老年宮頸癌組織中人類白細(xì)胞抗原- E蛋白的表達(dá)及與臨床病理特征的關(guān)系

江恩利 譚寒星 冉光偉 方 堃 付俊生

(貴州省人民醫(yī)院婦科，貴州 貴陽(yáng) 550001)

老年宮頸癌組織中人類白細(xì)胞抗原- E蛋白的表達(dá)及與臨床病理特征的關(guān)系

江恩利 譚寒星 冉光偉 方 堃 付俊生

(貴州省人民醫(yī)院婦科，貴州 貴陽(yáng) 550001)

目的 探討人類白細(xì)胞抗原(HLA)- E在老年宮頸癌組織的表達(dá)及與臨床病理的關(guān)系。方法 選取2014年1月至2016年6月國(guó)際婦產(chǎn)科協(xié)會(huì)(FIGO)分期為Ⅰ～Ⅱ期的原發(fā)性老年子宮頸癌組織標(biāo)本92例，其中子宮頸鱗癌60例，宮頸腺癌32例。使用免疫組化方法檢測(cè)標(biāo)本癌組織和癌旁組織中HLA- E的表達(dá)，并用平均光密度值(IOD)表示其在不同組織中的相對(duì)表達(dá)強(qiáng)度。分析HLA- E表達(dá)與臨床病理特征的關(guān)系。結(jié)果 HLA- E在宮頸鱗癌和宮頸腺癌中的表達(dá)明顯高于正常組織(P<0.01)，而宮頸鱗癌和宮頸腺癌中差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。進(jìn)一步分析顯示，宮頸鱗癌組織HLA- E的表達(dá)與FIGO分期及腫瘤直徑有關(guān)系(P<0.05)，宮頸腺癌組織HLA- E的表達(dá)與患者的FIGO分期及浸潤(rùn)深度有關(guān)系(P<0.05)。結(jié)論 HLA- E在老年宮頸癌組織中高度表達(dá)，與患者FIGO分期的進(jìn)展、腫瘤直徑和浸潤(rùn)深度密切相關(guān)，提示可以作為臨床上診斷宮頸癌的標(biāo)志物之一，同時(shí)為臨床上治療提供新的思路。

人類白細(xì)胞抗原- E；宮頸鱗癌；宮頸腺癌

根據(jù)組織病理類型，宮頸癌可分為宮頸鱗癌、宮頸腺癌、宮頸腺鱗癌；其中，宮頸鱗癌發(fā)病率最高，其次是宮頸腺癌和宮頸腺鱗癌〔1，2〕。目前，宮頸腺癌和宮頸腺鱗癌的發(fā)病率并未下降，反而升高〔3〕。在宮頸癌的發(fā)生與發(fā)展過程中，人類白細(xì)胞抗原(HLA)發(fā)揮著重要作用，而HLA- E作為一種非經(jīng)典型主要組織相容性復(fù)合體I類分子(MHC- 1)，與經(jīng)典的HLA- (A,- B,- C)相比，HLA- E具有非多態(tài)性且在正常組織的細(xì)胞膜上很少表達(dá)，而在黑色素瘤、淋巴瘤及神經(jīng)膠質(zhì)瘤等腫瘤細(xì)胞表面則呈高表達(dá)狀態(tài)，通過與細(xì)胞個(gè)體活性及其表面受體(CD94/NKG2A)結(jié)合而抑制自然殺傷(NK)細(xì)胞和細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞(CTLs)的活性，從而使其逃脫免疫系統(tǒng)的攻擊〔4〕。HLA- E在正常宮頸上皮中的表達(dá)較弱，而當(dāng)正常宮頸組織感染病毒、轉(zhuǎn)化為癌前病變(CIN Ⅰ，Ⅱ，Ⅲ級(jí))和宮頸癌的過程中，HLA- E的表達(dá)逐漸增強(qiáng)〔4〕。本實(shí)驗(yàn)研究HLA- E在老年宮頸腺癌和鱗癌組織表達(dá)的差異，并進(jìn)一步分析其與兩者臨床與病理表現(xiàn)之間的關(guān)系。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取2014年1月至2016年6月因?qū)m頸癌于貴州省人民醫(yī)院行全子宮切除或廣泛全子宮切除+盆腔淋巴結(jié)清掃術(shù)的92例老年患者的癌組織和癌旁組織，其中子宮頸鱗癌組織60例，宮頸腺癌組織32例。納入標(biāo)準(zhǔn)：符合國(guó)際婦產(chǎn)科協(xié)會(huì)(FIGO)分期〔5〕為Ⅰ～Ⅱa期的患者；年齡≥60歲；術(shù)前未進(jìn)行過放化療的患者；上述組織標(biāo)本均能查閱到其所對(duì)應(yīng)的患者的病例資料。排除標(biāo)準(zhǔn)：合并患有心、肝、腎以及內(nèi)分泌系統(tǒng)疾病者；合并其他較為嚴(yán)重的婦科疾病者。年齡60～79〔平均(66.14±3.29)〕歲。研究過程均取得患者及其家屬的同意，并符合醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)的相關(guān)規(guī)定。依據(jù)上述組織標(biāo)本所對(duì)應(yīng)的住院號(hào)，查閱相應(yīng)患者相關(guān)的臨床病理資料，包括患者年齡、病理診斷、浸潤(rùn)深度、腫瘤大小、FIGO分期等。

1.2 主要試劑和儀器 一抗鼠抗人HLA- E單克隆抗體由美國(guó)Abcam公司提供，山羊抗鼠二抗試劑盒和檸檬酸緩沖液(pH=6.0)由北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司提供，其他的試驗(yàn)材料由本院藥理實(shí)驗(yàn)室提供。石蠟切片機(jī)和Leica DM4000B顯微鏡由德國(guó)Leica公司提供；烤片機(jī)由湖北諾普電子科技有限責(zé)任公司提供。

1.3 標(biāo)本采集與處理 選取上述研究病例的宮頸組織標(biāo)本，使用中性甲醛和10%酒精固定，常規(guī)脫水，石蠟包埋。將每個(gè)組織標(biāo)本制作6張連續(xù)切片，將上述石蠟切片依次進(jìn)行脫蠟和水化處理后，使用高壓鍋進(jìn)行抗原修復(fù)；檸檬酸鹽緩沖液中冷卻2 h，依次用蒸餾水洗兩遍，磷酸鹽緩沖液(PBS)洗一遍。使用含1%胎牛血清的PBS稀釋的一抗(1∶50)對(duì)切片先在室溫下孵育60 min，后于4℃冰箱繼續(xù)過夜孵育。(鼠抗人HLA- E抗體由EXBIO公司提供，產(chǎn)品克隆號(hào)為MEM- E/02，規(guī)格為0.1 mg)。次日，將上述過夜孵育的切片用PBS洗滌5 min×3次，于室溫下用辣根過氧化物酶標(biāo)記的抗小鼠二抗孵育30 min。使用二氨基聯(lián)苯胺(DAB)進(jìn)行顯色，10 min后使用去離子水沖洗以終止反應(yīng)，再用蘇木素復(fù)染后封片觀察。每組切片制作和觀察過程中均使用PBS緩沖液代替一抗設(shè)立3個(gè)陰性對(duì)照，并將各切片中的血管內(nèi)皮細(xì)胞設(shè)立為陽(yáng)性對(duì)照。

1.4 結(jié)果判定標(biāo)準(zhǔn) 陽(yáng)性反應(yīng)：若陰性對(duì)照無特異性著色，而被檢測(cè)標(biāo)本細(xì)胞膜和細(xì)胞質(zhì)出現(xiàn)棕色顆粒狀物則為HLA- E蛋白表達(dá)陽(yáng)性。使用顯微鏡對(duì)上述切片在隨機(jī)選擇的6個(gè)高倍鏡視野下進(jìn)行觀察并記錄染色結(jié)果，使用軟件Image- Pro Plus 5.0測(cè)定每個(gè)視野下的累積光密度值(IOD)，將每個(gè)切片在6個(gè)視野下測(cè)定的平均IOD值(IOD/area)作為該切片HLA- E蛋白的相對(duì)表達(dá)水平。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS19.0軟件進(jìn)行t檢驗(yàn)。

2 結(jié) 果

2.1 HLA- E表達(dá)水平的比較 免疫組織化學(xué)檢測(cè)結(jié)果顯示，免疫染色主要集中在宮頸腺癌和鱗癌細(xì)胞、淋巴細(xì)胞以及血管內(nèi)皮細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)及細(xì)胞膜中，在細(xì)胞核內(nèi)的表達(dá)則幾乎未見。而正常鱗狀上皮和柱狀上皮染色很淺，間質(zhì)及肌層內(nèi)幾乎未染色。HLA- E在宮頸鱗癌中的表達(dá)主要出現(xiàn)在癌細(xì)胞和血管內(nèi)皮細(xì)胞的胞膜和胞質(zhì)中；HLA- E在宮頸腺癌組織中的表達(dá)同樣主要集中于癌細(xì)胞的胞膜和胞質(zhì)，且表達(dá)強(qiáng)度較鱗癌組織更強(qiáng)；HLA- E在正常宮頸組織中的表達(dá)較弱。宮頸鱗癌、宮頸腺癌、癌旁組織的平均IOD值分別為(0.111±0.012)、(0.115±0.023)和(0.023±0.061)，宮頸鱗癌、宮頸腺癌分別與癌旁組織比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=1.843，6.532，P<0.01)；宮頸鱗癌與宮頸腺癌比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=0.354，P>0.05)。見圖1。

2.2 HLA- E的表達(dá)與患者臨床病理資料的關(guān)系 見表1。

圖1 HLA- E在宮頸鱗癌、腺癌及正常宮頸組織中的表達(dá)(DAB，×200)

病理特征n宮頸鱗癌(n=60)t值P值n宮頸腺癌(n=32)t值P值分化程度中高分化350.121±0.012-1.9810.052180.118±0.026-0.6800.501低分化250.109±0.033140.112±0.023FIGO分期Ⅰ期330.097±0.0216.7010.000170.123±0.033-2.2160.034Ⅱ期270.132±0.019150.102±0.027腫瘤直徑(cm)≥4230.146±0.039-9.8820.000200.114±0.0670.0710.944<4370.079±0.011120.116±0.091浸潤(rùn)深度(mm)≤15310.110±0.0280.3810.705180.120±0.026-2.4960.018>15290.113±0.033140.101±0.013淋巴轉(zhuǎn)移是240.109±0.0190.2520.802120.116±0.052-0.1240.902否360.112±0.056200.114±0.039

頸鱗癌組織HLA- E的表達(dá)與患者的FIGO分期及腫瘤直徑有關(guān)系(P<0.05)，而其他因素之間無顯著差異(P>0.05)；宮頸腺癌組織HLA- E的表達(dá)與患者的FIGO分期及浸潤(rùn)深度有關(guān)系(P<0.05)，而除此之外的其他因素之間無顯著差異(P>0.05)。

3 討 論

宮頸癌威脅全球女性惡性腫瘤患者的生命安全，并且該病全球每年約有52萬新增病例，每年死于該病的人數(shù)約27萬〔5〕。其中，每年約有30%的新發(fā)病例和死亡病例發(fā)生于我國(guó)。與宮頸鱗癌相比，宮頸腺癌和宮頸腺鱗癌的預(yù)后更差，存活率更低，而復(fù)發(fā)率則更高，對(duì)相似的治療方法的療效也不一致〔6〕，因此尋求有效的治療和診斷方案勢(shì)在必行。HLA- E在病毒感染、器官移植、腫瘤的發(fā)生發(fā)展以及自身免疫性疾病中均發(fā)揮著重要的作用〔7〕。首次對(duì)于HLA- E功能較大規(guī)模的研究集中在妊娠過程中母胎交互作用，該研究顯示，HLA- E能在胎盤組織中表達(dá)，并能使母體的免疫系統(tǒng)接納胎兒，否則胎兒將會(huì)被視為異物而被排斥，從而在妊娠過程中發(fā)揮著重大的作用〔8〕。在生理情況下，HLA- E與抑制型受體CD94/NKG2A的親和力較其與激活型受體CD94/NKG2C之間的親和力明顯增加，從而有助于使靶細(xì)胞免除NK細(xì)胞的殺傷作用〔9〕。而HLA- E在非正常組織的細(xì)胞膜表面表達(dá)并被CTLs和NKs識(shí)別后，可引起細(xì)胞活性激活或抑制，至于會(huì)引起何種反應(yīng)，則取決于與之結(jié)合的受體的具體類型〔10〕，比如，與CD94/NKG2A受體結(jié)合會(huì)引起細(xì)胞活性抑制反應(yīng)，而與CD94/NKG2C受體結(jié)合則會(huì)引起細(xì)胞激活反應(yīng)，因此推斷宮頸癌中HLA- E蛋白的表達(dá)與臨床病理特征存在密切聯(lián)系〔11〕。

研究結(jié)果顯示，HLA- E蛋白在宮頸鱗癌和宮頸腺癌組織中高度表達(dá)，明顯高于癌旁正常組織，提示HLA- E蛋白參與了宮頸癌的發(fā)生于發(fā)展階段，HLA- E的作用機(jī)制可能是通過啟動(dòng)CD8+T細(xì)胞下游信號(hào)來抑制相應(yīng)的免疫細(xì)胞的活化，腫瘤細(xì)胞躲避免疫系統(tǒng)的攻擊〔12〕。另外，在對(duì)HLA- E蛋白與臨床病理資料之間的聯(lián)系研究時(shí)發(fā)現(xiàn)，宮頸癌組織中HLA- E的表達(dá)水平隨著患者的FIGO分期的發(fā)展而升高，同時(shí)隨著腫瘤直徑和浸潤(rùn)深度的增加，HLA- E的表達(dá)水平升高，說明HLA- E的表達(dá)水平可以在一定程度上反映宮頸癌患者病情的發(fā)展?fàn)顟B(tài)，用于臨床上監(jiān)測(cè)宮頸癌的標(biāo)志物。推測(cè)HLA- E在不同的臨床參數(shù)之間出現(xiàn)的差異原因可能是不同的HLA- E單克隆抗體，檢測(cè)的敏感性和特異性不同，或者是由于樣本量有限，導(dǎo)致其出現(xiàn)差異，此外，還可能是由于不同類型腫瘤的生物學(xué)行為不同〔13〕。

本研究結(jié)果提示，HLA- E在老年宮頸癌組織中高度表達(dá)，尤其是宮頸腺癌組織中，并且與宮頸癌的FIGO分期、腫瘤直徑和浸潤(rùn)深度之間存在密切聯(lián)系，提示其可以作為臨床上診斷宮頸癌的標(biāo)志物之一。

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〔2017- 04- 09修回〕

(編輯 袁左鳴)

付俊生(1966- )，男，主任醫(yī)師，主要從事婦科腫瘤研究。

江恩利(1980- )，女，碩士，主治醫(yī)師，主要從事婦科腫瘤研究。

R73

A

1005- 9202(2017)15- 3779- 03；

10.3969/j.issn.1005- 9202.2017.15.061