 共培養(yǎng)發(fā)酵體系中，異常漢遜酵母的生長受到了釀酒酵母生長的抑制，其最大細(xì)胞生物總量顯著低于單菌種純培養(yǎng)的水平，而異常漢遜酵母對(duì)釀酒酵母的生物量及發(fā)酵力的影響不明顯。

3.2 共培養(yǎng)發(fā)酵時(shí)以異常漢遜酵母先接種、培養(yǎng)一段時(shí)間后再接入發(fā)酵力強(qiáng)的釀酒酵母的方式是非常必要的，但對(duì)于發(fā)酵力而言，釀酒酵母的接種方式對(duì)共培養(yǎng)體系發(fā)酵力的影響大于異常漢遜酵母。

3.3 本研究只是針對(duì)釀酒酵母與異常漢遜酵母相互作用特征方面做了研究，而從分子水平對(duì)釀酒酵母與異常漢遜酵母間相互作用機(jī)制的相關(guān)研究還需進(jìn)一步開展。

參考文獻(xiàn)：

[1] VILJOEN B C.The interaction between yeasts and bacteria in dairy environments[J].Int j food microbiol,2001,69(1)：37-44.

[2]DOMIZIO P,ROMANI C,COMITINI F,et al.Potential spoilage non-Saccharomyces yeasts in mixed cultures with Saccharomyces cerevisiae[J].Ann microbiol,2011,61(1)：137-144.

[3] Andorrà I,Berradre M,Rozès N,et al.Effect of pure and mixed cultures of the main wine yeast species on grape must fermentations[J].Eur Food Res Technol,2010,231(2)：215-224.

[4] 黃潔,宋紀(jì)蓉,張建剛.蘋果白蘭地生產(chǎn)工藝的研究[J].西北大學(xué)學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版),2001,31(2)：131-134.

[5]RODRíGUEZ M E,LOPES C A,BARBAGELATA R J,et al.Influence of Candida pulcherrima Patagonian strain on alcoholic fermentation behaviour and wine aroma[J].Int j food microbiol,2010,138(1/2)：19-25.

[6]COMITINI F,GOBBI M,DOMIZIO P,et al.Selected non-Saccharomyces wine yeasts in controlled multistarter fermentations with Saccharomyces cerevisiae[J].Food microbiol,2011,28(5)：873-882.

[7]CIANI M,COMITINI F,MANAUS I,et al.Controlled mixed culture fermentation:a new perspective on the use of non-Saccharomyces yeasts in winemaking[J].FEMS Yeast res,2010,10(2)：123-133.

[8] 中華人民共和國衛(wèi)生部.食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)食品微生物學(xué)檢驗(yàn)菌落總數(shù)測定標(biāo)準(zhǔn)：GB 4789.2—2010[S].北京：中國標(biāo)準(zhǔn)出版社,2010.

[9] 唐潔,王海燕,徐巖.釀酒酵母和異常畢赤酵母混菌發(fā)酵對(duì)白酒液態(tài)發(fā)酵效率和風(fēng)味物質(zhì)的影響[J].微生物學(xué)通報(bào),2012,39(7)：921-930.

[10]ANDORRà I,BERRADRE M,MAS A,et al.Effect of mixed culture fermentations on yeast populations and aroma profile[J].LWT-Food sci technol,2012,49(1)：8-13.

[11] 凌杰.白酒釀造中地衣芽孢桿菌與釀酒酵母的相互作用及應(yīng)用研究[D].無錫：江南大學(xué),2013.

[12] FLEET G H.Yeast interactions and wine flavour[J].Intj food microbiol,2003,86(1/2)：11-22.

[13]ALBERGARIA H,FRANCISCO D,GORI K,et al.Saccharomyces cerevisiae CCMI 885 secretes peptides that inhibit the growth of some non-Saccharomyces wine-related strains[J].Appl microbiol biotechnol,2010,86(3)：965-972.

[14]BRANCO P,FRANCISCO D,CHAMBON C,et al.Identification of novel GAPDH-derived antimicrobial peptides secreted by Saccharomyces cerevisiae and involved in wine microbial interactions[J].Appl microbiol biotechnol,2014,98(2)：843-853.

[15]SMID E J,LACROIX C.Microbe–microbe interactions in mixed culture food fermentations[J].Curr opin biotechnol,2013,24(2)：148-154.

Interaction between Saccharomyces cerevisiae and Hansenula anomala during Apple Brandy Fermentation

ZENG Chaozhen,KANG Sanjiang,LI Mingze,ZHANG Jihong,ZHANG Haiyan and ZHANG Fang
(Agricultural Product Storage and Processing Research Institute,Gansu Academy of Agricultural Sciences,Lanzhou,Gansu 730070,China)

The co-culture fermentation systems of Saccharomyces cerevisiae and Hansenula anomala for Fuji apple juice had been constructed.The change in biomass and fermenting power in different systems was compared by using mixed inoculation or sequential inoculation of the two yeast strains.Besides,the interaction between the two yeast strains was analyzed.The results suggested that the growth of Hansenula anomala was inhibited by Saccharomyces cerevisiae in the co-culture system,and the inoculation method of Saccharomyces cerevisiae had greater effects on the fermenting power than that of Hansenula anomala.

apple brandy;Saccharomyces cerevisiae;Hansenula anomala;mixed fermentation;interaction

TS262.38；TS261.1；TS261.4

：A

1001-9286（2017）08-0032-06

10.13746/j.njkj.2017111

現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系建設(shè)專項(xiàng)資金資助（CARS-28）；甘肅省農(nóng)業(yè)生物技術(shù)研究與應(yīng)用開發(fā)項(xiàng)目（GNSW-2016-20）；甘肅省2015年度“隴原青年創(chuàng)新人才扶持計(jì)劃”項(xiàng)目。

2017-04-27

曾朝珍(1981-)，男，助理研究員，碩士，研究方向?yàn)槭称房茖W(xué)。

康三江（1977-），男，研究員，本科，研究方向?yàn)楣哔A藏加工技術(shù)。

優(yōu)先數(shù)字出版時(shí)間：2017-06-23；地址：http://kns.cnki.net/kcms/detail/52.1051.TS.20170623.1517.011.html。