外源性骨形態(tài)發(fā)生蛋白9轉入肺鱗癌細胞對其活性的影響及作用機制

崔 丹

(白城醫(yī)學高等?？茖W校，吉林 白城 137000)

外源性骨形態(tài)發(fā)生蛋白9轉入肺鱗癌細胞對其活性的影響及作用機制

崔 丹

(白城醫(yī)學高等?？茖W校，吉林 白城 137000)

目的 觀察骨形態(tài)發(fā)生蛋白(BMP)9對人肺鱗癌細胞株YTMLC- 90遷移和侵襲能力的影響及其作用機制。方法 RT- PCR和Western印跡法檢測YTMLC- 90細胞和正常人支氣管上皮細胞(NHBE)中BMP9 mRNA和蛋白表達水平；以轉染重組腺病毒Ad- BMP9的YTMLC- 90細胞為研究組，轉染Ad- GFP為陰性對照組，未轉染為空白對照組；采用劃痕愈合實驗檢測3組細胞遷移能力，Transwell實驗檢測遷移和侵襲能力，同時檢測遷移相關因子基質金屬蛋白酶(MMP)2 mRNA和蛋白表達情況；Western印跡法檢測3組細胞BMP- Smad信號通路中Smad 1/5磷酸化水平。結果 YTMLC- 90細胞中BMP9 mRNA和蛋白表達量均明顯低于NHBE細胞(P<0.05)。Ad- BMP9轉染YTMLC- 90細胞后胞內BMP9蛋白表達量明顯高于陰性對照組(P<0.01)?？瞻讓φ战M48 h的細胞劃痕愈合率與陰性對照組比較差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)；研究組細胞劃痕愈合率明顯低于陰性對照組和空白對照組，穿過小室膜和基質膠的YTMLC- 90細胞數(shù)均明顯少于陰性對照組和空白對照組，MMP2表達量明顯低于陰性對照組，MMP2 mRNA和蛋白表達量均明顯低于陰性對照組(均P<0.05)。YTMLC- 90細胞高表達BMP9后其p- Smad 1/5表達量明顯高于陰性對照組和空白對照組(P<0.01)。結論 外源性BMP9轉入人肺鱗癌細胞株YTMLC- 90可有效抑制其遷移和侵襲能力，激活BMP- Smad信號通路是該抑制作用的機制之一。

骨形態(tài)發(fā)性蛋白；肺鱗癌細胞；BMP- Smad通路

肺癌多發(fā)于中老年人，其中非小細胞肺癌(包括肺鱗癌、腺癌)約占肺癌總數(shù)的80%〔1〕。我國近5年肺鱗癌發(fā)病率成倍增長，而轉移和侵襲是導致非小細胞肺癌患者不良預后和死亡的主要原因〔2〕。骨形態(tài)發(fā)生蛋白(BMP)對體內組織臟器間平衡狀態(tài)的維持具有重要的生物學作用，關于BMPs家族與腫瘤發(fā)生關系的研究近年來逐漸增多，其中以BMP2～7 最常見〔3〕。BMP9發(fā)現(xiàn)較晚且研究較少，其在肺癌中的調控作用還鮮有研究報道。本研究使用重組腺病毒Ad- BMP9轉染過表達的BMP9，分析BMP9對人肺鱗癌細胞株YTMLC- 90遷移和侵襲能力的影響及其生物學機制。

1 材料與方法

1.1 主要材料 人肺鱗癌細胞株YTMLC- 90、人胚腎細胞株 ATCC、正常人支氣管上皮細胞(NHBE)、重組腺病毒均購于通派(上海)生物科技有限公司；DMEM培養(yǎng)基、RPMI- 1640培養(yǎng)基、胎牛血清購于上海碧云天生物技術有限公司；Trizol、逆轉錄試劑盒購于美國Invitrogen公司；Transwell小室購于北京樂博生物科技有限公司；抗BMP9抗體、抗基質金屬蛋白酶(MMP)2抗體購于上海恒斐生物科技有限公司；抗Smad1/5/8抗體、抗p- Smad1/5抗體購于上海遠慕生物科技有限公司；羊抗兔IgG/HRP標記的二抗、羊抗鼠IgG/HRP標記的二抗購于北京基尼亞生物技術有限公司。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養(yǎng)及病毒感染 將重組腺病毒(Ad- GFP、Ad- BMP9)分別接種于人胚腎細胞株 ATCC，用含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基常規(guī)培養(yǎng)。用含10%胎牛血清的RPMI- 1640培養(yǎng)基常規(guī)培養(yǎng)人肺鱗癌細胞株YTMLC- 90，用擴增的腺病毒感染YTMLC- 90細胞，置于CO2細胞培養(yǎng)箱中孵育，其中轉染Ad- BMP9的為研究組，轉染Ad- GFP的為陰性對照組，未轉染重組腺病毒的為空白對照組。

1.2.2 劃痕愈合實驗 以5×105/孔的密度將YTMLC- 90細胞接種于6孔板，當細胞愈合率≥80%時，加入凝聚胺和重組腺病毒，4 h后用無菌牙簽在細胞愈合表面輕劃一條直線劃痕，磷酸 鹽緩沖液(PBS)洗凈后加入空白RPMI- 1640培養(yǎng)基，顯微鏡下觀察和拍照，記為0 h；在CO2細胞培養(yǎng)箱中繼續(xù)孵育48 h后在觀察劃痕處細胞愈合情況并拍照，計算每組細胞的劃痕愈合率。

1.2.3 Transwell細胞遷移和侵襲實驗 將腺病毒感染48 h的YTMLC- 90細胞用無血清培養(yǎng)基重懸，在上室(基質膠與無血清的RPMI- 1640培養(yǎng)基按1∶3比例，鋪100 μl)中加入200 μl含5×108個細胞的懸液，在下室中加入500 μl含10%胎牛血清的RPMI- 1640培養(yǎng)基，孵育24 h后用無菌棉簽擦去上室中的基質膠和殘余細胞，結晶紫染色后在光學顯微鏡下選取5個視野計數(shù)并拍照。

1.2.4 RT- PCR檢測 取腺病毒感染48 h的YTMLC- 90細胞和未感染的細胞，用Trizol試劑盒提取每組細胞總RNA，兩步法逆轉錄得到cDNA并進行PCR擴增，反應體系為20 μl，引物由上海卓康生物科技有限公司合成。常規(guī)反應條件下進行40個循環(huán)。用Quantity one軟件檢測結果的灰度值，計算BMP9、MMP2、Noggin的相對表達量。

1.2.5 Western印跡檢測 取腺病毒感染48 h的YTMLC- 90細胞并提取總蛋白，BCA法檢測蛋白濃度，取100 μg蛋白樣本用SDS- 聚丙烯酰胺凝膠分離蛋白、濕法轉膜，BSA封閉后加一抗(稀釋比例為BMP9：1/500，Smad1/5/8：1/1 000，p- Smad1/5∶1/1 000)，4℃孵育過夜，洗膜后加二抗(1/5 000)，37℃孵育60 min后ECL顯影，用Quantity one軟件檢測電泳條帶的灰度值，計算蛋白相對表達量。

1.3 統(tǒng)計學分析 采用SPSS20.0軟件進行t檢驗。

2 結 果

2.1 BMP9在人肺鱗癌細胞株YTMLC- 90和NHBE中的表達 人肺鱗癌細胞株YTMLC- 90中BMP9 mRNA表達量(0.51±0.19)明顯低于NHBE(0.69±0.05)(P<0.05)；肺鱗癌細胞株YTMLC- 90中BMP9 蛋白表達量(1.38±0.20)明顯低于NHBE(2.06±0.31)(P<0.05)。見圖1。

圖1 YTMLC- 90和NHBE中BMP9 蛋白表達

2.2 重組腺病毒轉染YTMLC- 90細胞對BMP9表達的影響 分別用重組腺病毒Ad- GFP、Ad- BMP9轉染YTMLC- 90細胞，常規(guī)培養(yǎng)48 h后感染率≥80%。Ad- BMP9轉染YTMLC- 90細胞后，胞內BMP9蛋白表達量(5.91±1.30)明顯高于陰性對照組(2.05±0.61，P<0.01)，提示BMP9在YTMLC- 90細胞中成功高表達。

2.3 高表達BMP9對YTMLC- 90細胞活性和MMP2表達水平的影響 空白對照組48 h的細胞劃痕愈合率為(65.19±5.56)%，與陰性對照組〔(60.12±4.47)%〕比較差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)；研究組細胞劃痕愈合率〔(24.38±3.51)%〕明顯低于陰性對照組和空白對照組(P<0.01)，見圖2。研究組穿過小室膜的YTMLC- 90細胞數(shù)明顯少于陰性對照組和空白對照組，穿過基質膠的YTMLC- 90細胞數(shù)明顯少于陰性對照組和空白對照組，見圖3、圖4。研究組MMP2 mRNA表達量(0.48±0.13)明顯低于陰性對照組(0.65±0.18)(P<0.05)，MMP2蛋白表達量(0.63±0.11)明顯低于陰性對照組(0.85±0.21，P<0.05)。

2.4 高表達BMP9對YTMLC- 90細胞中BMP- Smad信號通路的影響 YTMLC- 90細胞高表達BMP9后，p- Smad 1/5的表達量(0.96±0.14)明顯高于陰性對照組(0.44±0.03)和空白對照組(0.41±0.08，P<0.01)。見圖5。

圖2 3組細胞劃痕愈合實驗結果(×100)

圖3 Transwell實驗穿過小室膜的細胞數(shù)量(×100)

圖4 Transwell侵襲實驗穿過基質膠的細胞數(shù)量(×100)

圖5 各組p- Smad1/5的表達情況

3 討 論

相關研究發(fā)現(xiàn)，早期肺癌發(fā)生與多種基因的表達相關，而BMPs家族在腫瘤病情進展中發(fā)揮重要作用〔4〕；動物實驗顯示，BMP2表達量增加會提升肺癌的發(fā)生率和死亡率，可刺激肺癌細胞體外遷移和侵襲〔5〕。此外，BMP6和BMP3在肺癌組織中蛋白表達水平明顯高于正常組織〔6〕。BMP9在不同類型腫瘤中作用存在差異，在前列腺癌組織和細胞中檢出BMP9低表達，調高BMP9表達水平后可明顯抑制前列腺癌細胞增殖和侵襲力〔7〕；但在肝癌組織中存在BMP9高表達，使用病毒載體抑制其表達后可明顯減弱肝癌細胞的遷移和侵襲能力〔8〕；說明BMP9在前列腺癌中發(fā)揮抑癌基因的作用而在肝癌中是促進癌細胞病變的因子。

本次研究顯示，BMP9在人肺鱗癌細胞株YTMLC- 90中的表達水平明顯低于正常支氣管上皮細胞。使用重組腺病毒Ad- BMP9轉染YTMLC- 90細胞后胞內過表達BMP9，細胞的遷移能力和侵襲能力均明顯降低。BMP- Smad信號通路是BMPs家族發(fā)揮調控作用的經(jīng)典通路，高表達BMP9的YTMLC- 90細胞中BMP- Smad信號通路中Smad1/5磷酸化明顯增強，提示BMP9通過BMP- Smad信號通路調控肺癌細胞增殖、轉移等生物學活性。

綜上所述，高表達BMP9可有效抑制人肺鱗癌細胞株YTMLC- 90的遷移、侵襲能力，主要通過激活BMP- Smad信號通路發(fā)揮調控作用，因此BMP9有望成為治療肺癌的一個新靶點。對于BMP9是否能通過激活Erk、P38 Mark 等其他信號通路來調控肺癌細胞增殖和遷移仍需進一步研究。

1 余 虹,邱昕光.老年綜合評價體系對老年非小細胞肺癌患者個體化治療的指導意義〔J〕.中國老年學雜志,2015;35(2):387- 9.

2 徐維國.CXCL12- G801A基因多態(tài)性與我國漢族人群非小細胞肺癌發(fā)病風險的相關性研究〔D〕.廣州：南方醫(yī)科大學,2015.

3 Choi YJ,Kim ST,Park KH，etal.The serum bone morphogenetic protein- 2 level in non- small- cell lung cancer patients〔J〕.Med Oncol,2012;29(2):582- 8.

4 鄭宏瑜.非小細胞肺癌組織中BMP- 2與CD105的表達和意義〔D〕.南昌：南昌大學,2011.

5 Owens P,Pickup MW,Novitskiy SV,etal.Inhibition of BMP signaling suppresses metastasis in mammary cancer〔J〕.Oncogene,2015;34(19):2437- 49.

6 Yeh LC.In vitro and in vivo studies on the effects of bone morphogenetic protein- 7 on human kidney and lung tumor cells〔J〕.Int J Biomed Sci,2010;6(3):176- 81.

7 Lee KB,Murray SS,Duarte MEetal.Effects of the bone morphogenetic protein binding protein spp24(secreted phosphoprotein 24 kD) on the growth of human lung cancer cells〔J〕.J Orthop Res,2011；29(11):1712- 8.

8 Ye L,Mason MD,Jiang WG,etal.Bone morphogenetic protein and bone metastasis,implication and therapeutic potential〔J〕.Front Biosci(Landmark Ed),2011;16:865- 97.

〔2016- 10- 18修回〕

(編輯 滕欣航)

崔 丹(1978- )，女，講師，主要從事生理學研究。

R73

A

1005- 9202(2017)15- 3691- 03；

10.3969/j.issn.1005- 9202.2017.15.021