CD133基因啟動(dòng)子的克隆與序列分析

王曉峰，張?zhí)旆颍瑒?新，劉曉軍

(1.吉林大學(xué)中日聯(lián)誼醫(yī)院 口腔科,吉林 長春130033；2.吉林大學(xué)中日聯(lián)誼醫(yī)院 婦產(chǎn)科)

CD133基因啟動(dòng)子的克隆與序列分析

王曉峰1，張?zhí)旆?，劉 新1，劉曉軍2*

(1.吉林大學(xué)中日聯(lián)誼醫(yī)院 口腔科,吉林 長春130033；2.吉林大學(xué)中日聯(lián)誼醫(yī)院 婦產(chǎn)科)

近些年來，口腔頜面部惡性腫瘤的發(fā)病率逐年增加[1]。雖然目前針對惡性腫瘤的治療手段有了很多新的進(jìn)展,但仍有部分腫瘤患者不能治愈。自從腫瘤干細(xì)胞(CSCs)理論提出后，給腫瘤患者帶來了新的曙光[2]。有研究表明，CD133是某些頭頸部腫瘤干細(xì)胞的表面特異性標(biāo)記[3，4]，我們推測CD133+細(xì)胞可能是頭頸部腫瘤的干細(xì)胞。所以我們克隆了CD133基因的啟動(dòng)子并對其進(jìn)行序列分析，為進(jìn)一步探究CD133基因與腫瘤干細(xì)胞之間的關(guān)系提供新的理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 主要試劑

DH5α菌株和質(zhì)粒，來源于吉林大學(xué)中日聯(lián)誼醫(yī)院科研中心。DNA Marker及限制性內(nèi)切酶SpeI、MluI(日本Takara 公司)。限制性內(nèi)切酶PacⅠ，SalⅠ(英國NEB公司)。Trans2K Plus DNA Marker(上海寶曼生物技術(shù)公司)。Blood gDNA Miniprep Kit(美國Biomiga公司)。引物合成(上海生工技術(shù)有限公司)。

1.2 人CD133基因啟動(dòng)子的克隆

1.2.1 DNA提取及PCR引物設(shè)計(jì) 按試劑盒說明書進(jìn)行外周血細(xì)胞基因組DNA的提取，并電泳鑒定。從Genbank數(shù)據(jù)庫獲得人CD133基因啟動(dòng)子的DNA序列，PCR產(chǎn)物的長度為1 810 bp。設(shè)計(jì)引物如下：

上游引物： 5’-GTAGTCGACCTTCAGTGCCTCTTTCAGT-3’；下游引物5’-GCCTTAATTAAGTGGGGATCTGCCTCAGTC-3’。

1.2.2 PCR反應(yīng) 以人外周血基因組DNA為模板進(jìn)行PCR反應(yīng)，反應(yīng)產(chǎn)物經(jīng)電泳鑒定。進(jìn)行PCR產(chǎn)物的回收，產(chǎn)物電泳鑒定后于-20℃保存。

1.2.3 DH5α感受態(tài)細(xì)菌的制備及CD133基因啟動(dòng)子PCR產(chǎn)物TA克隆 制備DH5α感受態(tài)細(xì)菌， -80℃保存。進(jìn)行CD133基因啟動(dòng)子PCR產(chǎn)物的T-A連接，16℃，30 min。

1.2.4 重組質(zhì)粒的提取 將TA連接產(chǎn)物進(jìn)行轉(zhuǎn)化，進(jìn)行重組質(zhì)粒的提取，電泳鑒定。

1.2.5 重組質(zhì)粒的酶切鑒定 對提取的重組質(zhì)粒pMD18-pCD133進(jìn)行酶切，電泳鑒定。

1.2.6 重組質(zhì)粒測序鑒定 將酶切鑒定的重組質(zhì)粒進(jìn)行擴(kuò)增，進(jìn)行DNA測序。

2 結(jié)果

2.1 人CD133基因啟動(dòng)子克隆的PCR結(jié)果

PCR產(chǎn)物經(jīng)電泳檢測，可看到一清晰的擴(kuò)增帶出現(xiàn)在1 810 bp附近，符合設(shè)計(jì)的人CD133基因啟動(dòng)子的長度，電泳結(jié)果見圖1。

1：人CD133基因啟動(dòng)子PCR產(chǎn)物; M：DNA marker D2000

2.2 酶切鑒定重組質(zhì)粒pMD18-CD133的結(jié)果

應(yīng)用限制性內(nèi)切酶PacⅠ和SalⅠ-HF雙酶切質(zhì)粒pMD18-CD133，酶切產(chǎn)物經(jīng)電泳鑒定，在1 810 bp附近出現(xiàn)與CD133啟動(dòng)子片段長度相符的電泳帶，酶切結(jié)果見圖2。

2.3 CD133的測序結(jié)果

應(yīng)用Blast軟件進(jìn)行測序，結(jié)果見圖3。

1：重組質(zhì)粒pMD18-pCD133 ；M：DNA marker 2000;2：pMD18-pCD133經(jīng)PacⅠ和SalⅠ-HF雙酶切

圖2 酶切鑒定pMD18-pCD133瓊脂糖凝膠電泳圖譜

3 討論

現(xiàn)階段針對口腔頜面部惡性腫瘤的治療手段越來越多，但治療效果仍然不理想,復(fù)發(fā)率和轉(zhuǎn)移率依然很高。腫瘤干細(xì)胞理論的報(bào)道[2]給我們帶來曙光。尋找腫瘤細(xì)胞表面特異性標(biāo)記物,通過篩選腫瘤干細(xì)胞,將會為進(jìn)一步研究腫瘤發(fā)生、發(fā)展和預(yù)后帶來新的希望。目前研究表明,CD133 可能是很多腫瘤干細(xì)胞的表面標(biāo)志。因此我們進(jìn)行了CD133基因啟動(dòng)子的克隆及序列分析，為進(jìn)一步探究CD133基因的調(diào)控機(jī)制提供新的理論依據(jù)。

圖3 重組克隆質(zhì)粒pMD18-T-CD133測序圖

[1]Parkin DM,Bray F,Ferlay J,et al. Global cancer statistics,2002[J]. CA Cancer J Clin,2005,55(2):74.

[2]Mackillop WJ，Ciampi A，Till JE，et al．A stem cellmodel of human tumor growth， implications for tumor cell clonogenicassays[J]．Journal of the national cancer institute，1983，70:9．

[3]Zhou L,Wei X,Cheng L,et al. CD133,one of the markers of cancer stem cells in Hep-2 cell line[J].Laryngoscope,2007,117(3):455.

[4]Moon Y,Kim D,Sohn H,et al.Effect of CD133 overexpression on the epithelial-to-mesenchymal transition in oral cancer cell lines[J].Clin Exp Metastasis,2016,33(5):487.

吉林省教育廳“十三五”科學(xué)技術(shù)項(xiàng)目(JJKH20170822KJ) 吉林省直衛(wèi)生專項(xiàng)項(xiàng)目(sczsy201525)

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