北五味子多糖對中性粒細(xì)胞炎性因子白細(xì)胞介素- 6及細(xì)胞凋亡的影響

李洪濤 李嘉儀 王春梅 陳建光 孫曉紅

(北華大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，吉林 吉林 132013)

北五味子多糖對中性粒細(xì)胞炎性因子白細(xì)胞介素- 6及細(xì)胞凋亡的影響

李洪濤 李嘉儀1王春梅2陳建光2孫曉紅

(北華大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，吉林 吉林 132013)

目的 探討北五味子多糖對脂多糖(LPS)處理的中性粒細(xì)胞炎性因子白細(xì)胞介素(IL)- 6含量及細(xì)胞凋亡的影響。方法 實驗分為空白對照組、LPS組及北五味子多糖組，使用酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA) 檢測LPS處理的中性粒細(xì)胞的IL- 6含量及原位末端標(biāo)記法(TUNEL)檢測凋亡。結(jié)果 北五味子多糖可以抑制IL- 6的分泌，隨濃度的增加抑制作用增強，與LPS組相比，隨時間延長抑制作用增強，16 h抑制作用最好，與LPS組相比IL- 6的含量顯著降低(P<0.05)。LPS可使中性粒細(xì)胞凋亡延遲，作用16 h，LPS組凋亡指數(shù)與對照組相比顯著降低(P<0.05)；北五味子多糖組凋亡指數(shù)隨時間延長和濃度增加而增加，5 mg/ml北五味子多糖作用16 h促凋亡作用最好，與LPS組相比顯著升高(P<0.05)。結(jié)論 北五味子多糖可減少LPS處理的中性粒細(xì)胞IL- 6的含量，并可促進中性粒細(xì)胞凋亡。

北五味子多糖；中性粒細(xì)胞；白細(xì)胞介素(IL)- 6；凋亡指數(shù)

五味子是我國的傳統(tǒng)中藥，有益氣生津、收斂固澀、補腎寧心等功效〔1〕。我國五味子屬有20余種，最常用的是北五味子，其次是華中五味子。五味子中含有木脂素、多糖、揮發(fā)油和氨基酸等成分〔2〕。北五味子多糖具有保肝、抗疲勞、增強免疫力、抗氧化、抗腫瘤等多種藥理作用。近年研究發(fā)現(xiàn)多糖，如寡糖特別是果聚寡糖也具有抗炎作用〔3,4〕。還有一些寡糖及多糖的口服或外用消炎藥正在臨床試驗中，因此，從多糖中篩選抗炎藥物引起廣泛重視〔5〕。中性粒細(xì)胞是介導(dǎo)炎癥反應(yīng)的重要效應(yīng)細(xì)胞，在機體非特異性免疫防御中起重要作用。但在嚴(yán)重創(chuàng)傷、膿毒血癥、缺血再灌注等條件下，中性粒細(xì)胞過度激活、釋放大量毒性介質(zhì)及產(chǎn)生大量的炎性細(xì)胞因子，炎性細(xì)胞因子又可延遲中性粒細(xì)胞凋亡，造成更多炎性細(xì)胞因子釋放。此時抑制中性粒細(xì)胞過強的效應(yīng)或促進其凋亡則有利于減輕機體損傷。本研究通過脂多糖(LPS)刺激人中性粒細(xì)胞的體外實驗，探討北五味子多糖對中性粒細(xì)胞白細(xì)胞介素(IL)- 6及凋亡延遲的影響。

1 材料與方法

1.1 主要試劑 北五味子多糖(東北師范大學(xué)生命科學(xué)院提供)；LPS(Sigma公司)；人中性粒細(xì)胞分離液(天津灝洋生物公司)；IL- 6檢測試劑盒(RD公司)；原位末端標(biāo)記法(TUNEL)檢測試劑盒(羅氏公司)。

1.2 中性粒細(xì)胞分離及培養(yǎng) 采取健康志愿者外周靜脈血5 ml，乙二胺四乙酸(EDTA)抗凝。按人中性粒細(xì)胞分離液試劑盒、血液樣本量小于5 ml進行操作。取15 ml離心管，先加入試劑A，后加入試劑B，制成梯度界面；小心吸取血液樣本加入分離液之液面上，1 730 r/min離心30 min；吸取下層乳白色環(huán)置于另一15 ml離心管中(離心管中先加入清洗液5 ml)然后補足清洗液至10 ml，混勻細(xì)胞，1 160 r/min離心12 min，棄上清；5 ml清洗液重懸細(xì)胞，1 160 r/min離心12 min，棄上清；5 ml清洗液重懸細(xì)胞，1 160 r/min離心12 min，棄上清；加入5 ml含10%胎牛血清的DMEM細(xì)胞培養(yǎng)液重懸液體，并將此液體倒入25 ml細(xì)胞培養(yǎng)瓶中，37℃、5%二氧化碳(CO2)培養(yǎng)。通過臺盼藍(lán)排斥實驗計數(shù)并評價細(xì)胞存活率(>96%)。瑞士姬姆薩染色觀察中性粒細(xì)胞純度(>96%)。

1.3 實驗分組 實驗分為對照組、LPS組(終濃度1.0 μg/mL)、北五味子多糖組(LPS+北五味子多糖)，北五味子多糖終濃度為1.25 mg/ml、2.5 mg/ml、5 mg/ml。其中北五味子多糖組先加入LPS(終濃度1.0 μg/ml)刺激60 min，再加入北五味子多糖。每組設(shè)定3個平行孔。

1.4 酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)檢測IL- 6含量 中性粒細(xì)胞懸液按1×105個細(xì)胞/ml接種于96孔平底培養(yǎng)板，在不同時間終止培養(yǎng)后，取各組細(xì)胞培養(yǎng)上清液1 500 r/min離心10 min；取40 μl離心上清液，加入對應(yīng)的酶標(biāo)板中。然后按IL- 6檢測試劑盒進行操作。

1.5 TUNEL法檢測中性粒細(xì)胞的凋亡 中性粒細(xì)胞懸液按2×106個細(xì)胞/ml接種于24孔平底培養(yǎng)板，在不同時間終止培養(yǎng)后，取細(xì)胞培養(yǎng)液涂片；固定液15℃～25℃風(fēng)干1 h；磷酸緩沖液(PBS)沖洗玻片3次；封閉液15℃～25℃孵育10 min；PBS沖洗玻片3次；用滲透液孵育2 min、置于冰上2℃～8℃；PBS沖洗玻片2次，使樣品周圍區(qū)域變干；加入50 μl TUNEL反應(yīng)混合液于樣品上；在濕盒、暗室中加蓋孵育60 min、37℃；PBS沖洗3次；可在樣品上加入1滴PBS，于熒光顯微鏡下觀察。在515～565 nm(綠色)范圍內(nèi)檢測。凋亡細(xì)胞呈深綠色熒光，正常細(xì)胞不染色。計算凋亡指數(shù)，即凋亡細(xì)胞數(shù)/全部細(xì)胞數(shù)。

1.6 統(tǒng)計學(xué)分析 采用SPSS10.0統(tǒng)計軟件進行t檢驗和方差分析。

2 結(jié) 果

2.1 瑞士姬姆薩染色觀察中性粒細(xì)胞形態(tài) 分離出的中性粒細(xì)胞狀態(tài)好，典型分葉核狀，細(xì)胞質(zhì)紅染，著色均勻。見圖1。

2.2 ELISA法檢測IL- 6含量 LPS可使中性粒細(xì)胞培養(yǎng)上清液中IL- 6的含量增加，且隨時間延長促進分泌作用增強。LPS組IL- 6含量與對照組比顯著升高(P<0.05)。北五味子多糖可以抑制IL- 6的分泌，隨濃度增加抑制作用增強，與LPS組相比，隨時間延長抑制作用增強。其中，北五味子多糖組作用16 h抑制作用最好；與LPS組相比，IL- 6含量顯著降低(P<0.05)。見表1。

2.3 TUNEL法檢測中性粒細(xì)胞的凋亡及凋亡指數(shù) LPS組凋亡細(xì)胞數(shù)量減少，說明LPS可使中性粒細(xì)胞存活時間延長，凋亡延遲；北五味子多糖組的凋亡細(xì)胞數(shù)量增多，說明北五味子多糖可促進凋亡延遲的中性粒細(xì)胞凋亡。見圖2。LPS組與對照組比中性粒細(xì)胞凋亡指數(shù)顯著降低(P<0.05)。不同濃度北五味子多糖組的凋亡指數(shù)隨時間延長和濃度增加而增加。其中，5 mg/ml北五味子多糖作用16 h促進凋亡作用最好，與LPS組相比顯著升高(P<0.05)。見表1。

圖1 中性粒細(xì)胞形態(tài)(瑞士姬姆薩染色，×400)

組別IL-6(pg/ml)2h4h8h16h凋亡指數(shù)(%)2h4h8h16h對照組2.62±0.182.98±0.213.02±0.243.29±0.293.62±0.396.62±0.3919.38±1.8935.52±3.68LPS組15.19±1.571)54.32±6.781)87.15±10.231)173.21±14.291)2.19±0.784.08±0.817.32±0.981)11.15±1.791)北五味子多糖組(1.25mg/ml)10.28±2.3431.91±3.5635.5±3.7859.85±4.532)3.17±0.954.38±0.987.95±1.2618.71±2.03北五味子多糖組(2.5mg/ml)8.67±1.5623.34±2.1327.53±2.562)38.89±3.152)3.42±0.595.67±0.8713.34±3.0829.53±3.752)北五味子多糖組(5.0mg/ml)4.59±0.538.63±0.982)11.28±0.872)13.36±0.892)3.57±1.756.98±1.8320.63±3.562)34.28±3.992)

與對照組比較:1)P<0.05；與LPS組比較:2)P<0.05

圖2 中性粒細(xì)胞的凋亡形態(tài)(TUNEL法，×200)

3 討 論

目前，以中性粒細(xì)胞浸潤為特征的非特異性炎癥，與哮喘、類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎、潰瘍性結(jié)腸炎、急性肺損傷、動脈粥樣硬化、腎小球腎炎等多種疾病有關(guān)。當(dāng)機體受到外界刺激時，可產(chǎn)生與免疫應(yīng)答及炎癥密切相關(guān)的多種細(xì)胞因子，如IL- 1β、IL- 6、腫瘤壞死因子(TNF)- α等。在眾多自身免疫性疾病中，如類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎、潰瘍性結(jié)腸炎等，IL- 1β、IL- 6 及TNF- α 的水平也明顯升高〔6,7〕。其中，IL- 6是炎性反應(yīng)的促發(fā)劑，可以激活中性粒細(xì)胞胞內(nèi)酶并促使細(xì)胞毒性顆粒釋放，延遲中性粒細(xì)胞自發(fā)性凋亡等〔8〕。因此抑制中性粒細(xì)胞的凋亡延遲及細(xì)胞因子轉(zhuǎn)錄，對非特異性炎癥的治療具有重要意義。臨床上應(yīng)用的腎上腺皮質(zhì)激素類與非甾體類治療非特異性炎癥，只能緩解癥狀且毒副作用大。我國中藥資源豐富，中藥屬于天然產(chǎn)物且毒副作用小，已知的生物堿、黃酮、萜類、多糖及揮發(fā)油等均具有抗炎作用。其中，多糖是重要的生物活性物質(zhì)，且從植物中提取的多糖最為重要。因此，從植物多糖中篩選抗炎藥物具有重要價值。

本研究結(jié)果表明，LPS可使中性粒細(xì)胞存活時間延長，分泌IL- 6增加，IL- 6增加可使中性粒細(xì)胞凋亡延遲，中性粒細(xì)胞凋亡延遲又導(dǎo)致分泌IL- 6，這樣形成了級聯(lián)式瀑布效應(yīng)，中性粒細(xì)胞過度浸潤、存活時間延長，加重非特異性炎癥反應(yīng)。北五味子多糖可使LPS刺激的中性粒細(xì)胞的IL- 6減少，也對中性粒細(xì)胞的凋亡延遲起抑制作用，所以北五味子多糖有望成為新的抗非特異性炎癥藥物。

1 國家藥典委員會.中華人民共和國藥典〔M〕.北京:化學(xué)工業(yè)出版社,2005:44.

2 黃 鑫,宋鳳瑞,劉志強,等.現(xiàn)代質(zhì)譜及其聯(lián)用技術(shù)在中藥五味子研究中的應(yīng)用〔J〕.世界科學(xué)技術(shù)- 中醫(yī)藥現(xiàn)代化,2009;11(1):115- 9.

3 Lindsay JO，Whelan K，Stagg AJ，etal.Clinical,microbiological,and immunological effects of fructo- oligosaccharide in patients with Crohn′s disease〔J〕.Gut，2006;55(3)：348- 55.

4 Guzmán S，Gato A，Lamela M，etal.Anti- inflammatory and immunomodulatory activities of polysaccharide from Chlorella stigmatophora and Phaeodactylum tricornutum〔J〕.Phytother Res，2003;17(6):665- 70.

5 Pereda- Miranda R，Kaatz GW，Gibbons S.Polyacylated oligosaccharides from medicinal Mexican morning glory species as antibacterials and inhibitors of multidrug resistance in Staphylococcus aureus〔J〕.J Nat Prod，2006;69(3):406- 9.

6 Jazayeri JA,Carroll GJ,Vernallis AB.Interleukin- 6 subfamily cytokines and rheumatoid arthritis:role of antagonists〔J〕.Int Immunopharmacol,2010;10(1):1- 8.

7 仲人前.細(xì)胞因子與自身免疫性疾病的關(guān)系〔J〕.中華檢驗醫(yī)學(xué)雜志,2000;23(4):200- 2.

8 Ottonello L,Frumento G,Arduino N,etal.Differential regulation of spontaneous and immune complex- induced neutrophil apoptosis by proinflammatory cytokines.Role of oxidants,Bax and caspase- 3 〔J〕.J Leukoc Biol,2002;72 (1):125- 32.

〔2016- 11- 25修回〕

(編輯 王一涵)

吉林省教育廳“十二五”科學(xué)技術(shù)研究項目(2014201)；北華大學(xué)省級大學(xué)生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓(xùn)練計劃項目(2016- 199100282);北華大學(xué)博士啟動基金(199500031)

孫曉紅(1968- )，女，博士，副教授，主要從事病原生物學(xué)及中藥開發(fā)研究。

李洪濤(1969- )，男，高級實驗師，主要從事法醫(yī)病理學(xué)研究。

R285.5

A

1005- 9202(2017)15- 3687- 03；

10.3969/j.issn.1005- 9202.2017.15.019

1 北華大學(xué)第一臨床醫(yī)學(xué)院 2 北華大學(xué)藥學(xué)院