葫蘆素E聯(lián)合順鉑或紫杉醇治療非小細(xì)胞肺癌的體外研究

楊 艷，李 嵚，溫艷惠，郭海梅

葫蘆素E聯(lián)合順鉑或紫杉醇治療非小細(xì)胞肺癌的體外研究

楊 艷1，李 嵚2，溫艷惠1，郭海梅1

目的：體外觀察葫蘆素E（CuE）聯(lián)合順鉑（DDP）或紫杉醇（PTX）對非小細(xì)胞肺癌A549和H460細(xì)胞增殖的抑制作用。方法：采用MTT法檢測CuE、DDP、PTX單獨(dú)應(yīng)用及CuE聯(lián)合DDP或PTX對A549和H460細(xì)胞增殖的抑制作用。并采用CHOU-TALALAY聯(lián)合指數(shù)法對藥物聯(lián)合應(yīng)用的效果進(jìn)行判定。結(jié)果：藥物單用及CuE分別與DDP、PTX應(yīng)用對A549和H460細(xì)胞的增殖均有抑制作用，藥物合用時(shí)的中效濃度與單用時(shí)比較有不同程度的降低。CuE與DDP合用，對于A549細(xì)胞，表現(xiàn)為協(xié)同作用(CI＜I)；對于H460細(xì)胞，大部分效應(yīng)范圍(0＜fa＜72%)為協(xié)同作用(CI＜I)。CuE與PTX合用，對于A549細(xì)胞，在較低效應(yīng)范圍(0＜fa＜14%)時(shí)為協(xié)同作用(CI＜I)，在中高效應(yīng)范圍(14%＜fa＜100%)時(shí)則表現(xiàn)為拮抗作用(CI＞I)；對于H460細(xì)胞，同樣在較低效應(yīng)范圍(0＜fa＜28%)時(shí)為協(xié)同作用(CI＜I)，在中高效應(yīng)范圍(28%＜fa＜100%)時(shí)則表現(xiàn)為拮抗作用(CI＞I)。結(jié)論：藥物聯(lián)合應(yīng)用的效果在不同非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞株之間存在差異，合理的聯(lián)合用藥可大大減少兩種藥物各自的用量，從而降低藥物的毒副作用。

葫蘆素E；順鉑；紫杉醇，非小細(xì)胞肺癌；細(xì)胞增殖

肺癌是臨床常見惡性腫瘤之一，是人類發(fā)病率和死亡率最高的惡性腫瘤之一[1]。盡管治療方法不斷改進(jìn)，其5年生存率仍不超過16%[2]。大約70%的患者在診斷時(shí)已發(fā)展至晚期，無法通過手術(shù)治愈，所以化療在肺癌治療中占有重要地位，但是腫瘤細(xì)胞對化療藥物產(chǎn)生多藥耐藥性常常成為影響肺癌化療療效的主要障礙[3]，因此增加肺癌細(xì)胞的化療藥物的敏感性，探索新的聯(lián)合用藥方案具有十分重要的意義，一直也是學(xué)者們研究的一個(gè)方向[4]。葫蘆素E (cucurbitacin E，CuE)是從葫蘆科及多種其他科屬植物中提取的多種四環(huán)三萜化合物的成分之一[5]，具有多種生物活性[6]，CuE能夠抑制肝癌[7-8]、胰腺癌[9]、乳腺癌[10-11]、人類大腦惡性膠質(zhì)瘤[12]、肺癌[13]等多種腫瘤細(xì)胞的增殖。目前已有研究證實(shí)，CuE在體外可明顯抑制非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞的增殖并誘導(dǎo)其凋亡[13]。本研究探討CuE、順鉑(cisplatin，DDP)、紫杉醇(paclitaxel，PTX)單獨(dú)應(yīng)用及CuE聯(lián)合DDP或PTX對人非小細(xì)胞肺癌A549和H460細(xì)胞增殖的抑制作用，判定藥物之間相互作用的效果，為進(jìn)一步研究和臨床應(yīng)用提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 主要材料與試劑 人非小細(xì)胞肺癌A549、H460細(xì)胞株購自上海中科院細(xì)胞庫；CuE由日本東邦大學(xué)藥學(xué)部提供；DDP購于山東齊魯制藥有限公司；PTX購于上海華聯(lián)制藥有限公司；二甲亞砜（DMSO）和MTT分別購于美國Sigma-Aldrich公司和北京鼎國昌盛生物技術(shù)有限公司；細(xì)胞培養(yǎng)用胎牛血清、胰蛋白酶、F12、1640培養(yǎng)基均為HyClone公司產(chǎn)品；酶標(biāo)儀購于奧地利安托斯儀器公司。

1.2 細(xì)胞及培養(yǎng)條件 在37℃、5%CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)，分別采用含10%FBS的F12和1640培養(yǎng)基培養(yǎng)A549和H460細(xì)胞；倒置顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài)，待其生長至80%左右，移除培養(yǎng)基，用0.25%胰蛋白酶處理細(xì)胞2～3 min，滴入培養(yǎng)基終止消化，離心處理后收集沉淀并采用培養(yǎng)基重懸，將A549和H460細(xì)胞接種到培養(yǎng)瓶中進(jìn)行常規(guī)培養(yǎng)，細(xì)胞密度為5×105個(gè)/mL。

1.3 MTT法檢測細(xì)胞增殖 取對數(shù)生長期的A549和H460細(xì)胞，以每孔5×103個(gè)細(xì)胞/200 μL接種于96孔板，培養(yǎng)過夜，更換培養(yǎng)基，每孔100 μL，同時(shí)向其內(nèi)加入不同濃度的藥物。單獨(dú)應(yīng)用時(shí)每孔加藥量10 μL，終濃度CuE為0.5、1、10、100、1000 nM；DDP為1、2、4、8、16 μg/mL；PTX為1.25、2.5、5、10、20 μg/mL。兩藥合用（CuE+DDP，CuE+PTX）時(shí)每種單藥濃度濃縮1倍各加5 μL，使每種藥物濃度在合用時(shí)與單用時(shí)相同，每孔加藥量仍為10 μL。同時(shí)設(shè)無藥對照組，每組設(shè)3個(gè)平行孔，處理24 h后，向每孔加入MTT溶液（5 mg/mL）20 μL，4 h后終止培養(yǎng)，每孔加入150 μL DMSO，室溫震蕩混勻10 min，置于酶標(biāo)儀上570 nm波長下檢測各孔吸光值，并計(jì)算藥物的體外生長抑制率=（1-給藥孔平均值/對照組平均值）×100%。

1.4 結(jié)果判定 采用CHOU等聯(lián)合指數(shù)法[14]。先將中效方程fa/fu=(D/Dm)m(fa為效應(yīng)，即抑制率，fu= l-fa，D為藥物濃度，Dm為中效濃度，m為斜率)兩邊取對數(shù)，得lg(fa/fu)=mlgD-mlgDm。設(shè)y=lg(fa/fu)，x= lgD，a=-mlgDm，b=m，將中效方程由指數(shù)方程轉(zhuǎn)變?yōu)榫€性方程y=bx+a。根據(jù)實(shí)驗(yàn)所得fa和D值，進(jìn)行線性回歸分析，求出a和b，這樣就可以得出藥物單用及合用時(shí)各自的Dm。由以上結(jié)果可計(jì)算出藥物單用及合用達(dá)到各種效應(yīng)所需的濃度D=Dm(fa/fu)1/m。最后計(jì)算藥物合用在各種效應(yīng)時(shí)的合用指數(shù)(combination index，CI)。計(jì)算公式：CI=(D)l/(Dx)1+(D)2/ (Dx)2+α(D)1(D)2/(Dx)1(Dx)2，(D)1、(D)2為合用產(chǎn)生X效應(yīng)時(shí)兩藥各自的濃度，(Dx)1、(Dx)2為單用產(chǎn)生X效應(yīng)時(shí)兩藥各自的濃度。α=1為兩種相互非排斥性藥物，α=0為兩種相互排斥性藥物。CI＜I協(xié)同，CI=I相加，CI＞I拮抗。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 每組實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，采用EXCEL數(shù)據(jù)庫錄用數(shù)據(jù)，各組數(shù)據(jù)均使用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)軟件包進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。計(jì)量資料用“平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差”的形式表示，根據(jù)數(shù)據(jù)的正態(tài)性，選擇單因素方差分析(ANOVA)、SNK法、LSD、logistic回歸等進(jìn)行多重比較。當(dāng)P＜0.05時(shí)，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 藥物單用及兩藥合用對A549和H460細(xì)胞增殖的抑制作用 MTT實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，藥物單用及CuE聯(lián)合DDP或PTX對A549和H460細(xì)胞的增殖均有抑制作用，隨著藥物濃度的增加，抑制率也相應(yīng)增加（見表1）。CuE、DDP、PTX單用時(shí)對A549細(xì)胞中效濃度分別為280.34 nM，10.46 μg/mL，15.47 μg/mL。CuE與DDP合用時(shí)，中效濃度分別為29.82 nM，5.21 μg/ mL，是單用時(shí)的10.64%，49.81%。CuE與PTX合用時(shí)，中效濃度分別為170.15 μg/mL，11.84 μg/mL，是單用時(shí)的60.69%，76.54%。CuE、DDP、PTX單用時(shí)對H460細(xì)胞中效濃度分別為138.54 nM，8.78 μg/ mL，9.21 μg/mL。CuE與DDP合用時(shí)，中效濃度分別為26.86 nM，5.34 μg/mL，是單用時(shí)的19.39%，60.82%。CuE與PTX合用時(shí)，中效濃度分別為89.71 μg/mL，7.87 μg/mL，是單用時(shí)的64.75%，85.45%。結(jié)果顯示所選藥物合用時(shí)的中效濃度與單用時(shí)比較有不同程度的降低。

2.2 藥物之間相互作用效果的判定 根據(jù)中效方程可以計(jì)算藥物合用在不同fa時(shí)的CI(見表2)。以fa為橫坐標(biāo)，CI為縱坐標(biāo)，可以得出CuE聯(lián)合DDP或PTX對A549和H460細(xì)胞的中效曲線(median-effect plot)(見圖1，圖2)。CuE與DDP合用，對于A549細(xì)胞，在整個(gè)效應(yīng)范圍中(0＜fa＜100%)兩藥均表現(xiàn)為協(xié)同作用(CI＜I)。而對于H460細(xì)胞，大部分效應(yīng)范圍(0＜fa＜72%)為協(xié)同作用(CI＜I)。CuE與PTX合用，對于A549細(xì)胞，在較低效應(yīng)范圍(0＜fa＜14%)時(shí)為協(xié)同作用(CI＜I)，在中高效應(yīng)范圍(14%＜fa＜100%)時(shí)則表現(xiàn)為拮抗作用(CI＞I)；對于H460細(xì)胞，同樣在較低效應(yīng)范圍(0＜fa＜28%)時(shí)為協(xié)同作用(CI＜I)，在中高效應(yīng)范圍(28%＜fa＜100%)時(shí)則表現(xiàn)為拮抗作用(CI＞I)。

表1 CuE、DDP、PTX單用及CuE聯(lián)合DDP或PTX對A549和H460細(xì)胞生長的抑制作用（P＜0.05）

3 討論

CuE是從葫蘆科及多種其他科屬植物中提取的多種四環(huán)三萜化合物的成分之一，已被證實(shí)具有廣泛的生物學(xué)活性[5]，包括抗腫瘤、抗化學(xué)致癌和抗感染等多種藥理作用[6]。已有研究表明，CuE在體外可明顯抑制非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞的增殖并誘導(dǎo)其凋亡，CuE誘導(dǎo)凋亡可能通過抑制STAT3信號通路和Raf/ MEK/ERK信號通路，同時(shí)激活Fas信號通路來實(shí)現(xiàn)[13]。而順鉑（DDP）和紫杉醇(PTX)是治療非小細(xì)胞肺癌常用的化療藥物，已廣泛用于進(jìn)展期肺癌的新輔助化療和術(shù)后輔助化療。然而，臨床往往存在濃度依賴，腫瘤細(xì)胞對化療藥物產(chǎn)生多藥耐藥性，導(dǎo)致治療效果逐漸下降，因此期望尋找聯(lián)合用藥以降低藥物濃度以提高療效。

表2 藥物聯(lián)合應(yīng)用對A549和H460細(xì)胞在不同效應(yīng)(fa)時(shí)的合用指數(shù)(CI)

圖1 CuE聯(lián)合DDP或PTX對A549細(xì)胞的中效曲線

圖2 CuE聯(lián)合DDP或PTX對H460細(xì)胞的中效曲線

本研究發(fā)現(xiàn)，CuE、DDP、PTX藥物單用及CuE分別于DDP、PTX合用對A549和H460細(xì)胞增殖的均有抑制作用，隨著藥物濃度的增加，抑制率也相應(yīng)增加。從中效濃度來比較，本研究中所選藥物合用時(shí)的中效濃度與單用時(shí)比較有不同程度的降低。CuE與DDP合用，對于A549細(xì)胞在全部效應(yīng)范圍均表現(xiàn)為協(xié)同作用；而對于H460細(xì)胞，大部分效應(yīng)范圍為協(xié)同作用。CuE與PTX合用，對于A549細(xì)胞，則大部分效應(yīng)范圍是拮抗作用；對于H460細(xì)胞，同樣大部分效應(yīng)范圍是拮抗作用。因此對于A549和H460細(xì)胞，CuE與DDP合用可以明顯提高順鉑對A549細(xì)胞活性的抑制效果，且效果優(yōu)于CuE與PTX合用。這表明對于相同治療效果，合理的聯(lián)合用藥可大大減少兩種藥物各自的用量以提高療效，從而降低藥物的毒副作用。

這種在不同的非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞株，CuE與不同化療藥物聯(lián)合應(yīng)用的效果存在較大的差異，其機(jī)制可能與CuE對細(xì)胞信號傳導(dǎo)通路及細(xì)胞凋亡基因的影響有關(guān)。

信號傳導(dǎo)及轉(zhuǎn)錄激活因子3(signal transducers and activators of transcription 3,STAT3)信號傳導(dǎo)通路是多種惡性腫瘤發(fā)生的關(guān)鍵因素，也參與了腫瘤細(xì)胞的增殖、分化、發(fā)育及轉(zhuǎn)移過程，STAT3信號傳導(dǎo)通路在多種惡性腫瘤中存在過度活化，STAT3的活化可上調(diào)其下游凋亡抑制基因Bcl-2的表達(dá)，進(jìn)而促進(jìn)腫瘤細(xì)胞增殖和腫瘤的發(fā)展，抑制STAT3信號通路可抑制腫瘤生長并引起腫瘤細(xì)胞凋亡[15]。CuE可抑制肝癌[7-8]、胰腺癌[9]、乳腺癌[10-11]、人類大腦惡性膠質(zhì)瘤[12]、肺癌[13]等多種腫瘤細(xì)胞 STAT3信號通路的活化，均可在不影響STAT3蛋白水平情況下顯著降低STAT3的磷酸化，提示抑制STAT3活化可能是CuE抗腫瘤作用的重要機(jī)制。在A549細(xì)胞中CuE可明顯抑制STAT3的磷酸化，同時(shí)降低其下游凋亡抑制因子Bcl-2的表達(dá)，CuE作為STAT3信號通路抑制劑可抑制非小細(xì)胞肺癌A549細(xì)胞的增殖并誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[13]。然而，最近一些研究并不支持這一觀點(diǎn)，有學(xué)者報(bào)道，高濃度葫蘆素E可抑制U937細(xì)胞STAT3的磷酸化，而較低濃度葫蘆素E對STAT3的磷酸化水平并無影響，但仍可抑制細(xì)胞生長[16]?？梢奀uE對STAT3活化的影響因細(xì)胞和藥物濃度而異，其抗腫瘤活性可能涉及其他更為上游的作用靶點(diǎn)。在非小細(xì)胞肺癌中，DDP抗腫瘤作用與STAT3通路也有明確的相關(guān)性。有研究表明，STAT3基因蛋白表達(dá)陽性NSCLC患者，應(yīng)用順鉑輔助化療，其生存時(shí)間明顯低于未用順鉑輔助化療者，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)；STAT3基因蛋白表達(dá)陰性NSCLC患者，應(yīng)用順鉑輔助化療其生存時(shí)間與未用順鉑輔助化療者的生存時(shí)間無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)，但前者有優(yōu)于后者的趨勢。這表明STAT3基因蛋白表達(dá)水平是評估晚期NSCLC患者應(yīng)用鉑類藥物化療療效的一個(gè)重要因素，STAT3基因蛋白表達(dá)可能參與順鉑耐藥機(jī)制[17]。CuE作為STAT3的抑制劑，可以抑制NSCLC順鉑輔助化療患者的STAT3基因蛋白表達(dá)，提高順鉑對NSCLC細(xì)胞活性的抑制效果，從而減少耐藥性的發(fā)生。而紫杉醇作用于非小細(xì)胞肺癌卻有不同的報(bào)道，紫杉醇能夠有效增強(qiáng)肺癌細(xì)胞中STAT3蛋白的表達(dá)，紫杉醇能有效抑制肺癌細(xì)胞增殖、促進(jìn)其凋亡，可能與其激活細(xì)胞內(nèi)STAT3信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路相關(guān)[18]。STAT3抑制劑在腫瘤治療中的具有重要的價(jià)值，可以作為抗腫瘤治療的關(guān)鍵靶點(diǎn)。在非小細(xì)胞肺癌中，CuE輔助化療藥物DDP的化療療效與STAT3表達(dá)明顯相關(guān)，這可能是CuE聯(lián)合PTX出現(xiàn)拮抗作用的重要原因之一。

Fas是細(xì)胞表面重要的死亡受體，是腫瘤壞死因子（TNF）和神經(jīng)生長因子（NGF）受體家族的一員，其與配體Fasl結(jié)合，活化并傳導(dǎo)凋亡信號，是誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的重要途徑之一。研究顯示腫瘤細(xì)胞通過Fas的表達(dá)下調(diào)，逃逸機(jī)體的免疫監(jiān)視，發(fā)生免疫逃逸，最終腫瘤細(xì)胞惡性增殖，腫瘤最終發(fā)生。楚玉潔等[19]研究顯示在非小細(xì)胞肺癌中，F(xiàn)as的高表達(dá)可以通過Fas/Fasl介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡途徑，促進(jìn)癌變的細(xì)胞凋亡，抑制腫瘤的發(fā)生，提示Fas在NSCLC的發(fā)生、發(fā)展過程中有著重要的作用，而且隨著腫瘤的發(fā)展，分化程度及臨床分期與Fas陽性表達(dá)均有關(guān)系，提示Fas能夠抑制腫瘤的發(fā)展。CuE在抑制非小細(xì)胞肺癌A549細(xì)胞中可顯著增加Fas蛋白的表達(dá)，說明對Fas信號通路的激活作用，是CuE誘導(dǎo)非小細(xì)胞肺癌A549細(xì)胞凋亡的分子機(jī)制之一[13]。在近年來的研究中，DDP與Fas的表達(dá)也有相似的報(bào)道。有研究顯示，順鉑可以顯著增高肺癌細(xì)胞的Fas基因表達(dá)水平，可以增強(qiáng)順鉑的抗腫瘤作用[20]。在其他腫瘤的研究中發(fā)現(xiàn)，過表達(dá)Fas可抑制胃癌細(xì)胞順鉑耐藥細(xì)胞的細(xì)胞活力，并誘導(dǎo)其凋亡，同時(shí)上調(diào)相關(guān)凋亡因子的蛋白水平，提示胃癌順鉑耐藥細(xì)胞中過表達(dá)Fas可恢復(fù)細(xì)胞對順鉑的敏感性，促進(jìn)細(xì)胞凋亡并抑制細(xì)胞生長[21]。而有人檢測了6種表達(dá)Fas/Fasl的肺癌細(xì)胞經(jīng)紫杉醇處理后該通路的功能，結(jié)果只在一株肺癌細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)Fas表達(dá)升高[22]。Fas/Fasl信號通路在紫杉醇誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡中所起的作用不同，可能與腫瘤細(xì)胞產(chǎn)生耐藥性有關(guān)。這可能是CuE輔助化療藥物DDP的化療療效優(yōu)于CuE聯(lián)合PTX的重要原因之一。

綜上所述，CuE與DDP合用可以明顯提高順鉑對A549細(xì)胞活性的抑制效果，且二者協(xié)同抗腫瘤作用的療效優(yōu)于CuE聯(lián)合PTX。本研究初步探討了二者聯(lián)合抗腫瘤的可能機(jī)制，但其相關(guān)信號通路及分子機(jī)制有待進(jìn)一步研究。針對肺癌的治療現(xiàn)狀，CuE與傳統(tǒng)化療藥物的聯(lián)合使用為臨床化療提供了新思路和實(shí)驗(yàn)依據(jù)?？拱┲委煏r(shí)選用敏感藥物合理配伍，最大限度地發(fā)揮抗癌藥物之間協(xié)同效應(yīng)，對提高治療效果可能會(huì)有幫助。

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（收稿：2017-02-10 修回：2017-06-06）

（責(zé)任編輯 王 豐 屈振亮）

Effect of Cucurbitacin E combined Cisplatin or Paclitaxel in Human Non-small Cell Lung Cancer Cells

YANG Yan,LI Qin,WEN Yan-hui,et al.
Department of Gastroenterology，The 4th Affiliated Hospital of China Medical University，Shenyang(110032)，China

Objective To study the in vitro anti-proliferative effects of Cucurbitacin E(CuE)combined with cisplatin(DDP)or paclitaxel(PTX)in human non-small cell lung cancer cell lines A549 and H460. Methods MTT assay was performed to examine the growth inhibitory effects of CuE,DDP,PTX,and CuE combined with DDP or PTX on A549 and H460 cells.And the effect of the combination therapy was evaluated by combination-index method of CHOU and TALALAY. Results Inhibitory effects were found when these 3 drugs were used alone or together.The median effect concentrations of these 3 drugs decreased to various extents when the drugs were used together.CuE was synergistic with DDP in A549 cells．In H460 cells，majority of effect range of CuE was synergistic with DDP.In A549 and H460 cells，low concentration of CuE was synergistic with low concentration of PTX,and middle-high concentration of CuE was antagonistic to middle-high concentration of PTX. Conclusion The effects of combination therapy are different in different human non-small cell lung cancer cell lines.Reasonable combination can greatly reduce the dosage of the two drugs,thus reducing the side effects.

Cucurbitacin E；cisplatin；paclitaxel；non-small cell lung cancer；cell proliferation

R734.2

：A

：1007-6948(2017)04-0376-06

10.3969/j.issn.1007-6948.2017.04.011

國家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目（81001028）

中國醫(yī)科大學(xué)附屬第四醫(yī)院1.消化內(nèi)科；2.轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)中心（沈陽 110032）

楊艷，E-mail:284994305@qq.com