去卵巢小鼠骨質(zhì)疏松癥與骨內(nèi)血管關(guān)系研究

宋健 吳超然 趙強(qiáng) 李長英 徐獻(xiàn)倫

（1.山東省濟(jì)寧市第一人民醫(yī)院創(chuàng)傷骨科；2.山東省濟(jì)寧市第一人民醫(yī)院影像科；3.山東省濟(jì)寧市第一人民醫(yī)院脊柱外科；4.山東省濟(jì)寧市第一人民醫(yī)院骨科，山東濟(jì)寧 272100）

去卵巢小鼠骨質(zhì)疏松癥與骨內(nèi)血管關(guān)系研究

宋健1吳超然2趙強(qiáng)1李長英3徐獻(xiàn)倫4

（1.山東省濟(jì)寧市第一人民醫(yī)院創(chuàng)傷骨科；2.山東省濟(jì)寧市第一人民醫(yī)院影像科；3.山東省濟(jì)寧市第一人民醫(yī)院脊柱外科；4.山東省濟(jì)寧市第一人民醫(yī)院骨科，山東濟(jì)寧 272100）

目的：研究去卵巢小鼠骨質(zhì)疏松癥與骨內(nèi)血管的關(guān)系，為絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松的治療提供新的思路。方法：選取60只9周齡雌性C57BL/6小鼠，按照隨機(jī)數(shù)字表法分為假手術(shù)組、卵巢切除組、雌激素治療組及去鐵敏治療組各15只。假手術(shù)組切除卵巢周圍部分脂肪組織；卵巢切除組切除雙側(cè)卵巢；雌激素治療組、去鐵敏治療組在雙側(cè)卵巢切除的基礎(chǔ)上，給予17β-雌二醇、去鐵敏治療。術(shù)后4周脫頸處死小鼠，取其子宮稱重，并檢測其股骨微觀結(jié)構(gòu)參數(shù)與血管數(shù)量，分析骨內(nèi)血管與骨量變化的相關(guān)性。結(jié)果：與造模前相比，4周后小鼠體質(zhì)量均有所升高，其余3組組體質(zhì)量升高、子宮重量降低較假手術(shù)組更為明顯，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。卵巢切除組骨密度、骨體積分?jǐn)?shù)、小梁骨數(shù)量、股骨遠(yuǎn)側(cè)干骺端微血管相對面積低于假手術(shù)組，其小梁骨間距高于假手術(shù)組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），雌激素治療組、去鐵敏治療組造模4周后遠(yuǎn)端骨量/股骨遠(yuǎn)側(cè)干骺端微血管相對面積與假手術(shù)組比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。Pearson相關(guān)性分析顯示股骨遠(yuǎn)側(cè)干骺端微血管相對面積與骨密度、骨體積分?jǐn)?shù)、小梁骨數(shù)量呈正相關(guān)，與小梁骨間距呈負(fù)相關(guān)（P＜0.05）。結(jié)論：小鼠卵巢切除后骨內(nèi)微血管密度的減少與骨質(zhì)丟失具有密切關(guān)聯(lián)，雌激素、去鐵敏藥物均可上調(diào)骨內(nèi)血管密度、促進(jìn)骨生成，為絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥的治療提供了新的研究方向。

去卵巢；小鼠；骨質(zhì)疏松癥；骨內(nèi)血管；絕經(jīng)

絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥是與生理退行性變化有關(guān)的疾病，女性絕經(jīng)后雌激素缺乏所致骨量減少、骨密度降低及骨組織結(jié)構(gòu)變化是造成骨脆性上升、骨折風(fēng)險加劇的主要原因[1]。最新研究發(fā)現(xiàn)，絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥的發(fā)生不僅與雌激素水平變化有關(guān)，還與骨髓內(nèi)脂肪組織的增加與骨內(nèi)血管減少具有密切關(guān)聯(lián)[2]。因此，有效調(diào)節(jié)骨質(zhì)疏松癥發(fā)病過程中的血管因素，有望提高骨內(nèi)血流量、減少骨量丟失，維持正常骨量及結(jié)構(gòu)[3]。本研究建立去卵巢小鼠骨質(zhì)疏松癥模型，自骨內(nèi)血管角度探討骨微觀結(jié)構(gòu)參數(shù)的變化，旨在為絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥的防治提供新的思路。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 實驗動物與分組 60只9周齡雌性C57BL/6小鼠（南京君科生物工程有限公司），體質(zhì)量202～227 g，平均（210.36±11.48）g，按照隨機(jī)數(shù)字表法分為假手術(shù)組、卵巢切除組、雌激素治療組及去鐵敏治療組，各15只。

1.1.2 藥品與儀器 本研究主要藥品包括4%多聚甲醛、去鐵敏、17β-雌二醇，均購自美國Sigma公司；主要儀器為Lotus SP Micro-CT掃描儀（美國GE公司）。

1.2 實驗方法

1.2.1 造模 假手術(shù)組：切除卵巢周圍部分脂肪組織；卵巢切除組、雌激素治療組、去鐵敏治療組：切除雙側(cè)卵巢。各組小鼠術(shù)畢均于左側(cè)股骨下端關(guān)節(jié)面上緣9 mm處作一外側(cè)骨孔，孔徑1 mm，置入PE-50管，一端使用氰基丙烯酸鹽粘合劑固定于骨孔，另一端通過皮下自背部皮膚穿出，夾閉管腔[4]。

雌激素治療組術(shù)后第2 d開始，自PE-50管向左側(cè)股骨遠(yuǎn)端注入17β-雌二醇，隔日1次，每次100 μg/kg，雌激素共計注入5次；去鐵敏治療組：術(shù)后第2 d開始，自PE-50管向左側(cè)股骨遠(yuǎn)端注入去鐵敏，隔日1次，每次20 μL（200 μM），去鐵敏共計注入5次[5]。假手術(shù)組、卵巢切除組：術(shù)后第2 d開始注入20 μL生理鹽水，隔日1次，共計注入5次。

1.2.2 取材觀察 股骨微觀結(jié)構(gòu)參數(shù)：自造模首日起，4周后脫頸處死各組內(nèi)10只小鼠，取其子宮、左側(cè)股骨，使用Micro-CT掃描儀測量其股骨遠(yuǎn)側(cè)干骺端小梁骨密度和小梁骨的靜態(tài)微觀結(jié)構(gòu)參數(shù)，包括小梁骨厚度、小梁骨數(shù)量以及梁骨間距等[6]。

股骨血管數(shù)量：取各組剩余5只小鼠，采用墨汁灌注組織學(xué)切片法，制備微血管墨汁厚片標(biāo)本，每張切片分別選擇生長板測量5個視野，采用體視學(xué)方法，測量血管占其視野的相對面積，規(guī)定為血管相對密度，以評價微血管擴(kuò)張、增多的程度[7]。

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析

應(yīng)用SAS6.12統(tǒng)計軟件包進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析，體質(zhì)量、子宮重量、骨量及微血管相對面積等計量資料以表示，并采用t檢驗，相關(guān)性分析采用Pearson法，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 體質(zhì)量及子宮重量變化

與造模前相比，各組小鼠造模4周后體質(zhì)量均有所升高，其余3組體質(zhì)量升高較假手術(shù)組更為明顯，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。其余3組子宮重量均低于假手術(shù)組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義，見表1。

表1 各組小鼠變化比較（g，x±s）

2.2 遠(yuǎn)端骨量

卵巢切除組骨密度、骨體積分?jǐn)?shù)、小梁骨數(shù)量低于假手術(shù)組，其小梁骨間距高于假手術(shù)組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），雌激素治療組、去鐵敏治療組造模4周后遠(yuǎn)端骨量與假手術(shù)組比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。見表2。

表2 各組小鼠遠(yuǎn)端骨量比較

表2 各組小鼠遠(yuǎn)端骨量比較

注：與假手術(shù)組比較，*P＜0.05；與卵巢切除組比較，#P＜0.05

組別例數(shù)骨密度（mg/cc）骨體積分?jǐn)?shù)小梁骨數(shù)量（/mm）假手術(shù)組10395.26±24.470.40±0.083.69±0.83卵巢切除組10321.05±19.58*0.31±0.04*2.45±0.62*雌激素治療組10388.41±26.24#0.39±0.06#3.67±0.79#去鐵敏治療組10383.59±25.07#0.40±0.07#3.66±0.79#組別例數(shù)小梁骨厚度（μm）小梁骨間距（μm）假手術(shù)組100.13±0.040.17±0.05卵巢切除組100.10±0.030.35±0.15*雌激素治療組100.12±0.040.18±0.05#去鐵敏治療組100.12±0.030.17±0.03#

2.3 微血管相對面積

造模4周后，卵巢切除組股骨遠(yuǎn)側(cè)干骺端微血管相對面積2.16±0.52低于假手術(shù)組的3.95±0.84，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），雌激素治療組、去鐵敏治療組股骨遠(yuǎn)側(cè)干骺端微血管相對面積分別為3.88±0.75、3.91±0.73，與假手術(shù)組比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。

2.4 相關(guān)性分析

Pearson相關(guān)性分析示，股骨遠(yuǎn)側(cè)干骺端微血管相對面積與骨密度、骨體積分?jǐn)?shù)、小梁骨數(shù)量呈正相關(guān)，與小梁骨間距呈負(fù)相關(guān)（P＜0.05）。見表3。

表3 股骨遠(yuǎn)側(cè)干骺端微血管相對面積與遠(yuǎn)端骨量的相關(guān)性分析

3 討論

作為一種全球性健康問題，骨質(zhì)疏松患者不僅骨折風(fēng)險上升，還可引起慢性肌肉疼痛和骨骼疼痛[8]。雌激素可通過多種途徑參與骨代謝[9-11]：結(jié)合破骨細(xì)胞表面受體，下調(diào)破骨細(xì)胞溶酶體酶活性，抑制骨吸收、降低骨切片凹陷風(fēng)險；作用于破骨細(xì)胞前體，抑制破骨細(xì)胞生長、分化，延緩骨量減少進(jìn)程；結(jié)合成骨細(xì)胞表面受體，上調(diào)膠原酶、細(xì)胞因子及生長因子釋放，介導(dǎo)胰島素樣生長因子1、轉(zhuǎn)化生長因子，調(diào)節(jié)成骨代謝，誘導(dǎo)骨重建。因此，女性絕經(jīng)后雌激素水平的急劇降低可導(dǎo)致骨形成受阻、骨吸收加劇，進(jìn)而引發(fā)骨量減少甚至骨質(zhì)疏松。本研究實驗動物卵巢切除后，小鼠體質(zhì)量明顯增加、子宮重量明顯降低，機(jī)體代償性增加脂肪雌激素的合成以維持雌激素穩(wěn)態(tài)水平，是導(dǎo)致其體重急劇上升的主要原因[12-13]。經(jīng)補(bǔ)充雌激素治療后，雌激素治療組小鼠遠(yuǎn)端骨量丟失得到了有效控制，說明雌激素對于抑制小梁骨微觀結(jié)構(gòu)退變具有重要意義。

血管為雌激素的靶組織[14]。有學(xué)者發(fā)現(xiàn)，骨的塑形過程與血管形成具有密切關(guān)聯(lián)，成骨細(xì)胞及破骨細(xì)胞通過血管達(dá)到骨改建部位，對于維持骨骼生長、穩(wěn)定具有重要作用，而血管內(nèi)皮細(xì)胞可有效促進(jìn)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞向成骨細(xì)胞譜系分化，從而上調(diào)骨量[15]。Chen等[16]指出，血管內(nèi)皮細(xì)胞生長因子（VEGF）等血管形成相關(guān)因子具有調(diào)控前成骨細(xì)胞的募集、增殖和向成骨細(xì)胞的分化作用，且能夠增強(qiáng)成骨細(xì)胞和破骨細(xì)胞的活性，促進(jìn)骨形成過程。本研究通過微血管相對面積評估骨內(nèi)血管狀態(tài)，結(jié)果表明，骨內(nèi)血管增殖速度、數(shù)量均與遠(yuǎn)端骨量具有明顯相關(guān)性。去鐵敏治療組小鼠骨量丟失狀態(tài)得到了明顯抑制，去鐵敏可通過低氧誘導(dǎo)因子途徑增加局部血管內(nèi)皮生長因子表達(dá)、促進(jìn)局部血管生成[17]，此次研究結(jié)果在證實骨內(nèi)血管對于骨形成發(fā)揮的重要作用的同時，亦說明去鐵敏能夠拮抗卵巢切除或絕經(jīng)后因雌激素缺乏所致骨量丟失甚至骨質(zhì)疏松[18]。

綜上所述，去卵巢小鼠骨質(zhì)疏松癥與雌激素減少所致骨內(nèi)血管密度、數(shù)量降低具有密切關(guān)聯(lián)，補(bǔ)充雌激素或注射去鐵敏對于骨內(nèi)血管數(shù)量增加具有積極作用，而這一作用可防止骨量丟失，降低骨質(zhì)疏松風(fēng)險，值得作為骨質(zhì)疏松癥防治的新思路加以進(jìn)一步探索。

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R681

A

2095-5200(2017)04-012-03

10.11876/mimt201704006

宋健，本科，主治醫(yī)師，研究方向：創(chuàng)傷骨科臨床，Email：2689552038@qq.com。

趙強(qiáng)，博士，副主任醫(yī)師，研究方向：創(chuàng)傷骨科。