SIRT3在脫氧膽酸誘導(dǎo)人正常結(jié)腸上皮NCM460細(xì)胞能量代謝損傷中的作用*

王傳杰， 周 洋， 張 萌， 周 英， 徐佳琪， 朱敏航， 詹 琳， 周乾毅， 袁 瓊

(武漢科技大學(xué)醫(yī)學(xué)院藥學(xué)系， 湖北 武漢 430065)

SIRT3在脫氧膽酸誘導(dǎo)人正常結(jié)腸上皮NCM460細(xì)胞能量代謝損傷中的作用*

王傳杰， 周 洋， 張 萌， 周 英， 徐佳琪， 朱敏航， 詹 琳， 周乾毅， 袁 瓊△

(武漢科技大學(xué)醫(yī)學(xué)院藥學(xué)系， 湖北 武漢 430065)

目的： 探討脫氧膽酸(deoxycholic acid，DCA)對(duì)人結(jié)腸上皮NCM460細(xì)胞能量代謝損傷的影響及可能機(jī)制。方法: 培養(yǎng)人正常結(jié)腸上皮NCM460細(xì)胞，采用DCA(10 μmol/L、30 μmol/L和100 μmol/L)作用5 d，或DCA(100 μmol/L)作用3、5和7 d；DCA(100 μmol/L)處理3 d后，用去乙酰化酶sirtuin 3 (SIRT3)激動(dòng)劑白藜蘆醇(resveratrol，REV)處理細(xì)胞后繼續(xù)培養(yǎng)至第7天。細(xì)胞腺苷三磷酸(adenosine triphosphate，ATP)和乳酸生成量用試劑盒檢測，Western blot 檢測細(xì)胞的SIRT3表達(dá)。結(jié)果: DCA能濃度和時(shí)間依賴性地抑制NCM460細(xì)胞生成ATP并促進(jìn)乳酸生成，抑制SIRT3蛋白表達(dá)；白藜蘆醇能逆轉(zhuǎn)DCA對(duì)NCM460細(xì)胞的作用。結(jié)論: DCA對(duì)人結(jié)腸上皮NCM460細(xì)胞的能量代謝具有損傷作用，其損傷作用與SIRT3相關(guān)。

脫氧膽酸； 能量代謝； 乳酸； 腺苷三磷酸； Sirtuin 3； 白藜蘆醇

膽汁排入腸腔后，初級(jí)膽汁酸在回腸和結(jié)腸上段經(jīng)細(xì)菌水解和脫羥基作用轉(zhuǎn)化為次級(jí)膽汁酸，包括脫氧膽酸(deoxycholic acid，DCA)和石膽酸，其中DCA是次級(jí)膽汁酸中活性最強(qiáng)的成分[1]。有研究結(jié)果顯示DCA對(duì)正常的結(jié)腸上皮細(xì)胞具有損傷作用。DCA能誘導(dǎo)結(jié)腸上皮細(xì)胞內(nèi)氧化應(yīng)激水平從而改變線粒體膜通透性[2-3]，釋放細(xì)胞色素C并激活凋亡誘導(dǎo)因子(apoptosis-inducing factor, AIF)等促進(jìn)結(jié)腸上皮細(xì)胞的損傷[4-5]，然而，DCA是否能誘導(dǎo)結(jié)腸上皮細(xì)胞能量代謝障礙導(dǎo)致?lián)p傷尚未見文獻(xiàn)報(bào)道。

Sirtuin家族成員通過對(duì)組蛋白及多種非組蛋白的乙酰化修飾參與細(xì)胞分化、凋亡、衰老及腫瘤發(fā)生等多個(gè)生理病理過程[6]。其中依賴于煙酰胺腺嘌呤二核苷酸的去乙?；竤irtuin 3 (SIRT3)的主要功能是催化線粒體應(yīng)激反應(yīng)蛋白去乙?；痆7]。近期質(zhì)譜實(shí)驗(yàn)顯示至少65%的線粒體蛋白賴氨酸乙?；?，而SIRT3表達(dá)增高抑制了線粒體蛋白的乙?；絒8]。在SIRT3缺陷小鼠模型中發(fā)現(xiàn)，SIRT3參與調(diào)節(jié)代謝、腺苷三磷酸(adenosine triphosphate，ATP)生成和氧化應(yīng)激反應(yīng)等多種線粒體功能。研究證實(shí)SIRT3在有氧呼吸第二、三階段均能發(fā)揮作用，它通過對(duì)蛋白的去乙?；瘡亩呋人嵫h(huán)過程中的相關(guān)作用酶活性引起ATP生成增加[8]。細(xì)胞內(nèi)線粒體功能障礙從而對(duì)有氧氧化造成影響導(dǎo)致的能量代謝損傷是否與SIRT3對(duì)有氧呼吸的調(diào)節(jié)有關(guān)目前尚無定論。

本研究通過離體細(xì)胞實(shí)驗(yàn)探討DCA誘導(dǎo)結(jié)腸上皮細(xì)胞能量代謝受損及SIRT3是否參與該過程。

材 料 和 方 法

1 試劑及藥物

脫氧膽酸(Sigma)；新生牛血清(浙江天杭生物科技有限公司)；RPMI-1640培養(yǎng)基(Thermo)；BCA試劑盒和細(xì)胞線粒體分離試劑盒(碧云天)；白藜蘆醇(同田生物)；兔抗人SIRT3及鼠抗人β-actin抗體(Santa Cruz)；乳酸測定試劑盒(南京建成公司)；ATP檢測試劑盒(南京建成公司)。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 細(xì)胞實(shí)驗(yàn)方案 細(xì)胞實(shí)驗(yàn)分為3部分：(1)探討DCA誘導(dǎo)細(xì)胞能量代謝障礙的量效作用，采用DCA(10 μmol/L、30 μmol/L和100 μmol/L)干預(yù)5 d；(2)探討DCA對(duì)細(xì)胞能量代謝影響的時(shí)效性，DCA(100 μmol/L)處理 3 d、5 d和7 d；(3)探討SIRT3涉及DCA的損傷作用，采用sirtuin家族激動(dòng)劑白藜蘆醇(resveratrol，REV)干預(yù)處理，實(shí)驗(yàn)分為4組：正常組；REV組，REV(10 μmol/L)處理4 d; DCA 組，DCA(100 μmol/L)處理7 d; DCA+REV組，DCA(100 μmol/L)干預(yù)3 d后，REV (10 μmol/L)與DCA同時(shí)繼續(xù)干預(yù)4 d。

2.2 細(xì)胞培養(yǎng)及給藥處理 人正常結(jié)腸上皮細(xì)胞系NCM460購于廣州吉尼歐生物科技公司，常規(guī)復(fù)蘇，RPMI-1640培養(yǎng)基于恒溫培養(yǎng)箱中37 ℃、5% CO2培養(yǎng)。

2.3 乳酸及ATP測定 各組干預(yù)完成后收集細(xì)胞培養(yǎng)液上清，采用乳酸測定試劑盒測定細(xì)胞乳酸生成量，收集細(xì)胞采用細(xì)胞線粒體分離試劑盒分離線粒體，ATP檢測試劑盒測定細(xì)胞ATP生成量，實(shí)驗(yàn)嚴(yán)格按照測定試劑盒說明書進(jìn)行操作。

2.4 Western blot檢測SIRT3的蛋白表達(dá) 采用RIPA裂解液裂解細(xì)胞收集蛋白，BCA比色法測定總蛋白濃度，每孔40 μg蛋白上樣，蛋白凝膠電泳、轉(zhuǎn)膜，5%脫脂奶粉封閉，TBST洗膜3次，分別加入抗SIRT3的抗體(1∶1 000)和抗β-actin抗體(1∶1 000)4 ℃孵育過夜。TBST洗膜3次后孵育II抗(1∶1 000)1 h，ECL顯影。

3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

所有數(shù)據(jù)均用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)誤(mean±SEM)表示。組間差異采用單因素方差分析(one-way ANOVA)和Student-Newman-Keuls多重比較檢驗(yàn)分析。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1 DCA干預(yù)對(duì)NCM460細(xì)胞線粒體ATP生成的影響

采用不同劑量的DCA處理正常的結(jié)腸上皮細(xì)胞NCM460，檢測線粒體生成ATP能力。結(jié)果顯示與對(duì)照組相比，DCA能劑量依賴性地抑制NCM460細(xì)胞線粒體生成ATP，并在DCA濃度為100 μmol/L時(shí)，線粒體合成ATP能力最低(P<0.01)。DCA(100 μmol/L)分別處理NCM460細(xì)胞3 d、5 d和7 d均能顯著抑制ATP生成的作用，且具有時(shí)間依賴性(P<0.01)，見圖1。

Figure 1.The effect of deoxycholic acid (DCA) on the ATP production in the mitochondria of NCM460 cells. DCA inhibited the ATP production in a dose-dependent manner (A) and a time-dependent manner (B). Mean±SEM.n=3.*P<0.05,**P<0.01vsDCA (0 μmol/L) group.

圖1 脫氧膽酸對(duì)NCM460細(xì)胞線粒體合成ATP的影響

2 DCA干預(yù)對(duì)NCM460細(xì)胞乳酸生成的影響

以不同劑量的DCA處理正常的結(jié)腸上皮細(xì)胞NCM460，檢測細(xì)胞乳酸的生成能力。結(jié)果顯示與對(duì)照組相比，DCA能劑量依賴性地促進(jìn)NCM460細(xì)胞生成乳酸，并在DCA濃度為100 μmol/L時(shí)，合成乳酸能力最強(qiáng)(P<0.01)。DCA (100 μmol/L)分別處理NCM460細(xì)胞3 d、5 d和7 d均能顯著增加乳酸的合成，且具有時(shí)間依賴性(P<0.01)，見圖2。

Figure 2.The effect of daeoxycholic acid (DCA) on the lactic acid (LD) production of NCM460 cells. DCA inhibited the LD production in a dose-dependent manner (A) and a time-dependent manner (B). Mean±SEM.n=3.*P<0.05,**P<0.01vsDCA (0 μmol/L) group.

圖2 脫氧膽酸對(duì)NCM460細(xì)胞乳酸生成的影響

3 DCA干預(yù)對(duì)NCM460細(xì)胞SIRT3蛋白表達(dá)的影響

與對(duì)照組相比，DCA能劑量依賴性地抑制NCM460細(xì)胞SIRT3蛋白的表達(dá)，且當(dāng)DCA濃度達(dá)100 μmol/L時(shí)，SIRT3的蛋白表達(dá)水平最低(P<0.01)。DCA(100 μmol/L)分別處理NCM460細(xì)胞3 d、5 d和7 d，SIRT3的蛋白表達(dá)呈時(shí)間依賴性下降，且處理7 d時(shí)表達(dá)水平最低(P<0.01),見圖3。

Figure 3.The effect of deoxycholic acid (DCA) on the protein expression of SIRT3 in the NCM460 cells. DCA inhibited the protein expression of SIRT3 in a dose-dependent manner (A) and a time-dependent manner (B). Mean±SEM.n=3.*P<0.05,**P<0.01vsDCA (0 μmol/L) group.

圖3 脫氧膽酸對(duì) NCM460細(xì)胞中SIRT3蛋白表達(dá)的影響

4 白藜蘆醇干預(yù)對(duì)DCA處理后的NCM460細(xì)胞能量代謝的影響

為了進(jìn)一步探討SIRT3在DCA損傷中的作用，本實(shí)驗(yàn)應(yīng)用sirtuin家族激動(dòng)劑白藜蘆醇進(jìn)行反證。如圖4所示，以DCA(100 μmol/L)處理NCM460細(xì)胞至第3天，白藜蘆醇(10 μmol/L)繼續(xù)處理4 d。DCA處理的NCM460經(jīng)白藜蘆醇干預(yù)后細(xì)胞的乳酸生成顯著降低(P<0.01)；DCA處理的NCM460細(xì)胞經(jīng)白藜蘆醇干預(yù)后細(xì)胞線粒體的ATP生成顯著升高(P<0.01)。

Figure 4.The effect of resveratrol on ATP and lactic acid (LD) production level induced by deoxycholic acid (DCA). Resveratrol (10 μmol/L， 4 d) reversed the effect of DCA on ATP (A) and LD (B) production. Mean±SEM.n=3.**P<0.01vsnormal group;##P<0.01vsDCA (100 μmol/L) group.

圖4 白藜蘆醇抑制脫氧膽酸對(duì)NCM460細(xì)胞ATP和乳酸生成的影響

討 論

腸黏膜屏障由物理屏障和生化屏障兩部分構(gòu)成，前者主要由腸道上皮細(xì)胞和側(cè)面的細(xì)胞緊密連接等組成，后者主要由各種消化酶、抗菌肽等化學(xué)物質(zhì)及免疫相關(guān)組織、細(xì)胞等組成，可阻止腸腔內(nèi)致病菌和毒素等進(jìn)入血液循環(huán)，而腸黏膜屏障功能受損參與多種疾病的發(fā)生發(fā)展[9-11]。施行膽囊切除的患者或長期進(jìn)食高脂、高蛋白食物的人群腸腔內(nèi)次級(jí)膽汁酸(DCA和石膽酸)的含量增加[1]。然而，長期暴露于DCA會(huì)造成結(jié)腸上皮細(xì)胞的損傷。研究證實(shí)，DCA通過結(jié)合磷酸鞘氨醇受體2，促進(jìn)組織蛋白酶B的釋放，可以劑量依賴性地激活NLRP3炎癥小體活性，并進(jìn)一步促進(jìn)IL-1β的生成從而介導(dǎo)結(jié)腸炎的發(fā)生[12]。此外，在DCA誘導(dǎo)的結(jié)腸損傷細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)，ERK及P38的活性明顯提升，且上調(diào)ERK的表達(dá)可抑制細(xì)胞凋亡從而促進(jìn)局部炎癥部位組織增生[13]。能量代謝損傷的產(chǎn)生主要原因之一是線粒體功能障礙[14]。近期研究人員通過增加細(xì)胞線粒體的質(zhì)量，能有效地逆轉(zhuǎn)乳酸生成的增多，增加ATP產(chǎn)生[15]。本研究結(jié)果顯示DCA能濃度及時(shí)間依賴性地抑制結(jié)腸上皮細(xì)胞線粒體ATP的生成、促進(jìn)乳酸生成。該結(jié)果提示DCA能通過引起結(jié)腸上皮細(xì)胞線粒體能量障礙而導(dǎo)致結(jié)腸損傷。

SIRT3定位于線粒體，其主要功能是催化線粒體應(yīng)激反應(yīng)蛋白去乙?；痆7]，包括乙酰輔酶A合成酶2[16-17]、谷氨酸脫氫酶[18-19]、NADH脫氫酶[泛]1α-亞復(fù)合亞基9等在內(nèi)的有氧呼吸各階段關(guān)鍵酶活性均與SIRT3介導(dǎo)的去乙?；{(diào)節(jié)有關(guān)。線粒體功能異常與其內(nèi)部多種酶的乙?；皆龈哂嘘P(guān)[20]。SIRT3被證實(shí)能通過抑制線粒體DNA損傷阻斷心肌成纖維細(xì)胞分化和肺纖維化[21]。實(shí)驗(yàn)首次證實(shí)，DCA能濃度和時(shí)間依賴性地抑制SIRT3表達(dá)；預(yù)先給予SIRT3激動(dòng)劑白藜蘆醇能逆轉(zhuǎn)DCA對(duì)結(jié)腸上皮細(xì)胞ATP生成的抑制作用及其增加乳酸生成作用。該結(jié)果提示SIRT3表達(dá)下調(diào)介導(dǎo)了DCA誘導(dǎo)的結(jié)腸上皮細(xì)胞能量代謝障礙。

綜上所述，本研究首次發(fā)現(xiàn)DCA對(duì)結(jié)腸上皮細(xì)胞的線粒體能量代謝造成損傷作用，該作用可能與其抑制SIRT3表達(dá)下調(diào)引起線粒體功能障礙有關(guān)。然而，該機(jī)制還需進(jìn)一步確證。

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(責(zé)任編輯： 陳妙玲， 羅 森)

Role of SIRT3 in dysfunction of energy metabolism induced by deoxycho-lic acid in human colon NCM460 cells

WANG Chuan-jie, ZHOU Yang, ZHANG Meng, ZHOU Ying, XU Jia-qi， ZHU Min-hang, ZHAN Lin, ZHOU Qian-yi, YUAN Qiong

(DepartmentofPharmacology,MedicalCollege,WuhanUniversityofScienceandTechnology,Wuhan430065,China.E-mail:yuanqiong@wust.edu.cn)

AIM: To investigate the effect of deoxycholic acid (DCA) on the energy metabolism in human normal colon epithelial NCM460 cells. METHODS: NCM460 cells was treated with DCA at 10, 30 and 100 μmol/L for 5 d， or DCA at 100 μmol/L for 3, 5 and 7 d. After treated with DCA at 100 μmol/L for 3 d, the cells were treated with resveratrol, the activator of sirtuin 3 (SIRT3)， for the next 4 d. Adenosine triphosphate (ATP) production in the mitochondria and lactate acid level were detected. The protein expression of SIRT3 was determined by Western blot. RESULTS: DCA inhibited the ATP production, increased lactate acid level, and downregulated the protein expression of SIRT3 in a dose- and time-dependent manner. Resveratrol at 10 μmol/L reversed the effects of DCA on the NCM460 cells. CONCLUSION: DCA induces the dysfunction of energy metabolism in NCM460 cells, and the mechanism may be related with SIRT3.

Deoxycholic acid; Energy metabolism; Lactate acid; Adenosine triphosphate; Sirtuin 3; Resvertrol

1000- 4718(2017)08- 1494- 05

2016- 10- 31

2017- 05- 22

武漢科技大學(xué)大學(xué)生科技創(chuàng)新基金(No. 15ZRA167)

R363

A

10.3969/j.issn.1000- 4718.2017.08.024

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△通訊作者 Tel： 18627005258； E-mail： yuanqiong@wust.edu.cn