重度創(chuàng)傷后鋅和腦干NMDA受體與MODS死亡機(jī)制關(guān)系

周永翠,王廣歡,王 典,于曉軍,呂俊耀,湯 暢

(汕頭大學(xué)醫(yī)學(xué)院 1.第一附屬醫(yī)院;2.第二附屬醫(yī)院;3.法醫(yī)學(xué)教研室,廣東 汕頭515041)

*通訊作者

重度創(chuàng)傷后鋅和腦干NMDA受體與MODS死亡機(jī)制關(guān)系

周永翠1,王廣歡2*,王 典3,于曉軍3,呂俊耀3,湯 暢3

(汕頭大學(xué)醫(yī)學(xué)院 1.第一附屬醫(yī)院;2.第二附屬醫(yī)院;3.法醫(yī)學(xué)教研室,廣東 汕頭515041)

目的 探討重度創(chuàng)傷引發(fā)的微量元素鋅急性缺乏與多器官功能障礙綜合征(MODS)及其死亡機(jī)制的關(guān)系。方法 建立重度創(chuàng)傷兔模型，檢測腦干NMDA受體、血生化、血清和腦鋅。結(jié)果 傷后12 h，腦和腦干中鋅增高，但血鋅濃度下降明顯。在腦干背側(cè)區(qū)，NR1在傷后6 h內(nèi)增高隨后下降，NR2A在傷后12 h降至最低點(diǎn)。腦干NR2B水平在死亡組最低。血鋅離子與腦干腹側(cè)區(qū)，背側(cè)區(qū)以及網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的NR2A、NR2B呈正相關(guān)(P<0.05)。腦干鋅與只與腹側(cè)，背側(cè)與網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)NR2A變化呈負(fù)相關(guān)(P<0.05)。結(jié)論 重傷可致血鋅急性降低，氧化應(yīng)激增強(qiáng)，引起NMDA受體的改變導(dǎo)致神經(jīng)細(xì)胞的神經(jīng)毒性，這可能是重度創(chuàng)傷MODS發(fā)生的機(jī)制之一。

多器官功能衰竭；NMDA；鋅

(ChinJLabDiagn,2017,21:1412)

嚴(yán)重的創(chuàng)傷會(huì)導(dǎo)致全身性病理生理反應(yīng)，嚴(yán)重的可以引起全身炎癥反應(yīng)綜合征(SIRS) 、 休克和多器官功能障礙綜合征(MODS)包括死亡。外傷引起的繼發(fā)MODS或死亡機(jī)制并不完全清楚。微量元素與抗氧化相關(guān)酶的急劇變化，是多器官功能衰竭(MOF)甚至死亡的重要機(jī)制[1]。目前，氧化應(yīng)激和/或興奮性毒性被認(rèn)為是神經(jīng)毒素?fù)p傷[2]的最后共同通路。作為特異性興奮性氨基酸受體NMDA受體是興奮性毒性的主要神經(jīng)通路。它在各種急、慢性腦損傷中起重要作用，尤其在腦干，因?yàn)樗嗽S多重要的生命中樞核。因此，我們應(yīng)用創(chuàng)傷后MODS模型探討鋅和腦干NMDA受體變化，了解創(chuàng)傷后MODS及其死亡的可能機(jī)制。

1 材料與實(shí)驗(yàn)方法

1.1 動(dòng)物模型建立及分組

1.1.1 創(chuàng)傷模型建立 新西蘭家兔40只，體重2-2.5 kg。每只兔子每天喂40 g濃縮飼料，每千克飼料含40 g鋅。創(chuàng)傷程度采用創(chuàng)傷定級和創(chuàng)傷嚴(yán)重度分級(AIS-ISS)。將家兔固定后：①反復(fù)過度擰絞右膝關(guān)節(jié)，完全性撕碎膝關(guān)節(jié)后十字韌帶，膝關(guān)節(jié)脫位癱軟(AIS 840406.3)；②左肘關(guān)節(jié)上1.5 cm處鉗夾致肱骨閉合性粉碎骨折(AIS 752804.3)；③左側(cè)股骨下段膝關(guān)節(jié)上1.5 cm處鉗夾致股骨下段閉合性粉碎骨折(AIS 8518143.3)。損傷總評分ISS=32+32+32=27。

1.1.2 實(shí)驗(yàn)分組 ①正常對照組8只；②重傷6 h組8只；③重傷12 h組8只；④重傷3 d組8只；⑤傷后超過24 h死亡的家兔為死亡組8只。

1.2 取材和檢測方法

兔深麻醉(戊巴比妥鈉腹腔注射，100 mg/kg)。兔頸動(dòng)脈急性出血處死。各組家兔按創(chuàng)傷后6 h、12 h和3 d定時(shí)并頸靜脈采血。重傷組家兔分別隨機(jī)于傷后6 h、12 h、3 d，頸動(dòng)脈放血快速處死，各時(shí)間點(diǎn)8只，立即取腦干組織，用于組織切片。

應(yīng)用原子吸收光譜法檢測家兔血清、大腦及腦干組織微量元素Zn含量。血常規(guī)及生化檢測：全自動(dòng)生化分析儀檢測血清白蛋白、球蛋白、BUN、Cr。免疫組織化學(xué)檢測腦干NR1、NR2A、NR2B表達(dá)，Image-Pro Plus 6.0 測定受體的含量。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 血生化檢測

創(chuàng)傷各組的生化指標(biāo)較對照組有顯著性改變。實(shí)驗(yàn)組血清ALB、GLB水平傷后明顯降低(P<0.05)；BUN、Cr水平傷后明顯增加，并在死亡組中達(dá)到峰值(P<0.05；表1)。

表1 各組中ALB,GLB,Cr 和 BUN測定

*與正常組相比P<0.05

2.2 腦干NR1、NR2A、NR2B免疫組化檢測

在腦干背側(cè)損傷后6 h，NR1水平均高于對照組，但在傷后12 h，NR1較傷后6 h明顯下降，傷后3天接近基礎(chǔ)水平。死亡組中NR1水平比正常組低。重傷組和死亡組中NR2A水平較低，且低于正常組，死亡組水平最低。重傷組NR2B水平低于對照組；但重傷各組差異不明顯，重傷組水平顯著高于死亡組(圖1)。

圖1 各實(shí)驗(yàn)組中腦干NR1,NR2A和NR2B的變化。資料采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差；n=8,與對照組相比 (*,#,& ,P<0.05).

2.3 血清，腦和腦干鋅

與正常組相比，傷后6 h血清鋅水平下降，傷后12 h繼續(xù)下降，然而傷后3天增加。腦和腦干中鋅含量在傷后6 h增加，傷后3天持續(xù)增加(圖2)。

圖2 重度創(chuàng)傷后血清、腦和腦干鋅的變化。資料采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差；n=8,與對照組相比 (*,#,& ,P<0.05).

2.4 鋅和腦干NR1，NR2A和NR2B的表達(dá)水平之間的相關(guān)性

血清鋅與腦干背側(cè)NR2A(r=0.629，P<0.05)和NR2B(r= 0.696，P<0.05)的變化呈正相關(guān)。腦鋅與腦干背側(cè)NR2A表達(dá)呈負(fù)相關(guān)(r=-0.702，P<0.05)。腦鋅與腦干背側(cè)NR2B的表達(dá)呈負(fù)相關(guān)(r=-0.568，P<0.05)。腦干鋅水平與腦干背側(cè)NR2A表達(dá)呈負(fù)相關(guān)(r=-0.616，P<0.05)。

3 討論

3.1 鋅與創(chuàng)傷后氧化應(yīng)激反應(yīng)的相關(guān)性

嚴(yán)重創(chuàng)傷可導(dǎo)致炎癥介質(zhì)和炎性細(xì)胞因子的釋放，引起SIRS和氧化應(yīng)激。氧化應(yīng)激理論在神經(jīng)毒性機(jī)制研究中具有重要地位，它可以解釋神經(jīng)損傷和延遲效應(yīng)的積累。本實(shí)驗(yàn)中，血清鋅明顯下降，傷后12 h后繼續(xù)下降。在重傷和死亡組鋅在損傷后3天持續(xù)在較低水平，表明嚴(yán)重的創(chuàng)傷可能會(huì)導(dǎo)致血清鋅急性下降[3]。在嚴(yán)重創(chuàng)傷后腦、腦干組織中鋅含量逐漸增加，顯著高于死亡組，但低于存活組。鋅在抗氧化系統(tǒng)中起著重要的作用，腦組織在一定程度上可以繼續(xù)重新分配鋅，可提高抗氧化能力[4]。

3.2 嚴(yán)重創(chuàng)傷后與興奮性毒性密切相關(guān)NMDA受體的變化和意義

在神經(jīng)損傷中，除氧化應(yīng)激外，還有興奮性神經(jīng)毒性。興奮性毒性是由各種氧自由基和炎癥介質(zhì)刺激谷氨酸引起的。其中，NMDA受體是主要的受體。臨床上，在腦缺血、創(chuàng)傷性腦損傷發(fā)生時(shí)與NMDA受體密切相關(guān)。

NR1是離子型谷氨酸受體家族的重要成員，其作用受谷氨酸介導(dǎo)；生理?xiàng)l件下NR1起重要的作用[5]。本實(shí)驗(yàn)，在腦干背側(cè)傷后6 h NR1的含量較高，傷后3天恢復(fù)。表明，傷后機(jī)體通過代償機(jī)制操縱NMDA受體亞單位，造成這時(shí)期中樞興奮性氨基酸毒性增強(qiáng)[6]。本結(jié)果與神經(jīng)元缺血缺氧通過NMDA受體的激活導(dǎo)致大腦受損的最終結(jié)果是一致的。

另外，傷后NR2有顯著的變化。NR2A和2B是2種調(diào)節(jié)蛋白亞基。推測，在創(chuàng)傷后調(diào)節(jié)亞基的減少，減少了對受體活性的結(jié)合位點(diǎn)的抑制作用，抑制結(jié)合可能會(huì)減少，導(dǎo)致最終抑制減少。已證實(shí)，在大鼠腦內(nèi)NR2A和NR2B的表達(dá)之間的差異，為NMDA受體表達(dá)在腦組織不同的時(shí)間和不同的地點(diǎn)的表達(dá)提供了分子基礎(chǔ)[7]。我們發(fā)現(xiàn)，NR2A和2B與血清鋅水平變化高度相關(guān)表明，作為調(diào)節(jié)蛋白成分，它們對環(huán)境更敏感，特別是外周創(chuàng)傷后等強(qiáng)的刺激[8]。

血液鋅與腦干中NR1水平不相關(guān)，最有可能是由于血鋅丟失增加，攝入減少和再分配。此外，NR1是一個(gè)含量大的功能單元，特別是在代償期更容易受到大的影響。基于腦和腦干鋅與NR2A和2B的表達(dá)相關(guān)，我們推測，嚴(yán)重創(chuàng)傷后NR2不需要抑制就能達(dá)到明顯的抑制效果。腦鋅的急劇增加滿足了這一要求。鋅和腦干NR2A和2B的相關(guān)性表明鋅在大腦中抑制NR2A具有較好的親和力。

嚴(yán)重創(chuàng)傷后急性鋅缺乏，抗氧化活性降低，NMDA受體活性改變，導(dǎo)致興奮性神經(jīng)毒性增強(qiáng)，導(dǎo)致腦干實(shí)質(zhì)性損害，可能是重度創(chuàng)傷MODS發(fā)生的機(jī)制之一。

[1]王 典,王海鵬,于 文,等.重傷家兔體內(nèi)Cu及代謝酶變化與MOF及死亡關(guān)系[J].中國法醫(yī)學(xué)雜志,2011,26(4):261.

[2]祝衛(wèi)國,陳學(xué)敏.氧化應(yīng)激、興奮性毒性與神經(jīng)毒性[J].國外醫(yī)學(xué),衛(wèi)生學(xué)分冊,1999,26(5):296.

[3]Wang BH,Yu XJ,Wang D et al.Alterations of trace elements (Zn,Se,Cu,Fe) and related metalloenzymes in rabbit blood after severe trauma[J].J Trace Elem Med Biol,2007,21(2):102.

[4]孫亞蒙,陳 鶯,林 巖,等.卒中和短暫性缺血發(fā)作患者的卒中預(yù)防指南:美國心臟協(xié)會(huì)/美國卒中協(xié)會(huì)指南[J].神經(jīng)病學(xué)與神經(jīng)康復(fù)學(xué)雜志,2014,11(2):61.

[5]白 暉,張 明,張 煒.谷氨酸受體輔助亞單位的研究進(jìn)展[J].神經(jīng)藥理學(xué)報(bào),2015,5(2):24.

[6]Ling W,Chang L,Song Y,et al.Immunolocalization of NR1,NR2A,and PSD-95 in rat hippocampal subregions during postnatal development[J].Acta Histochem,2012,114(3):285.

[7]楊一萍,駱 媛,王永安,等.腦缺血再灌注損傷大鼠大腦皮質(zhì) NR2A 及 NR2B 受體表達(dá)變化[J].中國藥理學(xué)與毒理學(xué)雜志,2012,26(2):157.

[8]張秦喆,王 瑞,董振宇,等.谷氨酸受體調(diào)控樹突棘形態(tài)可塑性的研究進(jìn)展[J].現(xiàn)代生物醫(yī)學(xué)進(jìn)展,2016,16(10):1984.

Relationship between zinc and brain stem NMDA receptor activity and death mechanism of MODS after severe trauma

ZHOUYong-cui1,WANGGuang-huan2*，WANGDian3,etal.

(1.TheFirstAffiliatedHospitalofShantouUniversityMedicalCollege,Shantou515041,China；2.TheSecondAffiliatedHospitalofShantouUniversityMedicalCollege.3.DepartmentofForensicMedicine,ShantouUniversityMedicalCollege)

Objective To investigate the relationship between acute zinc deficiency caused by severe trauma and multiple organ dysfunction syndromes (MODS) and its mechanism.Methods A severe traumatic rabbit model was established.Zinc and serum biochemical profiles were determined.Results Immunohistochemistry was used to detect brainstem NR1,NR2A,and NR2B in severe trauma.Brain and brainstem Zn increased at 12 h,but serum Zn decreased dramatically after trauma.NR1 in the dorsal brainstem increased at 6 h after injury and then decreased.NR2A in the dorsal regions decreased to a plateau at 12 h after trauma.NR2B were lowest in the death group in the brainstem.Serum zinc was positively correlated with NR2A and 2B and negatively correlated with zinc in the brain (P<0.05).Correlations were also found between the brainstem NR2A and that of the dorsal brainstem,as well as between brainstem NR2A and changes in NR2B.There was a negative correlation between zinc and NR2A (P<0.05).Conclusion Severe trauma led to an acute reduction of zinc enhancing oxidative stress and the changes of NMDAR causing the neurotoxicity of the nerve cells.This may be a mechanism for the occurrence of MODS or death after trauma.

Multiple Organ Failure；N-Methyl-D-Aspartate,Zinc

1007-4287(2017)08-1412-03

R651.1

A

周永翠(1979-)，女，博士，副主任技師，研究方向：病理與病理生理。

2016-09-20)