蛋白芯片技術(shù)與其他4種檢測方法對結(jié)核病診斷價值的比較

馮英凱 王勇 黃正谷 趙小莉 劉英

·論著·

蛋白芯片技術(shù)與其他4種檢測方法對結(jié)核病診斷價值的比較

馮英凱1王勇2黃正谷3趙小莉3劉英4

目的通過比較分析，評估蛋白芯片技術(shù)對結(jié)核病的診斷價值。方法選擇655例結(jié)核病患者按病變部位分為肺結(jié)核組、肺外結(jié)核組和肺結(jié)核并肺外結(jié)核組，以非結(jié)核患者作為對照。應(yīng)用蛋白芯片技術(shù)、γ-干擾素釋放試驗(TB-IGRA)、TB DNA的PCR檢測法(TB-PCR)、集菌涂片法、結(jié)核菌培養(yǎng)法5種檢測方法對各組樣本進行同步平行檢測，并比較蛋白芯片技術(shù)與其他4種方法的檢測陽性率、靈敏度、特異度等。結(jié)果上述5種檢測方法在結(jié)核組的陽性率均顯著高于非結(jié)核對照組，結(jié)核組和非結(jié)核對照組分別為66.26%、16.53%(蛋白芯片技術(shù))；91.30%、10.08%(TB-IGRA)；67.02%、30.24%(TB-PCR)；25.04%、0.00%(集菌涂片法)；25.65%、0.00%(結(jié)核菌培養(yǎng)法)，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義。蛋白芯片技術(shù)對結(jié)核的檢出陽性率及靈敏度顯著高于集菌涂片法和結(jié)核菌培養(yǎng)法，與TB-PCR檢測陽性率類似，顯著低于TB-IGRA。蛋白芯片技術(shù)的特異度及陽性預(yù)測值顯著高于TB-PCR，顯著低于集菌涂片法和結(jié)核菌培養(yǎng)；特異度與TB-IGRA類似，陽性預(yù)測值顯著低于TB-IGRA；陰性預(yù)測值與TB-PCR陽性率類似，顯著高于集菌涂片法和結(jié)核菌培養(yǎng)法，顯著低于TB-IGRA，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。結(jié)論蛋白芯片技術(shù)和TB-IGRA作為診斷結(jié)核敏感度及特異度均較高的檢測技術(shù)，二者取長補短，優(yōu)勢互補，具有良好的臨床應(yīng)用價值。

結(jié)核??； 蛋白芯片； γ-干擾素釋放試驗； 診斷價值

結(jié)核病嚴(yán)重危害人類健康，是我國重點控制的重大疾病之一，也是全球關(guān)注的公共衛(wèi)生問題和社會問題[1-3]。早發(fā)現(xiàn)、早檢查、早診斷、早治療對確保治療效果和改善病情轉(zhuǎn)歸起關(guān)鍵作用。本研究對蛋白芯片技術(shù)、γ-干擾素釋放試驗(TB-interferon gamma release assay, TB-IGRA)、TB DNA的PCR檢測法(TB-PCR)、集菌涂片法、結(jié)核菌培養(yǎng)法等幾種常用的結(jié)核檢測指標(biāo)進行平行對比分析，旨在評估上述5種檢測方法對結(jié)核病的診斷價值。

資料與方法

一、研究對象

收集2013年7月至2016年7月三年間在重慶市公共衛(wèi)生醫(yī)療救治中心門診及住院的結(jié)核病患者655例及同期248例非結(jié)核病患者病例資料，平均年齡(40.29±18.47)歲，男性372例，女性206例。肺結(jié)核診斷依據(jù)國家衛(wèi)生部《WS288-2008肺結(jié)核診斷標(biāo)準(zhǔn)》，肺外結(jié)核診斷參照文獻[4-5]。研究分為肺結(jié)核組432例、肺外結(jié)核組146例、肺結(jié)核并肺外非結(jié)核組77例和非結(jié)核組對照組248例。其中肺外結(jié)核組包括結(jié)核性胸膜炎94例、結(jié)核性腹膜炎21例、結(jié)核性心包炎4例、結(jié)核性腦膜炎3例、淋巴結(jié)核9例、骨關(guān)節(jié)結(jié)核9例、腎結(jié)核6例；肺結(jié)核并肺外結(jié)核組包括伴結(jié)核性胸膜炎35例、結(jié)核性腹膜炎3例、淋巴結(jié)結(jié)核25例，骨關(guān)節(jié)結(jié)核14例；非結(jié)核對照組包括急性扁桃體炎21例，急性支氣管炎65例，肺炎35例，泌尿系感染40例，慢性支氣管炎13例，慢性阻塞性肺疾病56例，支氣管擴張18例。所有研究對象均無HIV感染、妊娠、使用免疫抑制劑或增強劑。結(jié)核組與非結(jié)核對照組組之間具有可比性。初治行2HRZE/4H3R3方案；觀察期間復(fù)發(fā)者用2SHRZE/6H3R3E3方案治療。治療前留取肺結(jié)核、肺外結(jié)核相應(yīng)標(biāo)本(靜脈血、痰液、胸腔積液、關(guān)節(jié)液等)，分別行蛋白芯片技術(shù)、TB-IGRA、TB-PCR、集菌涂片法、結(jié)核菌培養(yǎng)法同步平行檢測。

二、研究方法

1. 儀器與試劑：PBT-X2蛋白芯片閱讀儀及結(jié)核分支桿菌IgG抗體檢測試劑盒(蛋白芯片) (南京大淵生物技術(shù)工程有限公司)；人TB-IGRA酶聯(lián)免疫分析試劑盒(QuantiFERON-TB Gold)[德國凱杰公司(QIAGEN)]；CFX96實時熒光PCR檢測系統(tǒng)(BIO-RAD，美國)；結(jié)核分支桿菌(tuberculosis, TB)核酸擴增(polymerase chain reaction, PCR)熒光檢測試劑盒(深圳市匹基生物工程有限公司)；羅氏培養(yǎng)基(珠海市銀科醫(yī)學(xué)工程股份有限公司)。

2. 蛋白芯片技術(shù)：遵照結(jié)核分支桿菌IgG抗體檢測試劑盒(蛋白芯片)說明書提供的樣本要求和試驗方法進行操作。

3. TB-IGRA檢測：遵照人TB-IGRA酶聯(lián)免疫分析試劑盒使用說明書進行。結(jié)果判定標(biāo)準(zhǔn)：設(shè)定待測樣品孔(T)含量值=a，空白孔(N)含量值=b，標(biāo)準(zhǔn)孔(P)含量值=c。若b≤400，實驗有意義；當(dāng)a-b≥14，并且≥25%b，不管c-b為任何值，均為陽性；當(dāng)a-b≥14，但<25%b，或<14時，此時c-b≥20均為陰性；若a-b<14，c-b<20或a-b≥14，但<25%b，且c-b<20時，實驗結(jié)果為不確定。最后結(jié)果以陽性、陰性及不確定三種定性方式表達。

4. TB-PCR：痰標(biāo)本在經(jīng)過處理后進行DNA提取，采用聚合酶鏈反應(yīng)方式進行檢查，模板每擴增一次，就會有一次熒光信號產(chǎn)生，通過熒光信號的監(jiān)測確定模板定量。遵照TB PCR熒光檢測試劑盒說明書進行。

5. 集菌涂片法檢測：應(yīng)用萋-尼法進行抗酸染色[6]。

6. 結(jié)核菌培養(yǎng)：應(yīng)用改良羅氏培養(yǎng)法，按《改良羅氏結(jié)核桿菌液體培養(yǎng)基使用說明書》進行。

三、統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS10.0軟件進行統(tǒng)計學(xué)處理。率的比較采用χ2檢驗，P<0.05表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié) 果

一、蛋白芯片技術(shù)與其他4種檢測技術(shù)的陽性率比較

5種檢測方法在結(jié)核組的陽性率均顯著高于非結(jié)核對照組(均P<0.05)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義。蛋白芯片技術(shù)對結(jié)核的檢出陽性率顯著高于集菌涂片法和結(jié)核菌培養(yǎng)法(均P<0.05)，與TB DNA的PCR檢測陽性率類似，顯著低于TB-IGRA(P<0.05)。蛋白芯片技術(shù)與TB-PCR在肺結(jié)核組和肺外結(jié)核組的陽性率差異不顯著。集菌涂片法對肺結(jié)核的檢出率顯著大于肺外結(jié)核(均P<0.05)，見表1。

表1 蛋白芯片技術(shù)與其他4種檢測技術(shù)的陽性率比較

注：與非結(jié)核對照組比較，aP<0.05；與蛋白芯片技術(shù)比較，bP<0.05；與肺外結(jié)核組比較，cP<0.05

二、蛋白芯片技術(shù)與其他方法學(xué)的靈敏度、特異度比較

比較5種方法檢測的靈敏度、特異度、陽性預(yù)測值及陰性預(yù)測值估計值的95%置信區(qū)間，結(jié)果顯示：①蛋白芯片技術(shù)的靈敏度顯著高于集菌涂片法和結(jié)核菌培養(yǎng)法(均P<0.05)，與TB-PCR陽性率類似，顯著低于TB-IGRA(P<0.05)，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義；②蛋白芯片技術(shù)的特異度及陽性預(yù)測值顯著高于TB-PCR(均P<0.05)，顯著低于集菌涂片法和結(jié)核菌培養(yǎng)法(均P<0.05)；特異度與TB-IGRA類似，陽性預(yù)測值顯著低于TB-IGRA；③蛋白芯片技術(shù)的陰性預(yù)測值與TB-PCR陽性率類似，顯著高于集菌涂片法和結(jié)核菌培養(yǎng)法，顯著低于TB-IGRA，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(均P<0.05)，見表2。

表2 蛋白芯片技術(shù)與其他方法學(xué)檢測的靈敏度、特異度比較

注：與蛋白芯片技術(shù)比較，aP<0.05

三、蛋白芯片技術(shù)與TB-IGRA在肺結(jié)核組和肺外結(jié)核組的靈敏度、特異度比較

通過統(tǒng)計學(xué)分析蛋白芯片技術(shù)與TB-IGRA 2種方法在肺結(jié)核組和肺外結(jié)核組的檢測靈敏度、特異度、陽性預(yù)測值、陰性預(yù)測值及約登指數(shù)估計值的95%置信區(qū)間，結(jié)果顯示：無論對肺結(jié)核還是肺外結(jié)核，蛋白芯片技術(shù)對結(jié)核檢出的靈敏度、陽性預(yù)測值、陰性預(yù)測值及約登指數(shù)均顯著低于TB-IGRA法的對應(yīng)檢測(均P<0.05)；2種方法對肺結(jié)核組和肺外結(jié)核檢出的特異度類似，差異無統(tǒng)計學(xué)意義，見表3。

表3 蛋白芯片技術(shù)與TB-IGRA的靈敏度、特異度比較

注：與蛋白芯片技術(shù)比較，aP<0.05

討 論

盡管目前診斷結(jié)核病的技術(shù)方法和指標(biāo)眾多，但仍缺乏方便、快捷、有效、價廉的判斷方法和指標(biāo)，主要依賴多指標(biāo)檢測及臨床綜合評估。傳統(tǒng)的檢測手段如影像學(xué)檢查和痰菌(涂片或培養(yǎng))檢查分別存在客觀性差、滯后性(時效性差)、陽性率低(敏感度差)等缺陷。 選擇一種或幾種特異性強、敏感度高，并與涂片陽性結(jié)果有良好相關(guān)性的實驗室指標(biāo)，能更好、更快地早期診斷結(jié)核病，從而采用最佳治療方案，改善結(jié)核預(yù)后、提高治愈率已成為當(dāng)前研究的方向。近年來，有許多免疫學(xué)、分子生物學(xué)試驗用于結(jié)核病的早期診斷，如RNA恒溫擴增實時檢測技術(shù)應(yīng)用于病原體的核酸診斷等，而蛋白芯片技術(shù)及干擾素釋放試驗尤其值得關(guān)注[7-10]。

本研究應(yīng)用蛋白芯片技術(shù)、TB-IGRA、TB-PCR、集菌涂片法、結(jié)核菌培養(yǎng)法對肺結(jié)核組、肺外結(jié)核組和肺結(jié)核并肺外結(jié)核組、非結(jié)核對照組等各組樣本進行同步平行檢測，并比較蛋白芯片技術(shù)與其他4種方法的檢測陽性率、靈敏度、特異度等。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，上述5種檢測方法在結(jié)核組的陽性率均顯著高于非結(jié)核對照組，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義。蛋白芯片技術(shù)對結(jié)核的檢出陽性率及靈敏度顯著高于集菌涂片法和結(jié)核菌培養(yǎng)法，與TB-PCR檢測陽性率類似，顯著低于TB-IGRA。蛋白芯片技術(shù)的特異度及陽性預(yù)測值顯著高于TB-PCR，顯著低于集菌涂片法和結(jié)核菌培養(yǎng)法；特異度與TB-IGRA類似，陽性預(yù)測值顯著低于TB-IGRA；陰性預(yù)測值與TB-PCR陽性率類似，顯著高于集菌涂片法和結(jié)核菌培養(yǎng)法，顯著低于TB-IGRA，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié)核分支桿菌相對分子質(zhì)量16×103蛋白、38×103蛋白及脂阿拉伯甘露聚糖LAM 3種抗原均為結(jié)核分支桿菌特異性較高的抗原，具有較強的免疫原性，適用于結(jié)核病的血清學(xué)診斷。一般免疫學(xué)診斷方法大都采用上述抗原之一，而蛋白芯片技術(shù)同時用上述3種抗原進行檢測，系將上述3種抗原同時固定在微孔濾膜載體上，捕捉被檢樣品中特異性抗體，抗原-抗體反應(yīng)形成的抗原-抗體復(fù)合物，再與膠體金標(biāo)記的兔抗人IgG結(jié)合，在膜上形成紫紅色斑點。通過芯片識別系統(tǒng)分析結(jié)果，實現(xiàn)了上述3種抗體的同步檢測，其中一種陽性即確定檢測結(jié)果為陽性。該方法提高了檢測的陽性率，具有高通量、高靈敏度、高特異性且微型化的特點，整個檢測過程不超過30 min。

蛋白芯片技術(shù)研究多集中于通過檢測結(jié)核菌抗體實現(xiàn)結(jié)核病早期診斷，具有簡便、快速、準(zhǔn)確，敏感性較高、特異性強和檢測成本低等優(yōu)點，是臨床輔助診斷結(jié)核病的有效方法，并作為結(jié)核病耐藥檢測試驗，在臨床上已得到廣泛應(yīng)用[11-16]。

TB-IGRA測定原理系應(yīng)用雙抗體夾心法測定人結(jié)核分支桿菌γ-干擾素水平。用純化的人結(jié)核分支桿菌γ-干擾素抗體包被微孔板，制成的固相抗體與標(biāo)本中TB-IGRA結(jié)合，后者再與HRP標(biāo)記的結(jié)核分支桿菌γ-干擾素抗體結(jié)合，形成抗體-抗原-酶標(biāo)抗體復(fù)合物，洗滌后加底物TMB顯色。測定450 nm波長下吸光度(OD值)，通過標(biāo)準(zhǔn)曲線計算樣品中人結(jié)核分支桿菌γ-干擾素濃度。根據(jù)判定標(biāo)準(zhǔn)確定為陽性或陰性。

盡管有研究表明TB-IGRA對于診斷兒童肺結(jié)核的敏感度具有一定參考價值，但TB-IGRA單獨用于診斷活動性結(jié)核病尚缺乏充足的臨床證據(jù)支持。TB-IGRA診斷活動性結(jié)核敏感度高于結(jié)核菌素(old tuberculin, OT)、純蛋白衍生物皮試(pure protein derivative skin test, PPD)，但其特異度較低，會導(dǎo)致部分患者被誤診為活動性結(jié)核。

綜上所述，蛋白芯片技術(shù)和TB-IGRA作為診斷結(jié)核敏感度及特異度均較高的檢測技術(shù)，二者取長補短，優(yōu)勢互補，優(yōu)于其他檢測方法，具有良好的診斷價值，并可用作抗結(jié)核療效監(jiān)測的備選方法。

1 楊春娥, 馮喜英. 結(jié)核病易感基因的研究現(xiàn)狀[J/CD]. 中華肺部疾病雜志(電子版), 2016, 9(2): 207-209.

2 龔新記, 李月華, 姚麗丹, 等. MLVA用于新疆部分地區(qū)結(jié)核分枝桿菌基因分型的初步研究[J/CD]. 中華肺部疾病雜志(電子版), 2017, 10(3): 304-308.

3 Mesquita ED, Gil-Santana L, Ramalho D, et al. Associations between systemic inflammation, mycobacterial loads in sputum and radiological improvement after treatment initiation in pulmonary TB patients from Brazil: a prospective cohort study[J]. BMC Infec Dis, 2016, 16: 368.

4 江紅, 臧國慶. 肺外結(jié)核[J]. 中華全科醫(yī)學(xué), 2012, 10(1): 103-104.

5 許紹發(fā), 端木宏謹(jǐn). 肺外結(jié)核的診斷和治療[J]. 中華結(jié)核和呼吸雜志, 1997, 20(3): 131-132.

6 陸震宇, 楊明芳, 陳緯. 結(jié)核病實驗室診斷技術(shù)評價及其研究進展[J]. 中國衛(wèi)生檢驗雜志, 2017, 27(2): 301-304.

7 申明莉, 王玉華. SAT技術(shù)用于快速檢測肺結(jié)核的臨床意義[J]. 中國繼續(xù)醫(yī)學(xué)教育, 2016, 8(9): 18-20.

8 王靜, 劉立賓, 岳永寧, 等. RNA恒溫擴增實時檢測技術(shù)與熒光定量PCR聯(lián)合檢測肺泡灌洗液對痰涂陰性肺結(jié)核的快速診斷價值[J]. 中華醫(yī)院感染學(xué)雜志, 2017, 27(2): 300-304.

9 王長征, 張平安, 梅冰, 等. γ-干擾素釋放試驗在肺結(jié)核診斷中的應(yīng)用[J]. 公共衛(wèi)生與預(yù)防醫(yī)學(xué), 2015, 26(1): 49-52.

10 李鋒, 盧水華. γ干擾素釋放試驗在兒童結(jié)核病和潛伏結(jié)核感染中的診斷價值[J]. 中國防癆雜志, 2015, 37(7): 732-735.

11 何啟軍, 姚敏, 吳多榮. 蛋白芯片技術(shù)診斷結(jié)核病的評價[J]. 中國熱帶醫(yī)學(xué), 2010, 10(5): 523-524.

12 張立群, 王云霞, 周敏, 等. 4種不同結(jié)核分支桿菌檢測方法對結(jié)核病的診斷價值比較[J]. 中華醫(yī)院感染學(xué)雜志, 2010, 20(11): 1633-1635.

13 吳友根, 楊興萍, 王軍, 等. 結(jié)核蛋白芯片檢測診斷結(jié)核病的價值[J]. 中國感染與化療雜志, 2014, 3: 196-198.

14 張仁卿, 鄧長國. 結(jié)核蛋白芯片檢測對結(jié)核病的診斷價值[J]. 四川醫(yī)學(xué), 2016, 37(10): 1140-1143.

15 Zhu L, Liu Q, Martinez L, et al. Diagnostic value of GeneChip for detection of resistantMycobacteriumtuberculosisin patients with differing treatment histories[J]. J Clin Microbiol, 2015, 53(1): 131-135.

16 杜秀然, 李春霞, 劉銳, 等. 結(jié)核生物蛋白芯片技術(shù)對肺結(jié)核的診斷價值[J]. 河北醫(yī)藥, 2015, 1: 40-42.

(本文編輯：張大春)

馮英凱，王勇，黃正谷，等. 蛋白芯片技術(shù)與其他4種檢測方法對結(jié)核病診斷價值的比較[J/CD]. 中華肺部疾病雜志(電子版)， 2017， 10(4)： 427-430.

Comparative analysis of clinical values of protein chip technique and other 4 detection methods for the diagnosis of tuberculosis

FengYingkai1,WangYong2,HuangZhenggu3,ZhaoXiaoli3,LiuYing4.

1DepartmentofRespiratoryMedicine,DaomenkouBranch,ChongqingHospitalofTraditionalChineseMedicine,Chongqing400011China;2GeneralInternalDepartment,ChongqingInfectiousDiseaseMedicalCenter,Chongqing400036China;3DepartmentofLaboratoryMedicine,ChongqingInfectiousDiseaseMedicalCenter,Chongqing400036China;4ChongqingTuberculosisControlCenter,Chongqing400050China

Correspondingauthor：FengYingkai,Email:fykme@163.com

Objective To evaluate the value of protein chip technique in the diagnosis of tuberculosis by comparative analysis. Methods According to lesion distribution, a total of 655 patients with tuberculosis were divided into three groups: pulmonary tuberculosis group, extrapulmonary tuberculosis group, and pulmonary&extrapulmonary tuberculosis group, with non-tuberculosis patients as the control group. Protein chip technique, TB-interferon gamma release assay (TB-IGRA), PCR assay for TB DNA(TB-PCR), bacteria-collecting smear method and bacterial culture method were applied to synchronous parallel detection for each group of samples. The positive detection rate, sensitivity and specificity of protein chip technique were compared with those of other 4 kinds of methods. Results The results showed that the positive rates of the 5 detection methods in tuberculosis group were significantly higher than those in non-tuberculosis control group. control group, 66.26%vs. 16.53% (protein chip technique); 91.30%vs. 10.08% (TB-IGRA); 67.02%vs. 30.24% (TB-PCR); 25.04%vs. 0% (bacteria-collecting smear method); and 25.65%vs. 0% (bacterial culture method). The differences were statistically significant (P<0.05). The positive rate and sensitivity of the detection of tuberculosis by protein chip technique was significantly higher than that of bacteria-collecting smear method and culture method, and the positive rate of TB detection was similar to that of TB-PCR, which was significantly lower than that of TB-IGRA. The specificity and positive predictive value of protein chip technique were significantly higher than those of TB-PCR, significantly lower than those of bacteria-collecting smear method and bacterial culture. As compared with TB-IGRA, protein chip technique was similar in specificity, positive predictive value was significantly lower. The negative predictive value of protein chip technique was significantly higher than that of TB-PCR, smear and bacterial culture, significantly lower than that of TB-IGRA, and the differences were statistically significant (P<0.05). Conclusion As the diagnostic techniques of tuberculosis with higher sensitivity and higher specificity, protein chip technique and TB-IGRA have complementary advantages and a good clinical application value.

Tuberculosis; Protein chip; Interferon gamma release assay; Diagnosis value

10.3877/cma.j.issn.1674-6902.2017.04.012

重慶市衛(wèi)生和計劃生育委員會醫(yī)學(xué)科研重點項目(2013-1-038)

400011 重慶，重慶市中醫(yī)院道門口院部呼吸內(nèi)科1400036 重慶，重慶市公共衛(wèi)生醫(yī)療救治中心普內(nèi)科2、檢驗科3400050 重慶，重慶市結(jié)核病防治所4

馮英凱， Email：fykme@163.com

R562

A

2017-05-12)