蘋果MdAFS基因亞細胞定位表達載體的構建及分析

丁瑞瑞,王 露,王茹茹,劉 宇,張元湖*,成妮妮

1.山東農(nóng)業(yè)大學 生命科學學院,山東 泰安 271018 2.臨沂大學 生命科學學院,山東 臨沂 276000

蘋果MdAFS基因亞細胞定位表達載體的構建及分析

丁瑞瑞1,王 露1,王茹茹1,劉 宇1,張元湖1*,成妮妮2*

1.山東農(nóng)業(yè)大學 生命科學學院,山東 泰安 271018 2.臨沂大學 生命科學學院,山東 臨沂 276000

為研究萜烯合酶亞細胞定位的改變對植物萜類及其生長發(fā)育特性的影響，以青香蕉蘋果（Malus domesticaBorkh cv.White Winter Pearmain)果皮、菊花、酵母和擬南芥為材料，采用PCR技術分別克隆了α-法尼烯合酶基因(AFS)、Rubisco強啟動子(Ru)、線粒體定位轉運肽(Mit)與葉綠體定位轉運肽(Pla)，并利用plantCARE軟件和SignalP4.1Server網(wǎng)站對所得啟動子和轉運肽序列進行了預測分析。結果表明Ru序列具備強啟動子特有的TATAbox、CAATbox以及多種相關的激素響應元件，且所得線粒體和葉綠體定位轉運肽也均預測到轉運肽的功能。利用所得的以上序列分別構建了由Ru強啟動子驅(qū)動的線粒體和葉綠體定位的AFS基因表達載體，并成功轉化獲得了轉基因煙草植株，實時熒光定量PCR表明目的基因在轉基因植物中有較高的表達，并且存在空間表達特異性。

蘋果;MdAFS基因;亞細胞;表達

萜類物質(zhì)是一類重要的次生代謝物，其中具有揮發(fā)性的低分子量萜類在動植物種內(nèi)及種間的信息交流中發(fā)揮了重要作用，如在植物在受到昆蟲侵害時往往會有針對性的釋放一組萜類物質(zhì)，作為特異性的信號吸引其天敵進而起到間接防御的作用[1,2]。萜烯合酶是催化萜類物質(zhì)合成的末端酶，依據(jù)其產(chǎn)物分子量的不同，其亞細胞定位也存在差異，如一般認為分子量較小的單萜（C10）是由定位于質(zhì)體中的單萜合酶產(chǎn)生，而倍半萜（C15）則由細胞質(zhì)定位的倍半萜合酶合成。近年來對萜烯合酶亞細胞定位的報道使人們對其定位部位有了新的認識，如發(fā)現(xiàn)質(zhì)體中存在二萜的底物，將二萜合酶定位到細胞質(zhì)中后也能夠合成相應的二萜[3]，且產(chǎn)生的二萜含量往往較質(zhì)體定位的更高；另一方面，由于萜烯合酶的產(chǎn)物不專一性，改變其亞細胞定位后通常伴隨著其他新的萜類物質(zhì)的產(chǎn)生[4]。有研究表明，將存在細胞質(zhì)中的草莓的芳樟醇/橙花叔醇合酶定位到質(zhì)體中后，不僅改變了其萜類產(chǎn)物的含量和種類，尤其是提高了芳樟醇的濃度，而且還影響到了防御蚜蟲取食的行為[5]。同樣將細胞質(zhì)定位的β-法尼烯合酶定位到煙草線粒體中合成后不僅產(chǎn)生了大量β-法尼烯，還起到了轉基因煙草對蚜蟲的驅(qū)散作用[6]。

α-法尼烯是一種倍半萜類揮發(fā)性有機物，存在于蘋果、梨、玉米、棉花、梔子花等多種植物中，是昆蟲的誘導劑[7]和信息素[8]，在植物的防御中起重要作用，并且被認為與冷藏蘋果和梨果實重大的生理病害—虎皮病的發(fā)生等有關[9]。定位在細胞質(zhì)中的α-法尼烯合酶（AFS）是α-法尼烯合成途徑中的關鍵酶與最終酶，直接影響α-法尼烯的產(chǎn)生，且研究表明其不僅具有倍半萜合酶的活性還具有單萜合酶的活性。

萜類合酶（TPS）在植物體內(nèi)定位過表達或者阻斷萜類的合成途徑能夠改變萜類合成的數(shù)量和種類，影響植物的生長生理特性。有研究表明過表達倍半萜合酶基因后酶產(chǎn)物量過低或難以測出，因此利用強啟動子驅(qū)動并進行亞細胞定位研究有助于解決這一問題[4]。本實驗克隆了蘋果中α-法尼烯合酶基因，菊花中Rubisco強啟動子以及擬南芥葉片中葉綠體定位肽與酵母菌中線粒體定位肽序列，構建表達載體，試圖在煙草不同亞細胞部位過表達α-法尼烯合酶基因，為進一步研究萜烯合酶亞細胞定位對植物萜類物質(zhì)及其生長發(fā)育特性奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料及試劑

青香蕉蘋果(Malus domesticaBorkh.cv.white winter pearmain）購于泰安郊區(qū)果園，菊花(Chrysanthemum morifolium）購買于花店，哥倫比亞型（Columbia）擬南芥（Arabidopsis thaliana）和煙草NC89為本實驗室保存。大腸桿菌E.coliDH5α與農(nóng)桿菌菌株LBA4404由本實驗保存，釀酒酵母，連接載體pMD18-T購自大連寶生物有限公司，真核表達載體pBI121（經(jīng)過改造，含有SalI酶切位點）。TaqDNA聚合酶，DNAMarker，反轉錄試劑盒，定量試劑盒購自北京全式金生物技術有限公司，各種限制性內(nèi)切酶，T4-DNA連接酶購自Fermentas公司，質(zhì)粒小提和凝膠回收試劑盒購自天根生化科技公司，組織培養(yǎng)用的MS培養(yǎng)基，酵母膏蛋白胨培養(yǎng)基以及其它各種生化試劑均為國產(chǎn)的AR級試劑。

1.2 材料處理

T1代轉基因煙草NC89種子經(jīng)MS加卡那霉素培養(yǎng)基在25℃培養(yǎng)箱中篩選2周后移入培養(yǎng)室，培養(yǎng)條件為相對濕度50～60%，光照強度145mmol·m-2·s-1，光照條件為16 h光照/8 h黑暗。以植物幼苗葉片和盛花期不同器官（根、莖、葉、花）為試驗材料取樣，置于液氮中冷凍，–80℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 基因的提取

利用Ultrapure RNAKit超純RNA提取試劑盒（CWBIO）提取RNA，反轉錄得到第一鏈cDNA，存于–20℃冰箱作為基因克隆和實時熒光定量PCR的模板備用。CTAB微量法提取菊花或野生型擬南芥葉片基因組DNA。溶菌酶法提取酵母基因組。

1.4 引物設計

根據(jù)已知序列設計特異引物，PCR引物均由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。如表1所示。

1.5 構建載體

公司合成表1引物，進行PCR擴增:94℃預變性5 min，94℃變性1 min，55℃退火1 min，72℃延伸1 min 15 s，循環(huán)35次，72℃延伸10 min。取20mL反應液，在1%瓊脂糖凝膠上進行電泳，在凝膠成像系統(tǒng)中觀察并存儲照片。連接載體為pMD18-T，插入片段與載體的摩爾數(shù)比為3-10:1。4 ?C條件下連接過夜，然后轉化大腸桿菌。鑒定陽性的克隆送上海生工生物公司測序測序，Pla/Mit會有兩種插入方向，通過測序或特異性引物與通用引物配對分別擴增來判斷其插入方向，選擇正向插入的重組載體。取PCR鑒定為陽性的單菌落，接種于LB（Amp+）液體培養(yǎng)基中，培養(yǎng)至對數(shù)生長期，提取質(zhì)粒DNA。酶切、回收，將回收的片段利用前面的連接方法連接，轉化，篩菌，測序，構建成克隆載體pMD18-T+Pla/Mit+AFS。和前面所述的方法類似，轉化，篩菌，測序，將pBI121載體的35S啟動子替換成Rubisco強啟動子，構建成中間表達載體pBI121+Ru。質(zhì)粒pBI121+Ru和pMD18-T+Pla/Mit+AFS的酶切。同樣地，和前面所述的方法類似，轉化，篩菌，測序，構建成真核表達載體pBI121+Ru+Pla/Mit+AFS。

1.6 農(nóng)桿菌介導煙草轉化

利用農(nóng)桿菌介導法，將構建成真核表達載體pBI121+Ru+Pla/Mit+AFS轉入煙草中，經(jīng)過100 mg·L-1Kan抗性篩選后，PCR檢測得到陽性轉基因植株，進行后續(xù)試驗。

1.7 實時熒光定量PCR分析

分別以T2代6個轉基因株系葉片和盛花期的不同組織部位(根、莖、葉、花）為材料，利用Ultrapure RNAKit超純RNA提取試劑盒（CWBIO）提取RNA，反轉錄得到第一鏈cDNA，存于–20℃冰箱保存，備用。

利用構建載體內(nèi)參引物 18SF1：5￠-TTCCTAGTAAGCGCGAGTCATCAGC-3￠，18SR1：5￠-GCGACGGGCGGTGTGT-3￠和AFS定量引物 PaFSF：5￠-AAAGCGACAATCTCGGCACAA-3￠，PaFSR：5￠-GCGCGAAATGGTGGTTCTCTAAT-3￠，進行 qPCR 基因表達分析。

2 結果與分析

2.1 AFS、Ru強啟動子、Mit和Pla的克隆

利用Ultrapure RNAKit超純RNA提取試劑盒（CWBIO）從青香蕉蘋果果皮中提取總RNA并反轉錄，CTAB小提法從菊花和擬南芥葉片中提取基因組DNA，溶菌酶法提取酵母菌基因組，分別用特異性引物RuFS1和RuFS2、Ru1和Ru2、PlasmidP1和PlasmidP2、MitP1和MitP2進行聚合酶鏈式反應（PCR）擴增AFS、Ru、Pla、Mit片段，PCR反應產(chǎn)物經(jīng)過瓊脂糖凝膠電泳，擴增片段大小與實際大小基本一致（圖1）?；厥誔CR產(chǎn)物，連接pMD-18T克隆載體，轉化大腸桿菌，利用菌落PCR篩選陽性克隆，挑取陽性菌落，搖菌測序。測序結果顯示，AFS、Ru、Mit與Pla基因序列片段長度分別為1780 bp、1100 bp、87 bp、156 bp。

圖1 基因克隆電泳圖Fig.1 Electrophoresis results of genes cloningMarker：DL2000 ladder；A：AFS擴增片段;B：Ru擴增片段；C：Mit擴增片段；D：Pla擴增片段。Marker:DL2000 ladder;A:Amplified fragment ofAFS;B:Amplified fragment ofRu;C:Amplified fragment ofMit;D:Amplified fragment ofPla

2.2 Ru、Mit和Pla序列預測分析

用DNAman軟件將所擴增的片段與GeneBank注冊的序列比對，并利用PlantCARE在線網(wǎng)站對Ru啟動子序列進行預測分析。比對結果顯示，AFS、Pla、Mit基因序列和注冊的序列保持一致，Ru啟動子序列與GeneBank注冊的序列有個別堿基的不同，但用PlantCARE網(wǎng)站預測的結果顯示所擴增的Ru序列具有特有的TATAbox和CAATbox以及多種相關的激素響應元件，具有強啟動子的典型特征(圖2）。利用SignalP4.1Server(http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/)對擴增的葉綠體和線粒體定位肽序列進行細胞定位預測(圖3），從預測結果中可以看出，這兩段定位肽均具有信號肽的功能。

圖2 Ru啟動子核苷酸序列預測Fig.2 Deduced nucleotide sequences ofRupromoter

圖3 線粒體和葉綠體轉運肽序列預測Fig.3 Deduced sequences of Mitochondria transit peptide and chloroplast signal peptideA：葉綠體定位肽；B：線粒體定位肽A:Targeting peptide of chloroplast;B:Targeting peptide of mitochondria

2.3 真核表達載體構建

將擬南芥中的葉綠體信號肽和釀酒酵母菌中的線粒體轉運肽連接在AFS基因的上游，將AFS分別定位到煙草的葉綠體和線粒體中，再結合菊花中Rubisco的超強啟動子來替換CaMV35S組成型啟動子(圖4），在煙草的不同部位（葉綠體和線粒體）超強表達AFS，最后經(jīng)過雙酶切反應和測序，結果證明真核表達載體構建成功。

圖4 表達載體的構建圖Fig.4 Construction of expression vector

2.4 qPCR分析不同轉基因煙草株系中AFS的表達

對在轉錄水平鑒定為陽性的轉基因植株，從T1代隨機選取6個轉基因株系，對AFS基因的相對表達量進行實時熒光定量PCR檢測(圖5）。qPCR也進一步證明法尼烯合酶基因在煙草中得以表達。本研究分別選取三個表達量最高的轉基因植株（P1、P2、P3；M3、M4、M5）進行后續(xù)的實驗研究。

圖5 qPCR分析不同轉基因煙草株系中AFS的表達Fig.5 Expression ofAFSin different transgenic tobacco strains by qPCRA：葉綠體過表達植株；B：線粒體過表達植株A:Chloroplast over-expression plants;B:Mitochondria over-expression plants

2.5 轉基因植株AFS表達的空間特異性

為了檢測在煙草葉綠體、線粒體超表達AFS在空間上表達，我們選取盛花期轉基因株系，分別取根、莖、葉、花，利用qPCR對AFS的表達量進行定量測定。結果表明，在葉綠體中過表達AFS的轉基因植株葉片中的AFS的表達量最高，根、莖、花中的表達量遠遠低于葉片，并且在這三種器官中AFS的表達量沒有顯著差異(圖6，A）。在線粒體中過表達AFS的轉基因植株，同樣是在葉片中其表達量最高，但花、莖，根中的表達量與葉中差異不顯著(圖6，B）。線粒體與葉綠體中AFS表達含量相比較而言，葉綠體葉片中AFS的表達量約是線粒體葉片表達量的兩倍，但花器官中線粒體AFS表達量卻是葉綠體的四倍左右，其它部位差異不大。以上結果說明，在葉綠體和線粒體中過表達AFS的轉基因植株中，AFS存在器官空間特異性表達，并且此表達與目的基因的區(qū)室化定位并沒有直接關系。

3 討論

倍半萜合酶利用FPP來合成C15倍半萜類化合物，一般認為倍半萜合酶定位于細胞質(zhì)中[10]。有研究在細胞質(zhì)過表達FaNES1基因并未測出產(chǎn)物芳樟醇和橙花叔醇，后將FaNES1在線粒體定位肽的作用下定位到線粒體中，其主要原因是由于線粒體是泛醌生物合成的場所并且擬南芥中具有包含線粒體定位肽的FPP合酶同源異構體[11,12]，發(fā)現(xiàn)不僅提高了產(chǎn)物芳樟醇和橙花叔醇的含量，而且改變了植物的生態(tài)效應[4]。Rubisco啟動子轉錄活性比35S啟動子強7～8倍[13]，因此我們嘗試利用菊花的Rubisco小亞基基因超強啟動子取代35S啟動子驅(qū)動一種胞質(zhì)定位的法尼烯合酶進行超表達，并通過融合特異的轉運肽改變其作用區(qū)間至葉綠體和線粒體中，以研究該倍半萜合酶在表達量或表達亞細胞部位發(fā)生改變時對整個萜類代謝網(wǎng)絡及相關生態(tài)效應的影響。

研究表明，合成萜類基因的表達通常具有時空特異性[14]。本研究通過構建Ru強啟動子與目的基因及線粒體、葉綠體定位肽基因表達載體，成功轉化煙草并獲得了轉基因植株,實時熒光定量PCR檢測證明，α-法尼烯合酶基因存在組織特異性表達，并且在線粒體和葉綠體轉基因植株中α-法尼烯合酶基因在葉中含量的表達最高，這將有助于進一步研究該基因的組織特異性功能。

最新研究發(fā)現(xiàn)，倍半萜法尼烯的還原產(chǎn)物法尼烷，由于其低吸濕性和能量密度被認為是新型生物燃料良好的生物前體，具有較高的燃燒效率，成為傳統(tǒng)石油良好的替代品[15,16]，因此倍半萜法尼烯合酶的代謝過程具有重大的研究和應用價值。本實驗室在后期試驗將繼續(xù)對轉基因植株進行生理特性、抗逆性差異及可能的分子機制，深入研究該基因在萜類物質(zhì)合成途徑中的網(wǎng)絡調(diào)控作用。

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Construction and Analysis of AppleMdAFSGene Expression Vector into Different Subcellular Compartments

DINGRui-rui1,WANGLu1,WANGRu-ru1,LIUYu1,ZHANGYuan-hu1*,CHENGNi-ni2*
1.College of Life Sciences/Shandong Agricultural University,Tai’an271018,China
2.College of Life Sciences/Linyi University,Linyi276000,China

To study the change of terpene synthase subcellular localization influenced terpenoids metabolism and plant development,we used the White winter pearmain peels,Chrysanthemum morifolium,Yeast and Arabidopsis thalianas as experimental materials and cloned the strong promoter of alpha-Farnesene synthase,Rubisco,transit peptide of mitochondria(mit)and transit peptide of chloroplast(pla)by RT-PCR.Then the sequence of promoter and transit peptide were predicted by PlantCARE and SignalP4.1Server.The results showed thatRuhad typical characteristics of strong promoter elements(TATAbox,CAATbox and hormone response elements)and both ofmitandplamaybe have the function of transit peptide.We have successfully constructed the alpha-Farnesene synthasegene expression vector in different subcellular localization driven byrubiscostrong promoter,and transformed them into tobacco.Quantitative real-time PCR showed that the gene had a higher expression and was tissue-specific in transgenic tobacco.

Apple;MdAFSgene;subcellular;expression

S661.1

A

1000-2324(2017)04-0576-06

2015-12-10

2016-01-11

國家自然科學基金項目(31370359)

丁瑞瑞(1990-),女,在讀碩士研究生,主要從事植物次生代謝與分子調(diào)控.E-mail:ruidingc@163.com

*通訊作者:Author for correspondence.E-mail:yhzhang9@163.com;chengnn2002@163.com