人參糖肽對(duì)大鼠體外胰島β細(xì)胞的保護(hù)作用

趙麗艷 張秀云 苗春生 李相軍 李 才 劉昕鳴

(吉林大學(xué)第二醫(yī)院檢驗(yàn)科，吉林 長(zhǎng)春 130041)

人參糖肽對(duì)大鼠體外胰島β細(xì)胞的保護(hù)作用

趙麗艷 張秀云1苗春生1李相軍1李 才1劉昕鳴

(吉林大學(xué)第二醫(yī)院檢驗(yàn)科，吉林 長(zhǎng)春 130041)

目的 探討人參糖肽對(duì)體外培養(yǎng)大鼠胰島β細(xì)胞的保護(hù)效果。方法 分離和培養(yǎng)大鼠胰島β細(xì)胞。人參糖肽預(yù)處理β細(xì)胞之后用鏈脲佐菌素(STZ)引起細(xì)胞損傷(人參糖肽+STZ組)，STZ引起β細(xì)胞損傷后再進(jìn)行人參糖肽處理(STZ+人參糖肽組)，以正常胰島β細(xì)胞和單用人參糖肽處理的β細(xì)胞作為對(duì)照。檢測(cè)培養(yǎng)上清中胰島素和C肽分泌水平，噻唑藍(lán)(MTT)法檢測(cè)細(xì)胞存活率，免疫組織化學(xué)染色測(cè)量β細(xì)胞內(nèi)胰島素蛋白表達(dá)水平，電鏡觀察細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)變化。結(jié)果 人參糖肽+STZ組胰島β細(xì)胞的胰島素和C肽分泌量與正常胰島細(xì)胞比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，而在STZ+人參糖肽組二者分泌量均明顯減少(P<0.05)。人參糖肽+STZ組胰島β細(xì)胞的存活率有所下降，但與單獨(dú)人參糖肽組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，而STZ+人參糖肽組細(xì)胞存活率顯著降低(P<0.05)。免疫組織化學(xué)定量研究顯示，STZ+人參糖肽組胰島β細(xì)胞內(nèi)胰島素陽(yáng)性染色面積與細(xì)胞面積的百分比明顯小于其他3組。STZ+人參糖肽組胰島β細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)為變性及壞死性改變，且分泌顆粒極少，而人參糖肽+STZ組胰島β細(xì)胞這些改變明顯減輕，可見大量分泌顆粒。結(jié)論 人參糖肽對(duì)STZ引起的大鼠體外胰島β細(xì)胞損傷有防護(hù)作用。

人參糖肽；胰島β細(xì)胞；胰島素

人參糖肽是我國(guó)治療糖尿病(DM)的中藥二類新藥。研究證明，人參糖肽能降低實(shí)驗(yàn)性DM動(dòng)物的血糖水平〔1〕。應(yīng)用人參糖肽治療2型糖尿病(T2DM)患者，其降低血糖起效較緩慢，但作用持續(xù)，停藥后一段時(shí)間內(nèi)血糖仍處于較低水平〔2〕。人參糖肽降低血糖作用的機(jī)制尚未闡明。胰島β細(xì)胞的主要功能是分泌胰島素，胰島素對(duì)維持機(jī)體糖穩(wěn)態(tài)起關(guān)鍵作用，在DM的發(fā)生發(fā)展中扮演重要角色。人參糖肽能否通過(guò)保護(hù)胰島β細(xì)胞功能發(fā)揮降低血糖的作用，目前尚未見報(bào)道。本研究旨在探討人參糖肽對(duì)體外培養(yǎng)大鼠胰島β細(xì)胞的保護(hù)效果。

1 材料與方法

1.1 材料 人參糖肽注射液由吉林省松原天實(shí)藥業(yè)有限責(zé)任公司提供，使用時(shí)用生理鹽水配制成所需濃度。鏈脲佐菌素(STZ)、胰島素抗體、膠原酶Ⅴ、細(xì)胞分離液Histopaque1077、雙硫腙、噻唑藍(lán)(MTT)購(gòu)自Sigma公司；RPMI- 1640培養(yǎng)基、胎牛血清(FBS)購(gòu)自Gibco公司；胰島素和C肽放射免疫分析試劑盒購(gòu)自中國(guó)原子能科學(xué)研究院同位素研究所；其他試劑為國(guó)產(chǎn)分析純；濃縮型鏈霉素親和素- 生物素復(fù)合物(SABC)試劑盒、二氨基聯(lián)苯胺(DAB)顯色試劑盒及其他組化試劑購(gòu)自博士德公司。體重250～300 g雄性Wistar大鼠由吉林大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物部提供(實(shí)驗(yàn)動(dòng)物合格證號(hào)吉科字950000010，醫(yī)動(dòng)字10- 5110)。

1.2 胰島β細(xì)胞的分離和培養(yǎng) 參考文獻(xiàn)〔3〕的方法并加以改進(jìn)。大鼠過(guò)夜禁食，腹腔注射戊巴比妥鈉麻醉，無(wú)菌條件下剪開腹壁，上翻肝臟，下拉十二指腸，分離膽總管十二指腸入口處，引入手術(shù)線，近肝門部結(jié)扎膽總管上端，膽總管中段向遠(yuǎn)側(cè)插入4.5號(hào)針頭，準(zhǔn)確插入后可見黃綠色膽汁回流，心臟放血處死大鼠。經(jīng)膽總管逆行注入預(yù)冷Hank液，再灌注膠原酶Ⅴ(1 mg/ml)6 ml。灌注后迅速剪下膨脹的胰腺，將其放入預(yù)熱至37℃的水浴中溫育，靜止消化12 min。用力振蕩胰腺消化產(chǎn)物，經(jīng)600 μm濾網(wǎng)過(guò)濾除去未完全消化的組織，終止消化，4℃ 1 000 r/min離心 2 min。將胰島消化產(chǎn)物混于分離液Histopaque1077中，再沿管壁在混合產(chǎn)物之上緩慢加入10 ml Histopaque1077，繼而加入10 ml冷Hank液，梯度離心收集純化胰島。雙硫腙染色倒置顯微鏡下觀察染成猩紅色的細(xì)胞團(tuán)即為胰島〔4〕。調(diào)整細(xì)胞濃度為2×105/ml，置于6孔培養(yǎng)板中，用含10%FBS、青霉素100 U/ml、鏈霉素0.1 mg/ml的RPMI- 1640培養(yǎng)基于5% CO2、37℃培養(yǎng)5 d后用于下述實(shí)驗(yàn)。

1.3 胰島β細(xì)胞處理、胰島素和C肽分泌量測(cè)定 ①人參糖肽+STZ組：在含等量胰島β細(xì)胞的培養(yǎng)液中加入終濃度160 μg/ml的人參糖肽，繼續(xù)培養(yǎng)24 h，再加入STZ(5 mmol/L)作用2 h后收集培養(yǎng)上清，按放射免疫分析試劑盒說(shuō)明書測(cè)定胰島素和C肽分泌量；②STZ+人參糖肽組：在含等量胰島β細(xì)胞的培養(yǎng)液中先加入STZ(5 mmol/L)作用2 h后再加入人參糖肽160 μg/ml，繼續(xù)培養(yǎng)24 h，收集培養(yǎng)上清，按放射免疫分析試劑盒說(shuō)明書測(cè)定胰島素和C肽分泌量。以正常胰島β細(xì)胞和單獨(dú)用人參糖肽處理的β細(xì)胞為對(duì)照。每組3個(gè)平行孔。

1.4 胰島β細(xì)胞存活率的檢測(cè) 96孔培養(yǎng)板每孔加入混勻的β細(xì)胞懸液190 μl(含10 000個(gè)細(xì)胞)。經(jīng)上述因素處理并培養(yǎng)24 h后，每孔加入5 mg/ml的MTT溶液20 μl，繼續(xù)培養(yǎng)4 h。吸棄孔內(nèi)上清液，每孔加入150 μl二甲基亞砜(DMSO)，充分振蕩。設(shè)置調(diào)零孔和空白對(duì)照孔。以空白對(duì)照孔調(diào)零，用酶標(biāo)儀在570 nm波長(zhǎng)測(cè)定每孔的A值。每種條件6個(gè)平行孔。計(jì)算細(xì)胞存活率，細(xì)胞存活率=(實(shí)驗(yàn)孔A值-空白對(duì)照A值)/(對(duì)照孔A值-空白對(duì)照A值)×100%。

1.5 免疫細(xì)胞化學(xué)染色 上述胰島β細(xì)胞處理后在6孔板制備細(xì)胞爬片，磷酸鹽緩沖液(PBS)清洗，冰丙酮固定15 min，空氣干燥，PBS清洗，0.5%Triton X- 100孵育20 min，PBS清洗，3%H2O2室溫孵育15 min，PBS清洗3次，封閉血清封閉后，滴加胰島素一抗(1∶200)，4℃過(guò)夜，以PBS代替一抗作為陰性對(duì)照。PBS漂洗，滴加二抗37℃孵育30 min，PBS漂洗，加入SABC 37℃孵育20 min，DAB顯色。蘇木素復(fù)染，脫水，透明，中性樹脂封片。光鏡觀察反應(yīng)產(chǎn)物呈棕褐色為陽(yáng)性反應(yīng)。利用Imagepro Plus 6.0分析軟件測(cè)定每個(gè)細(xì)胞胰島素陽(yáng)性染色的面積和細(xì)胞總面積，計(jì)算二者百分比，表示胰島素蛋白表達(dá)水平。每組測(cè)量30個(gè)細(xì)胞。

1.6 胰島β細(xì)胞電鏡觀察 將上述1.3中經(jīng)過(guò)不同處理的胰島β細(xì)胞刮下，懸浮在培養(yǎng)液中，傾入尖底離心管，800 r/min離心10 min，吸除上清液，緩慢加入2.5%戊二醛固定液，800 r/min離心10 min，使細(xì)胞成小丸狀，在含2.5%戊二醛固定液中切成1 mm3小塊，用2.5%戊二醛前固定和1%鋨酸后固定，Epon 812包埋，LKB- V型超薄切片機(jī)制備超薄切片，鈾和鉛雙重染色，JEM- 1200EX透射電鏡觀察胰島細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)并攝片。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用SPSS12.0軟件進(jìn)行單因素方差分析、χ2檢驗(yàn)。

2 結(jié) 果

2.1 胰島素和C肽分泌量 與正常胰島β細(xì)胞組相比，單獨(dú)人參糖肽處理β細(xì)胞24 h，對(duì)胰島素的分泌量無(wú)顯著影響。人參糖肽+STZ組胰島β細(xì)胞，其胰島素分泌量與正常胰島β細(xì)胞組及單獨(dú)人參糖肽處理組比較無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。但STZ+人參糖肽組胰島素分泌量顯著低于其他3組(P<0.05)。C肽分泌量與胰島素分泌量基本一致。見表1。

2.2 胰島β細(xì)胞存活率的檢測(cè)結(jié)果 與正常胰島β細(xì)胞組相比，單獨(dú)人參糖肽組仍然很高，可達(dá)(96.8±18.6)%，表明人參糖肽對(duì)胰島β細(xì)胞無(wú)明顯細(xì)胞毒性。人參糖肽+STZ組，細(xì)胞存活率有所下降，但與單獨(dú)人參糖肽組比較無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。STZ+人參糖肽組細(xì)胞存活率顯著低于其他3組(P<0.05)。見表1。

表1 各組胰島β細(xì)胞的胰島素、C肽分泌量和細(xì)胞存活率

與STZ+人參糖肽組比較：1)P<0.05

2.3 免疫細(xì)胞化學(xué)染色結(jié)果 培養(yǎng)5 d的胰島β細(xì)胞呈球形或略呈橢圓形，直徑10～14 μm，胞質(zhì)透亮，胞核大。免疫細(xì)胞化學(xué)染色顯示：正常胰島β細(xì)胞呈橢圓形或短梭形，核圓而大，細(xì)胞結(jié)構(gòu)無(wú)明顯異常，在胞質(zhì)內(nèi)可見胰島素呈濃重棕黃色陽(yáng)性表達(dá)，證明所分離和培養(yǎng)的細(xì)胞是胰島β細(xì)胞。單獨(dú)加入人參糖肽對(duì)胰島β細(xì)胞結(jié)構(gòu)無(wú)明顯影響，胞核呈圓形，胞質(zhì)內(nèi)可見胰島素呈棕黃色陽(yáng)性表達(dá)。人參糖肽+STZ組胞核呈圓形，胞質(zhì)呈棕色，可見少量空泡。STZ+人參糖肽組核膜界限模糊，部分胞膜破壞，胞漿內(nèi)可見多數(shù)空泡，胞質(zhì)呈淺淡黃色。STZ+人參糖肽組胰島β細(xì)胞內(nèi)胰島素陽(yáng)性染色面積與細(xì)胞面積的百分比(38.8±8.2)%明顯小于正常胰島β細(xì)胞組(89.9±24.2)%、單獨(dú)人參糖肽組(86.6±17.8)%和人參糖肽+STZ組(76.4±18.6)%(P<0.05)。見圖1。

圖1 各組胰島β細(xì)胞免疫細(xì)胞化學(xué)染色(×400)

2.4 胰島β細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)改變 正常胰島β細(xì)胞：胞核較規(guī)則，核膜光滑，染色質(zhì)均勻分布，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)豐富，胞質(zhì)內(nèi)可見大量高密度的分泌顆粒。人參糖肽+STZ組：胞核較規(guī)則，胞核內(nèi)染色質(zhì)邊聚不明顯，線粒體較多，胞質(zhì)內(nèi)可見較多分泌顆粒。STZ+人參糖肽組：呈變性和壞死性改變，胞核染色質(zhì)濃集邊聚，細(xì)胞器溶解，可見大小不一的空泡，胞質(zhì)內(nèi)分泌顆粒稀少，見圖2。

A：正常胰島β細(xì)胞(×8 000)；B：人參糖肽+STZ(×6 600)；C：STZ+人參糖肽(×8 000)圖2 各組胰島β細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)改變

3 討 論

胰島β細(xì)胞是體內(nèi)分泌胰島素的重要細(xì)胞，在DM的發(fā)生發(fā)展中起關(guān)鍵作用，保護(hù)胰島β細(xì)胞具有重要意義。研究胰島β細(xì)胞功能可以利用胰島素瘤細(xì)胞如NIT- 1β、MIN6N8、RIN- m5f、INS- 1細(xì)胞，也可利用從動(dòng)物胰腺分離培養(yǎng)的胰島β細(xì)胞〔5，6〕，本研究利用從大鼠胰腺組織分離培養(yǎng)的胰島β細(xì)胞。STZ對(duì)胰島β細(xì)胞具有高度選擇性毒性，除了用來(lái)復(fù)制DM動(dòng)物模型外，目前已用于體外引起胰島β細(xì)胞損傷〔7〕，本研究利用STZ作為損傷胰島β細(xì)胞的因素。C肽與胰島素以等分子數(shù)從胰島β細(xì)胞釋放，具有穩(wěn)定性好、不受外源性胰島素和血胰島素抗體的影響等特點(diǎn)，已成為胰島素分泌能力的一個(gè)良好指標(biāo)。本研究表明人參糖肽預(yù)處理對(duì)胰島β細(xì)胞有較好的保護(hù)作用。但人參糖肽后處理對(duì)胰島β細(xì)胞的保護(hù)作用不明顯。

細(xì)胞存活率可以反映損傷因素對(duì)細(xì)胞的損害程度。本研究結(jié)果表明，人參糖肽預(yù)處理能顯著減輕STZ對(duì)胰島β細(xì)胞的損傷，對(duì)細(xì)胞有較好的保護(hù)作用。然而，人參糖肽后處理不能明顯保護(hù)胰島β細(xì)胞。本研究免疫細(xì)胞化學(xué)染色證明所分離和培養(yǎng)的細(xì)胞是胰島β細(xì)胞。從細(xì)胞形態(tài)改變和胰島素陽(yáng)性染色面積與細(xì)胞面積的百分比分析可見，人參糖肽預(yù)處理對(duì)胰島β細(xì)胞損傷有較好的保護(hù)作用，而人參糖肽后處理則保護(hù)作用較差。胰島β細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)改變進(jìn)一步說(shuō)明人參糖肽預(yù)處理對(duì)胰島β細(xì)胞損傷有較好的保護(hù)作用。

由于胰腺β細(xì)胞中的抗氧化酶活性很低，對(duì)氧化應(yīng)激更為敏感，活性氧不僅可以直接損傷胰島β細(xì)胞，還可影響胰島素合成和分泌的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，導(dǎo)致β細(xì)胞凋亡，損害胰島分泌功能。研究表明，氧化應(yīng)激在1型和T2DM胰島β細(xì)胞功能不全的發(fā)生機(jī)制中起重要作用〔8〕。目前人參糖肽保護(hù)胰島β細(xì)胞的機(jī)制尚不十分清楚。研究證明，人參糖肽對(duì)蛋白質(zhì)糖基化終產(chǎn)物(AGEs)的形成具有明顯抑制作用〔9〕，還能明顯改善DM大鼠體內(nèi)蓄積AGEs的致尾腱膠原交聯(lián)〔10〕。Lin等〔11〕研究證明，AGEs通過(guò)氧化應(yīng)激引起胰島β細(xì)胞損傷。還有研究顯示，人參通過(guò)減少氧化應(yīng)激減輕環(huán)孢素引起的胰島β細(xì)胞損傷〔12〕。因此認(rèn)為人參糖肽可能通過(guò)其抗氧化應(yīng)激作用對(duì)胰腺β細(xì)胞發(fā)揮保護(hù)作用。

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〔2017- 05- 10修回〕

(編輯 滕欣航)

吉林省科學(xué)技術(shù)廳資助項(xiàng)目(No.20010545)

劉昕鳴(1961- )，女，副教授，主要從事內(nèi)分泌代謝疾病臨床生化研究。

趙麗艷(1971- )，女，博士，副教授，主要從事代謝性疾病和抗病生物學(xué)研究。

R965，R587.1

A

1005- 9202(2017)15- 3667- 03；

10.3969/j.issn.1005- 9202.2017.15.011

1 吉林大學(xué)藥學(xué)院實(shí)驗(yàn)藥理與毒理學(xué)教研室