尖葉假龍膽乙酸乙酯部位對胰島素抵抗HepG2細胞IRS-1、Akt的影響＊

高佳琪，魏穎，屈玲霞，劉永巧，劉一冰，徐暾海＊＊，劉銅華

尖葉假龍膽乙酸乙酯部位對胰島素抵抗HepG2細胞IRS-1、Akt的影響＊

高佳琪1,2,3，魏穎1,2,3，屈玲霞1,2,3，劉永巧1,2,3，劉一冰1，徐暾海1,2,3＊＊，劉銅華2,3

（1.北京中醫(yī)藥大學中藥學院北京100029；2.北京中醫(yī)藥大學中醫(yī)養(yǎng)生學北京市重點實驗室北京100029；3.北京中醫(yī)藥大學中醫(yī)養(yǎng)生學教育部重點實驗室北京100029）

目的：研究尖葉假龍膽乙酸乙酯部位對胰島素抵抗HepG2細胞胰島素關(guān)鍵信號IRS-1、Akt的基因、蛋白的影響。方法：以CCK-8法檢測HepG2細胞活性；采用人肝癌HepG2細胞，并用高濃度胰島素（10-6mol·L-1）培養(yǎng)HepG2細胞36 h，建立胰島素抵抗細胞模型。根據(jù)CCK-8法結(jié)果分為正常組（Control組）、模型組（IR組）、尖葉假龍膽乙酸乙酯部位IR+50 μg·mL-1組、IR+500 μg·mL-1組及二甲雙胍組，以葡萄糖試劑盒檢測葡萄糖消耗量。尖葉假龍膽乙酸乙酯部位給藥6 h后RT-PCR檢測胰島素抵抗HepG2細胞IRS-1、Akt基因表達；尖葉假龍膽乙酸乙酯部位給藥6 h后，利用Western blot法檢測IRS-1、Akt的蛋白表達。結(jié)果：尖葉假龍膽乙酸乙酯部位濃度為500 μg·mL-1時，存活率達到95%。濃度高于500 μg·mL-1時，存活率下降；與IR組比較，IR+50 μg·mL-1組與IR+500 μg·mL-1組促進胰島素抵抗HepG2細胞葡萄糖的消耗量，但其作用不及鹽酸二甲雙胍組。給藥6 h后與IR組比較，IR+50 μg·mL-1組與IR+500 μg·mL-1組的RT-PCR檢測胰島素抵抗HepG2細胞IRS-1、Akt的基因表達顯著升高，P＜0.01。給藥6 h后與IR組比較，IR+50 μg·mL-1組與IR+500 μg·mL-1組的Western blot法檢測IRS-1、Akt的蛋白表達顯著升高，P＜0.01。結(jié)論：尖葉假龍膽乙酸乙酯部位上調(diào)HepG2細胞胰島素信號通路關(guān)鍵靶點IRS-1、Akt基因表達，以及IRS-1、Akt蛋白表達從而可能是其改善胰島素抵抗作用的機制。

尖葉假龍膽乙酸乙酯部位HepG2細胞胰島素抵抗胰島素信號

胰島素抵抗（Insulin Resistence,IR）是一種先于多種疾病狀態(tài)的病理狀態(tài)，包括高血壓、肥胖病、高血脂和2型糖尿病[1,2]。胰島素抵抗是2型糖尿病發(fā)病的主要因素，在2型糖尿病發(fā)病中起重要作用。2型糖尿病嚴重威脅人類健康，為了人類健康與發(fā)揚民族用藥我們做了本次研究。胰島素抵抗的特點是營養(yǎng)失調(diào)和葡萄糖攝取不足，存在于許多組織和器官；在分子水平表現(xiàn)為胰島素與胰島素受體結(jié)合后信號傳導丟失，可以發(fā)生在肝臟、脂肪及骨骼肌組織中[3-5]。胰島素信號傳導障礙導致葡萄糖利用率降低，被認為是胰島素抵抗發(fā)病機制中的關(guān)鍵因素[6]。HepG2細胞被廣泛用于葡萄糖代謝、脂類代謝、胰島素抵抗等[7,8]。因此，本研究針對胰島素抵抗的關(guān)鍵病理環(huán)節(jié)選取HepG2細胞（人肝癌細胞）作為模型細胞。

尖葉假龍膽Gentianella acuta為龍膽科Gentiananceae假龍膽Gentianella草本植物。全草入蒙藥，性涼、味苦。廣泛分布于中國內(nèi)蒙古、新疆、河北、山東、山西等省。具有清熱利濕的功效，常用于治療黃疸、頭痛、發(fā)熱等癥狀。民間多用于治療心臟病[9]?，F(xiàn)在藥理研究表明，尖葉假龍膽主要含有三萜、口山酮類化合物[10,11]，其中口山酮類化合物具有很好的抗糖尿病活性[12]。本研究以人肝癌HepG2細胞為模型，研究尖葉假龍膽乙酸乙酯部位對其胰島素信號傳導通路關(guān)鍵靶點基因、蛋白的影響,探討尖葉假龍膽乙酸乙酯部位改善胰島素抵抗的機制。

1 儀器和材料

1.1 儀器

HDL型超凈工作臺（北京東聯(lián)哈爾儀器制造有限公司）；HERA cell 150i CO2孵育箱（美國Thermo scientific公司）；IX71倒置顯微鏡（日本Olympus公司）；Sigma臺式高速低溫冷凍離心機（美國Sigma-Aldrich公司）；Glomax multi酶標儀（美國Promega公司）；R200D型分析天平（德國賽多利斯集團）；電泳儀、轉(zhuǎn)膜槽（美國BIO-RAD公司）；ABI Prism 7500PCR擴增儀（美國應(yīng)用生物系統(tǒng)公司）；凝膠成像儀（美國BIORAD公司；ChemiDocTM XRS+with Image LabTM Software）；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（瑞士Buchi公司）。

1.2 實驗材料

DMEM高糖培養(yǎng)基（美國Gibco公司）；胎牛血清（美國Corning公司）；青霉素-鏈霉素混合液（深圳市康杰爾生物科技有限公司，批號：151116）；胰蛋白酶-EDTA溶液（深圳市康杰爾生物科技有限公司，批號20161012）；磷酸鹽緩沖液（PBS）（深圳市康杰爾生物科技有限公司，批號：150413）；胰島素（丹麥諾和諾德制藥股份有限公司，批號：J201000117）；鹽酸二甲雙胍（中國中美上海施貴寶制藥有限公司，批號：AAA2857）；CCK-8（日本同仁化學研究所）；葡萄糖檢測試劑盒（上海Robio公司）；細胞培養(yǎng)瓶（美國Corning公司）；96孔板（美國Corning公司）；GoScriptTMReverse Transcription System試劑盒（美國Promega公司）；BCA蛋白定量試劑盒（美國Biomiga公司）；IRS-1、Akt抗體（美國Cell Signaling Technology公司）；β-actin抗體（北京普利萊基因技術(shù)有限公司、）；Blocking one（日本Nacalai Tesque公司）；Solution1(日本TOYOBO公司)；Solution2（日本TOYOBO公司）；10×TBST封閉洗滌緩沖溶液（北京普利萊基因技術(shù)有限公司）；10×TBS封閉洗滌緩沖溶液（北京普利萊基因技術(shù)有限公司）；分離膠緩沖液（北京普利萊基因技術(shù)有限公司）；濃縮膠緩沖液（北京普利萊基因技術(shù)有限公司）；葡萄糖檢測試劑盒（上海Robio公司）；RNA引物（上海生工生物工程股份有限公司合成）。

1.3 藥材與細胞

尖葉假龍膽：產(chǎn)于內(nèi)蒙古呼倫貝爾海拉爾為龍膽科假龍膽屬植物尖葉假龍膽(Gentianella acuta Hulten)的干燥全草（北京中醫(yī)藥大學中藥學院劉春生教授鑒定）。HepG2細胞人肝癌細胞株：北京中醫(yī)藥大學教育部中醫(yī)養(yǎng)生學重點實驗室保存。

2 實驗方法

2.1 尖葉假龍膽乙酸乙酯部位提取物制備

尖葉假龍膽3.5 kg全草。粉碎后，室溫下，加95%乙醇浸漬提取。至提取液呈微黃色，提取液用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器濃縮至沒有醇味，得到95%乙醇濃縮液；藥材殘渣加70%乙醇浸漬提取，至提取液呈微黃色；回收乙醇，濃縮至沒有醇味，得到70%乙醇濃縮液。將95%和70%乙醇濃縮液，分別加水懸浮，用乙酸乙酯萃取。合并，濃縮，凍干，得到乙酸乙酯部位提取物。

2.2 HepG2細胞的培養(yǎng)

將放于液氮中的HepG2細胞，快速在置于37℃水浴中5 min內(nèi)復蘇。馬上移入到含有10%胎牛血清、1%青霉素-鏈霉素混合液的DMEM高糖培養(yǎng)基的細胞瓶中。置于孵育箱培養(yǎng)24 h。待細胞融合到80%以上時，用PBS輕輕洗滌3次；加1 mL 0.25%胰蛋白酶進行消化，再加3 mL培養(yǎng)基停止消化。4℃，1 000 r·min-1，離心5 min；棄去原來的培養(yǎng)基加新培養(yǎng)基進行吹打，形成細胞混懸液；移入至新的細胞培養(yǎng)瓶。每2天傳代一次，取對數(shù)生長期的細胞進行實驗。

2.3 CCK-8法細胞活性檢測

取對數(shù)生長期的HepG2細胞，按每孔8 000個/mL密度接種于96孔板中，每孔100μL，每組6個復孔。待細胞貼壁以后，設(shè)置空白對照組與藥物干預(yù)組。藥物干預(yù)組加無血清含藥DMEM高糖培養(yǎng)基的尖葉假龍膽乙酸乙酯部位，藥物終濃度分別為1 500、1 000、500、150、100、50 μg·mL-1。每個濃度設(shè)6個復孔，加藥24 h后，每孔加10 μL CCK-8，置于培養(yǎng)箱中反應(yīng)1 h后；取出置于酶標儀中檢測，波長為450 nm，讀取吸光度值。計算細胞存活率：

存活率=給藥組OD值/對照組OD值×100%

2.4 造模與分組給藥

取對數(shù)生長期的細胞以8 000個/mL的密度接種于96孔板中，每孔100μL，每組6個復孔，置于細胞培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h。待細胞達到80%融合度時，移除舊培養(yǎng)基，用PBS輕輕洗滌3次。設(shè)置Control組與IR組、IR+50 μg·mL-1與IR+500 μg·mL-1，IR組、IR+50 μg·mL-1與IR+500 μg·mL-1加含有10-6mol·L-1胰島素的DMEM高糖培養(yǎng)基（含10%胎牛血清），Control組無胰島素，置于細胞培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)36 h[12]。即為胰島素抵抗HepG2細胞模型。移除舊培養(yǎng)基，用PBS輕輕洗滌3次；加入無血清DMEM高糖培養(yǎng)基后，置于細胞培養(yǎng)箱培養(yǎng)12 h。

2.5 測定葡萄糖消耗量

按“2.4”項方法，取對數(shù)生長期的細胞以8 000個/mL的密度接種于96孔板中，每孔100μL，每組6個復孔。分組給藥24 h后，用PBS輕輕洗滌3次；加入無血清DMEM高糖培養(yǎng)基后，置于細胞培養(yǎng)箱培養(yǎng)6 h。利用葡萄糖試劑盒進行糖消耗量檢測。

2.6 RT-PCR基因檢測

取對數(shù)生長期的細胞以1×105個/mL的密度接種于6孔板中，每孔2 mL，每組3個復孔。分組給藥6 h后，HepG2細胞用PBS輕輕洗滌3次。依照RNA提取試劑盒提取RNA；測純度。然后進行反轉(zhuǎn)錄，搖勻，室溫靜置5 min。退火25℃5 min，延伸42℃1 h，70℃滅活15 min，得到cDNA。每管20μL反應(yīng)體系：2μL cDNA稀釋液（1∶45）、10μL Mix反應(yīng)液、7.92μL無核酸水和0.08μL引物混合物（表1），置于PCR儀中進行反應(yīng)，反應(yīng)條件：95℃10 min；95℃15 s，60℃1 min（共40次循環(huán)）；95℃15 s，60℃15 s溶解。

2.7 Western Blot蛋白表達

取對數(shù)生長期的細胞以1×105個/mL的密度接種于6孔板中，每孔2 mL，每組3個復孔。分組給藥6 h后，用Homoginized Buffer提取總蛋白，加2×蛋白上樣緩沖液100μL，100℃煮沸5 min后蛋白變性。用BCA蛋白定量試劑盒測定蛋白量。每孔20μg上樣量，預(yù)電泳90 V 5 min，電泳100 V 1.5 h，預(yù)先用轉(zhuǎn)膜液處理PVDF膜及濾紙45 min，再半干法凝膠轉(zhuǎn)膜0.2 A 50 min，膜在1×TBS中室溫搖床中清洗2次，每次10 min；Blocking one封閉2 h。分別以IRS-1、Akt、β-actin抗體（1∶1 000稀釋），4℃孵育過夜?；厥找豢?，膜用1× TBST室溫搖床中清洗3次，每次10 min；洗膜后加羊抗兔二抗（1∶20 000）室溫孵育1 h?；厥斩?，膜用1× TBST室溫搖床中清洗3次，每次10 min；洗膜后加ECL發(fā)光液，避光反應(yīng)1 min，凝膠成像系統(tǒng)對目的蛋白進行成像。用Image J軟件進行分析蛋白灰度。

表1 IRS-1、Akt、β-actin引物合成序列

圖1 尖葉假龍膽乙酸乙酯粗提物對HepG2細胞活性的影響

2.8 數(shù)據(jù)分析方法

數(shù)據(jù)處理采用SAS 8.2統(tǒng)計學軟件進行分析，實驗數(shù)據(jù)以（xˉ±s）表示。多組比較采用單因素方差分析，兩組間比較采用LSD檢驗；P＜0.05有統(tǒng)計學差異，P＜0.01有極顯著差異。

3 實驗結(jié)果

3.1 尖葉假龍膽乙酸乙酯部位對HepG2細胞活性的影響

CCK-8（圖1）結(jié)果顯示：尖葉假龍膽乙酸乙酯部位濃度為500 μg·mL-1時，存活率達到95%；濃度低于500 μg·mL-1時，細胞存活率趨近于100%；濃度超過500 μg·mL-1時，對HepG2細胞的生長具有明顯的抑制作用。且濃度越大，抑制作用越明顯。所以本實驗選取500和50 μg·mL-1用來進行改善胰島素抵抗HepG2細胞的研究。

3.2 尖葉假龍膽乙酸乙酯部位對HepG2細胞葡萄糖消耗量的影響

由表2可知，與Control組比較，IR組的葡萄糖消耗量明顯降低（P＜0.05），說明IR組的HepG2細胞產(chǎn)生了胰島素抵抗作用。與IR組比較，鹽酸二甲雙胍組與IR+ 500 μg·mL-1組葡萄糖消耗量極顯著增大（P＜0.01），細胞葡萄糖消耗量分別增加了55.4%與22.9%，IR+50 μg·mL-1組葡萄糖消耗量明顯增大（P＜0.05）細胞葡萄糖消耗量增加了16.4%。

3.3 尖葉假龍膽乙酸乙酯部位對HepG2細胞IRS-1、Akt mRNA表達的影響

由表3可知，與IR組比較，Control組mRNA表達顯著上調(diào)（P＜0.05）；IR+50 μg·mL-1組與IR+500 μg·mL-1組表達也顯著上調(diào)（P＜0.05）。給藥濃度越大，mRNA表達越顯著，并呈現(xiàn)劑量依賴性上升。表明尖葉假龍膽乙酸乙酯部位能上調(diào)胰島素抵抗中信號傳導通路關(guān)鍵基因IRS-1、Akt的表達。

3.4 尖葉假龍膽乙酸乙酯部位對HepG2細胞IRS-1、Akt蛋白表達的影響

調(diào)節(jié)糖代謝的重要途徑之一是胰島素信號傳導通路。其通路的關(guān)鍵蛋白IRS-1、Akt是其發(fā)揮作用的重要體現(xiàn)。由表4和圖2可知，與IR組比較，Control組IRS-1、Akt蛋白表達顯著上調(diào)（P＜0.01）；IR+50 μg·mL-1組與IR+500 μg·mL-1組IRS-1、Akt蛋白表達也顯著上調(diào)（P＜0.05）。給藥濃度越大，蛋白表達越顯著，并呈現(xiàn)劑量依賴性上升。表明尖葉假龍膽乙酸乙酯部位能上調(diào)胰島素信號傳導通路關(guān)鍵蛋白IRS-1、Akt。

4 討論

尖葉假龍膽乙酸乙酯部位中富集了大量的口山酮類化合物[14]?，F(xiàn)代藥理研究表明，口山酮類化合物具有抗糖尿病作用。Bellidifolin給藥后可以上調(diào)胰島素受體InsRα，IRS1，PI3K蛋白，表明Bellidifolin可能通過上調(diào)胰島素信號來改善胰島素抵抗來發(fā)揮作用[12]。Yan Liu等[15]研究表明口山酮類化合物過氫鍵和π-π共軛與α-葡萄糖苷酶發(fā)生作用，來抑制α-葡萄糖苷酶活性來發(fā)揮降糖作用。現(xiàn)代藥理研究表明對尖葉假龍膽改善胰島素抵抗作用，其具體機理還尚不明確，需要進一步對其機理進行探究。胰島素抵抗細胞模型的建立，為尖葉假龍膽改善胰島素抵抗作用提供有利的保障。因為肝臟是糖代謝的主要是靶器官之一，所以選用人肝癌HepG2細胞作為細胞模型；采用高濃度胰島素(10-6mol·L-1)誘導培養(yǎng)HepG2細胞36 h產(chǎn)生胰島素抵抗模型，以葡萄糖試劑盒檢測其對葡萄糖消耗量的影響，結(jié)果表明尖葉假龍膽乙酸乙酯部位促進葡糖糖的消耗量。但其作用不及鹽酸二甲雙胍。本實驗CCK-8法用來篩選安全有效的藥物濃度，結(jié)果提示500 μg·mL-1以下的濃度對細胞無毒性作用并且細胞存活率大于95%，這為研究關(guān)鍵胰島素信號提供理論依據(jù)。

胰島素信號傳導通路中的信號分子受到阻礙或者減弱，就會導致胰島素抵抗（IR）。IR是指外周組織和靶器官對內(nèi)和(或)外源性胰島素的反應(yīng)性和敏感性降低的一種代謝狀態(tài)，是2型糖尿病最主要的病理機制之一[16]。胰島素首先與胰島素受體（InsR）結(jié)合。InsR受體家族包括RS1、IRS2、IRS3等許多亞型，研究顯示，IRS1上Ser/Thr磷酸化活性的變化是其中重要環(huán)節(jié)之一；IRS1上Ser位點磷酸化主要作為一種生理的負反饋調(diào)節(jié)抑制IRS1的活性，與IR的發(fā)生有密切關(guān)系。Akt是PI3K信號通路下游的重要靶蛋白，也與胰島素抵抗有著密切的聯(lián)系[17]。在尖葉假龍膽乙酸乙酯部位干預(yù)胰島素抵抗HepG2細胞6 h后檢測IRS1、Akt的基因表達與蛋白水平。發(fā)現(xiàn)尖葉假龍膽乙酸乙酯部位IR+50 μg·mL-1組與IR+500 μg·mL-1組都能上調(diào)IRS1、Akt的基因與蛋白水平，并且呈現(xiàn)劑量依賴性上調(diào)。表明尖葉假龍膽乙酸乙酯部位可能調(diào)節(jié)胰島素信號通路關(guān)鍵因子，從而改善胰島素抵抗的作用。

表2 尖葉假龍膽乙酸乙酯部位對HepG2細胞葡萄糖消耗量的影響（xˉ±s，n=6）

表3 尖葉假龍膽乙酸乙酯部位對HepG2細胞IRS-1、Akt mRNA表達的影響（xˉ±s，n=3）

圖2 尖葉假龍膽乙酸乙酯部位對胰島素抵抗HepG2細胞IRS-1、Akt蛋白表達的影響

表4 尖葉假龍膽乙酸乙酯部位對HepG2細胞IRS-1、Akt蛋白表達的影響（xˉ±s，n=3）

綜上所述，尖葉假龍膽乙酸乙酯部位對胰島素抵抗HepG2細胞胰島素信號有顯著影響，上調(diào)IRS-1、Akt信號因子可能改善胰島素作用。本研究為尖葉假龍膽在抗糖尿病領(lǐng)域提供一定的理論基礎(chǔ)，為追蹤分離尖葉假龍膽中的主要活性成分提供科學依據(jù)，深入的研究機理仍然缺乏，尖葉假龍膽改善胰島素抵抗作用的機理研究有待于進一步探究。

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Effects of EthylAcetate Extracts of Gentianella acuta on IRS-1 andAkt in Insulin Resistance HepG2 Cells

Gao Jiaqi1,2,3,Wei Ying1,2,3,Qu Lingxia1,2,3,Liu Yongqiao1,2,3,Liu Yibing1,Xu Tunhai1,2,3,Liu Tonghua2,3
(1.School of Chinese materia Medica,Beijing University of Chinese Medicine,Beijing 100029,China;2.Beijing Key Laboratory on Traditional Chinese Medicine Health Cultivation,Beijing University of Chinese Medicine,Beijing 100029,China; 3.Key Laboratory on Traditional Chinese Medicine Health Cultivation of the Ministry of Education,Beijing 100029,China)

This paper was aimed to study the effect of ethyl acetate extracts of Gentianella acuta on the gene and protein of insulin significant signal IRS-1 and Akt in insulin resistance(IR)HepG2 cells.The CCK-8 method was used to detect the HepG2 cell activity.HepG2 cells of human liver cancer were cultured with high concentration insulin(10-6mol·L-1)for 36 hours to establish IR cell model.According to the results of CCK-8,the control group,model(IR)group,ethyl acetate extracts of Gentianella acuta IR+50 μg·mL-1,IR+500 μg·mL-1group,and the metformin group were divided. Glucose consumption was measured with a glucose assay kit.The expressions of IRS-1 and Akt gene in IR HepG2 cells were detected by RT-PCR after 6-hour using of ethyl acetate extracts of Gentianella acuta.Western blot was used to detect the expression of IRS-1 and Akt protein after 6-hour using of ethyl acetate extracts of Gentianella acuta.The results showed that when the concentration of ethyl acetate extracts of Gentianella acuta was 500 μg·mL-1,the survival rate reached 95%.When the concentration was higher than 500 μg·mL-1,the survival rate decreased.Compared with the IR group,the IR+50 μg·mL-1group and the IR+500 μg·mL-1group promoted glucose consumption of IR HepG2 cells, but its effect was less than that of the metformin hydrochloride group.The expression of IRS-1 and Akt in IR HepG2 cells was significantly increased by using RT-PCR in the group of IR+50 μg·mL-1and IR+500 μg·mL-1compared with the IR group after 6-hour using of ethyl acetate extracts of Gentianella acuta.The expression of IRS-1 and Akt protein in the group of IR+50 μg·mL-1and IR+500 μg·mL-1was significantly higher than that in the IR group after 6-hour medication detected by western blot.It was concluded that the ethyl acetate extracts of Gentianella acuta can increase the expression of IRS-1,Akt gene,the expression of IRS-1 and Akt protein in HepG2 cells,which may be the mechanism of IR improvement.

Ethyl acetate extracts of Gentianella acuta,HepG2 cells,insulin resistance,insulin signal

10.11842/wst.2017.05.011

R96

A

（責任編輯：陳寧，責任譯審：王晶）

2017-04-19

修回日期：2017-05-18

＊科學技術(shù)部國際科技合作項目（2010DFB33260）：中醫(yī)藥干預(yù)治胰島素抵抗創(chuàng)新中藥研究，負責人：徐暾海；北京中醫(yī)藥大學創(chuàng)新團隊-中醫(yī)藥干預(yù)糖尿病及其并發(fā)癥研究團隊（2011-CXTD-19），負責人：劉銅華。

＊＊通訊作者：通訊作者：徐暾海，教授，博士生導師，研究方向：中藥活性成分及質(zhì)量控制研究。