基于化學(xué)計(jì)量學(xué)和多指標(biāo)綜合指數(shù)法比較研究丹參紅花藥對(duì)不同制法活血化瘀作用

瞿城 唐于平 史旭芹 周桂生 尚爾鑫 尚麗麗 郭建明 劉培 +趙菁 趙步長(zhǎng) +段金廒 +??

[摘要]基于主成分分析（PCA）、聚類熱圖分析和多指標(biāo)綜合指數(shù)法，評(píng)價(jià)丹參紅花藥對(duì)不同制法（乙醇、50%乙醇和水）對(duì)急性血瘀大鼠血液流變學(xué)和凝血功能的影響，優(yōu)選丹參紅花藥對(duì)活血化瘀作用的最佳提取方式。采用皮下注射鹽酸腎上腺素和冰水浴共同刺激復(fù)制大鼠急性血瘀模型，通過(guò)測(cè)定全血黏度（WBV）、血漿黏度（PV）、血沉（ESR）和紅細(xì)胞壓積（HCT），觀察丹參紅花藥對(duì)不同制法、不同劑量對(duì)血瘀大鼠血液流變學(xué)的影響；通過(guò)測(cè)定活化部分凝血酶時(shí)間（APTT）、凝血酶時(shí)間（TT）、凝血酶原時(shí)間（PT）、血漿纖維蛋白原（FIB）含量及血小板最大聚集率（ADP），觀察丹參紅花藥對(duì)不同制法對(duì)血瘀大鼠凝血功能及血小板聚集的影響。采用PCA、聚類熱圖分析和多指標(biāo)綜合指數(shù)法綜合評(píng)價(jià)丹參紅花藥對(duì)不同制法的總活血化瘀效應(yīng)。與空白組比較，模型組大鼠血液流變學(xué)和凝血功能指標(biāo)均有顯著性差異；與模型組比較，不同制法丹參紅花藥對(duì)低、中、高3個(gè)劑量給藥組均能較好地改善血瘀大鼠的血液流變學(xué)和凝血功能指標(biāo)，并呈一定的量效關(guān)系。綜合PCA、聚類熱圖分析和多指標(biāo)綜合指數(shù)法評(píng)價(jià)得出，丹參紅花藥對(duì)不同制法、不同劑量組中50%乙醇高劑量組的活血化瘀作用最好；相同劑量下，不同制法中50%乙醇給藥組活血化瘀效應(yīng)較好。以上結(jié)果說(shuō)明，不同制法丹參紅花藥對(duì)能明顯改善血瘀大鼠的血液流變學(xué)及凝血功能異常，且50%乙醇提取丹參紅花藥對(duì)活血化瘀的作用最優(yōu)，為臨床更有效應(yīng)用丹參紅花提供了科學(xué)依據(jù)。

[關(guān)鍵詞]丹參； 紅花； 活血化瘀； 不同制法； 急性血瘀； 化學(xué)計(jì)量學(xué)； 多指標(biāo)綜合指數(shù)法

Comparative study on promoting blood effects of DanshenHonghua herb

pair with different preparations based on chemometrics and multiattribute

comprehensive index methods

QU Cheng1， TANG Yuping1*， SHI Xuqin1， ZHOU Guisheng1， SHANG Erxin1， SHANG Lili1， GUO Jianming1， LIU Pei1， ZHAO Jing2， ZHAO Buchang2， DUAN Jinao1

（1 Jiangsu Collaborative Innovation Center of Chinese Medicinal Resources Industrialization，

Jiangsu Key Laboratory for High Technology Research of Traditional Chinese Medicine Formulae，

Key Laboratory of Chinese Medicinal Resources Recycling Utilization， State Administration of Traditional Chinese Medicine，

Nanjing University of Chinese Medicine， Nanjing 210023， China；

2 Buchang Pharmaceutical Co， Ltd， Xi′an 710000， China）

[Abstract]To evaluate the promoting blood circulation and removing blood stasis effects of DanshenHonghua（DH） herb pair with different preparations （alcohol， 50% alcohol and water） on blood rheology and coagulation functions in acute blood stasis rats， and optimize the best preparation method of DH based on principal component analysis（PCA）， hierarchical cluster heatmap analysis and multiattribute comprehensive index methods Ice water bath and subcutaneous injection of adrenaline were both used to establish the acute blood stasis rat model Then the blood stasis rats were administrated intragastrically with DH （alcohol， 50% alcohol and water） extracts The whole blood viscosity（WBV）， plasma viscosity（PV）， erythrocyte sedimentation rate（ESR） and haematocrit（HCT） were tested to observe the effects of DH herb pair with different preparations and doses on hemorheology of blood stasis rats； the activated partial thromboplastin time（APTT）， thrombin time（TT）， prothrombin time（PT）， and plasma fibrinogen（FIB） were tested to observe the effects of DH herb pair with different preparations on blood coagulation function and platelet aggregation of blood stasis rats Then PCA， hierarchical cluster heatmap analysis and multiattribute comprehensive index methods were all used to comprehensively evaluate the total promoting blood circulation and removing blood stasis effects of DH herb pair with different preparations The hemorheological indexes and coagulation parameters of model group had significant differences with normal blank group As compared with the model group， the DH herb pair with different preparations at low， middle and high doses could improve the blood hemorheology indexes and coagulation parameters in acute blood stasis rats with doseeffect relation Based on the PCA， hierarchical cluster heatmap analysis and multiattribute comprehensive index methods， the high dose group of 50% alcohol extract had the best effect of promoting blood circulation and removing blood stasis Under the same dose but different preparations， 50% alcohol DH could obviously improve the hemorheology and blood coagulation function in acute blood stasis rats These results suggested that DH herb pair with different preparations could obviously ameliorate the abnormality of hemorheology and blood coagulation function in acute blood stasis rats， and the optimized preparation of DH herb pair on promoting blood effects was 50% alcohol extract， providing scientific basis for more effective application of the DH herb pair in modern clinic medicineendprint

[Key words]Danshen； Honghua； promoting blood circulation and removing blood stasis； different preparations； acute blood stasis； chemometrics； multiattribute comprehensive index method

藥對(duì)是中醫(yī)臨床常用的相對(duì)固定的兩味藥的配伍組合，是中藥配伍應(yīng)用的基本形式[1]。丹參紅花是經(jīng)典活血化瘀相須藥對(duì)，丹參為唇形科植物Salvia miltrorrhiza Bge的干燥根及根莖，始載于《神農(nóng)本草經(jīng)》，被列為上品，味苦、性微寒，具有活血調(diào)經(jīng)、祛瘀止痛、涼血消癰、除煩安神的功效；紅花為菊科植物Carthamus tinctorius L的干燥管狀花，始載于《開(kāi)寶本草》，味辛微苦、性溫，具有活血通經(jīng)、祛瘀止痛、解毒的功效，為活血化瘀要藥。兩者皆入心、肝經(jīng)，丹參性寒主降，行而不傷，有利于營(yíng)血新生；紅花性溫主升，補(bǔ)而兼行、補(bǔ)而兼通，兩藥同用，一升一降，內(nèi)外通和，使行氣活血之功尤為顯著；二藥合用祛瘀生新，除邪而不傷正，共奏活血通絡(luò)、祛瘀生新之功[24]。丹參與紅花配伍后的提取物在臨床上被廣泛用于治療心腦血管疾病[5]，現(xiàn)已被開(kāi)發(fā)成20多種中成藥，其中，丹紅注射液年銷售額已超40億?，F(xiàn)代研究表明，丹參中的有效成分主要是以丹酚酸B為代表的丹參總酚酸類以及以丹參酮ⅡA為代表的丹參酮類成分，紅花中的活性成分主要為以羥基紅花黃色素A為代表的查耳酮類和黃酮類成分，這些成分在丹參紅花活血化瘀效應(yīng)方面均發(fā)揮了重要作用[67]。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，不同制法、不同比例的丹參紅花配伍合煎能促進(jìn)丹酚酸類、丹參酮類、查耳酮類和黃酮類成分的溶出，但其配伍后活血化瘀的功效變化未見(jiàn)報(bào)道[8]。

本實(shí)驗(yàn)在前期研究基礎(chǔ)上，選擇丹參紅花（3∶1）藥對(duì)不同制法（乙醇、50%乙醇、水）提取物為研究對(duì)象，觀察該藥對(duì)不同制法、不同劑量對(duì)急性血瘀模型大鼠的血液流變學(xué)、凝血功能及血小板聚集的影響。采用主成分分析（PCA）聯(lián)合聚類熱圖分析、多指標(biāo)綜合指數(shù)法對(duì)不同制法的丹參紅花藥對(duì)活血化瘀效應(yīng)進(jìn)行綜合比較分析，以期通過(guò)整體動(dòng)物實(shí)驗(yàn)，探討丹參紅花發(fā)揮活血化瘀功效的基本規(guī)律，為闡明該藥對(duì)的作用機(jī)制及配伍規(guī)律奠定基礎(chǔ)。

1材料

11動(dòng)物SPF級(jí)健康SD大鼠，雌性，體質(zhì)量220～250 g，購(gòu)于上海杰思捷實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司，許可證號(hào)SCKY（滬）20130006。

12藥品與試劑復(fù)方丹參滴丸（天士力制藥集團(tuán)股份有限公司，批號(hào)151227）；阿司匹林腸溶片（拜耳醫(yī)藥保健有限公司，批號(hào)BJ24257）；鹽酸腎上腺素注射液（上海禾豐制藥有限公司，批號(hào)160609）；水合氯醛（國(guó)藥集團(tuán)試劑有限公司，批號(hào)20161121）；一次性使用人體靜脈血樣采集容器（32%枸櫞酸鈉抗凝，江蘇康潔醫(yī)療器械有限公司，批號(hào)20161105）。活化部分凝血活酶時(shí)間（APTT）、凝血酶原時(shí)間（PT）、凝血酶時(shí)間（TT）、血漿纖維蛋白原（FIB）試劑盒，均購(gòu)自北京世帝科學(xué)儀器公司。

13藥材的鑒定與提取丹參（山東臨沂，批號(hào)160401），紅花（新疆伊犁，批號(hào)160401）藥材購(gòu)自安徽豐原銅陵中藥飲片有限公司，并經(jīng)南京中醫(yī)藥大學(xué)陳建偉教授鑒定分別為唇形科植物丹參S miltiorrhiza的干燥根和根莖，菊科植物紅花C tinctorius的干燥花，均符合《中國(guó)藥典》2015年版項(xiàng)下標(biāo)準(zhǔn)。

丹參紅花按3∶1比例混勻，共500 g，分別進(jìn)行熱回流水提取、熱回流50%乙醇提取和熱回流乙醇提取，依次用10倍量的溶劑進(jìn)行熱回流提取3次，每次15 h，自然冷卻后，傾出溶液，過(guò)濾藥渣，合并3次提取液進(jìn)行真空減壓濃縮至每克浸膏1 g生藥，得制備樣品，冷藏備用。

14儀器LGR80B電腦血液黏度測(cè)試儀（北京世帝科學(xué)儀器公司）；LGPABER1型血小板聚集凝血因子分析儀（北京世帝科學(xué)儀器公司）；Anke LXJIIB離心機(jī)；Anke TDL40B（上海安亭科學(xué)儀器廠）；電子分析天平（BT125D，sartorius，德國(guó)）。

2方法

21急性血瘀大鼠模型的建立除空白組外，其余各組大鼠均皮下注射鹽酸腎上腺素注射液08 mg kg-1，共2次，間隔時(shí)間為4 h。第一次皮下注射鹽酸腎上腺素后2 h，將大鼠置于0～2 ℃冰水中游泳4 min，復(fù)制大鼠急性血瘀模型[9]。最后一次皮下注射鹽酸腎上腺素后大鼠禁食不禁水飼養(yǎng)，12 h后腹主動(dòng)脈取血檢測(cè)血液流變學(xué)和凝血功能相關(guān)指標(biāo)。

22分組與給藥將78只SD大鼠按體質(zhì)量隨機(jī)分為13組，每組6只，分別為正常組、模型組、復(fù)方丹參滴丸（DSDW）、阿司匹林（ASPL）陽(yáng)性對(duì)照組、不同提取方式的丹參紅花藥對(duì)低、中、高劑量組（DH低，DH中，DH高）。陽(yáng)性對(duì)照組大鼠灌胃給予復(fù)方丹參滴丸、阿司匹林，劑量為每次010 g·kg-1[1012]；空白組和模型組大鼠灌胃給予等體積生理鹽水；丹參紅花（以藥典為基準(zhǔn)，設(shè)定丹參紅花藥對(duì)總量16 g為臨床1倍量）各組大鼠均按臨床1，2，5倍量灌胃給藥，其生藥量分別為144，288，720 g·kg-1。所有給藥組大鼠統(tǒng)一灌胃給藥，每次每100 g體質(zhì)量1 mL，每日2次，早晚各1次，共7次，第5次給藥后除空白組外其余各組按照相應(yīng)的造模方法復(fù)制急性血瘀模型，于第7次給藥后30 min腹主動(dòng)脈取血，測(cè)定血液流變學(xué)及凝血功能相關(guān)指標(biāo)。動(dòng)物給藥劑量按體表面積換算系數(shù)計(jì)算：人臨床用量×0018/200×1 000×臨床等效量的倍數(shù)（g生藥/kg大鼠體質(zhì)量）[9]。

23檢測(cè)指標(biāo)各實(shí)驗(yàn)組大鼠均于第7次給藥30 min后，采用10%水合氯醛進(jìn)行麻醉，腹主動(dòng)脈插管進(jìn)行取血，以枸櫞酸鈉（38%）1∶9抗凝，吸取1 mL全血置于壓積管中靜置1 h讀數(shù)記錄血沉（ESR），然后3 000 r·min-1離心30 min，讀數(shù)記錄紅細(xì)胞壓積（HCT）。使用LGR80 B電腦血液黏度測(cè)試儀測(cè)定全血黏度（WBV）；測(cè)完全血黏度的全血，800 r·min-1離心10 min后吸取富血小板血漿（PRP），采用LGPABER型血小板聚集凝血因子分析儀測(cè)定血小板聚集率（ADP），然后3 000 r·min-1離心10 min吸取貧血小板血漿（PPP），使用LGR80 B電腦血液黏度測(cè)試儀測(cè)定血漿黏度（PV），LGPABER1型血小板聚集凝血因子分析儀測(cè)定凝血功能相關(guān)指標(biāo)（APTT，PT，TT，F(xiàn)IB）。血漿TT，PT，APTT和FIB的測(cè)定按照相應(yīng)試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。endprint

24統(tǒng)計(jì)學(xué)分析實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用SPSS 190軟件中的Descriptives進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，實(shí)驗(yàn)結(jié)果采用±s表示；與正常組和模型組比較采用軟件中ANOVA中的Dunnett法進(jìn)行組間兩兩比較，P<005表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

25效應(yīng)整合依據(jù)多指標(biāo)綜合指數(shù)法，對(duì)WBV，PV，ESR，HCT，TT，PT，APTT，F(xiàn)IB和ADP多個(gè)指標(biāo)進(jìn)行單一化處理，計(jì)算各給藥組的總活血效應(yīng)值。首先對(duì)各指標(biāo)數(shù)據(jù)進(jìn)行標(biāo)化，當(dāng)模型組的相應(yīng)指標(biāo)數(shù)值（Value）與正常組相比升高時(shí)，V標(biāo)化=（V模型-V給藥） / V模型；當(dāng)模型組的相應(yīng)指標(biāo)數(shù)值與正常組相比降低時(shí)，V標(biāo)化=（V給藥-V模型） / V模型。標(biāo)化指標(biāo)的權(quán)重首先依據(jù)這些指標(biāo)在臨床中的重要性，查閱5年來(lái)急性血瘀相關(guān)文獻(xiàn)160余篇，其中132篇檢測(cè)了WBV，129篇檢測(cè)了PV，121篇檢測(cè)了HCT，110篇檢測(cè)了FIB，65篇檢測(cè)了APTT，62篇檢測(cè)了PT，53篇檢測(cè)了ADP，49篇檢測(cè)了TT。然后結(jié)合同行專家對(duì)各指標(biāo)在活血化瘀效應(yīng)整體評(píng)價(jià)中的相對(duì)程度打分，最后再依據(jù)直觀的變量重要性投影值（variable importance in the projection，VIP）處理結(jié)果綜合給出各指標(biāo)的權(quán)重系數(shù)，其中，總活血效應(yīng)值即為各指標(biāo)標(biāo)化值乘以權(quán)重的加和值[1113]。各個(gè)指標(biāo)VIP值的計(jì)算是將各組大鼠的所有指標(biāo)導(dǎo)入MassLynx v41（Waters公司）軟件的EZ info中，采用主成分分析法（principal components analysis，PCA）中的Pareto進(jìn)行規(guī)格化處理得到各組活血化瘀效應(yīng)的得分圖。然后采用軟件中的偏最小二乘法（partial least squares method，PLS）分析得到各個(gè)指標(biāo)的VIP值，依據(jù)VIP值的大小判斷各個(gè)指標(biāo)對(duì)分類的重要程度，一般VIP>1的指標(biāo)認(rèn)為其對(duì)分類的貢獻(xiàn)比較大[14]。最后確定WBV，PV和HCT取權(quán)重系數(shù)為3，F(xiàn)IB取權(quán)重系數(shù)為2，APTT，PT，TT，ADP和ESR取權(quán)重系數(shù)為1，總活血效應(yīng)值即為各指標(biāo)的標(biāo)化值乘以權(quán)重系數(shù)后的加和值，綜合主成分分析法的得分圖和多指標(biāo)綜合指數(shù)法中的總活血化瘀效應(yīng)值總體評(píng)價(jià)不同制法丹參紅花藥對(duì)的活血化瘀功效。

3結(jié)果

31丹參紅花藥對(duì)不同制法對(duì)急性血瘀大鼠血液黏度的影響與正常組相比，模型組大鼠的WBV和PV均顯著升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<001）。與模型組比較，各給藥組的WBV和PV均有一定程度的降低。WBV檢測(cè)結(jié)果顯示，在不同制法的丹參紅花藥對(duì)低劑量組中，除了乙醇和水提取物低劑量組在切變率為30 s-1和200 s-1時(shí)的黏度沒(méi)有顯著性差異，以及乙醇、50%乙醇提取物的低劑量組在切變率為1，5，200 s-1的黏度沒(méi)有顯著性差異外，其他各低劑量組均有顯著性差異（P<001或P<005）；不同制法的中、高劑量組除了50%乙醇和水提取物的中劑量組在切變率為200 s-1時(shí)，以及乙醇提取物的中劑量組在切變率為30 s-1的黏度沒(méi)有顯著性差異外，其他部位的中、高劑量組的WBV差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<001或P<005）。PV中，除了丹參紅花藥對(duì)乙醇提取物的低劑量組外，其他給藥組差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P<001），結(jié)果見(jiàn)表1。

32丹參紅花藥對(duì)不同制法對(duì)急性血瘀大鼠ESR和HCT的影響與正常組比較，模型組ESR，HCT均顯著升高，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<001或P<005）。與模型組相比，各給藥組大鼠的ESR和HCT均有一定程度的降低。ESR檢測(cè)結(jié)果顯示，丹參紅花藥對(duì)除了乙醇和水提取物的低劑量組外，其他各給藥組的ESR均明顯降低（P<005或P<001）。HCT檢測(cè)結(jié)果顯示，丹參紅花藥對(duì)50%乙醇提取物中劑量組的HCT明顯降低（P<005）；各給藥高劑量組的HCT均明顯降低，且差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<005），結(jié)果見(jiàn)表2。

33丹參紅花藥對(duì)不同制法對(duì)急性血瘀大鼠凝血功能的影響與正常組比較，模型組的凝血4項(xiàng)（APTT，PT，TT，F(xiàn)IB）和ADP均有顯著性差異（P<001），其中APTT，PT和TT均明顯降低，F(xiàn)IB和ADP含量顯著升高。與模型組比較，丹參紅花藥對(duì)不同制法低、中、高劑量組中，除了50%乙醇提取物的低劑量組的FIB較模型組無(wú)明顯變化，其他各實(shí)驗(yàn)組均有顯著性差異（P<001或P<005）；ADP中，丹參紅花藥對(duì)不同制法的低、中、高劑量組ADP均有顯著性差異（P<001或P<005），結(jié)果見(jiàn)表2。

34基于PCA法的丹參紅花藥對(duì)不同制法的活血化瘀效應(yīng)評(píng)價(jià)將所有指標(biāo)的源數(shù)據(jù)導(dǎo)入MassLynx v41（Waters公司）軟件的EZ info中作主成分分析，通過(guò)降維建立包含第1個(gè)主成分t[1]與第2個(gè)主成分t[2]二維空間的PCA分類模型，見(jiàn)圖1。第1個(gè)主成分軸是原始數(shù)據(jù)矩陣方差最大方向，第2個(gè)主成分軸式方差次大方向，降維時(shí)最大限度保留有用信息，尋找能夠使不同種類樣品得到最大分離的方向?？梢钥闯觯＝M中心大約是（5，-15），模型組中心大約是（-475，-15），DSDW組中心大約是（10，-05），ASPL組中心大約是（25，-125），丹參紅花藥對(duì)乙醇、50%乙醇和水提取物低劑量組中心依次大約是（-275，-025），（-20，125），（-225，10）；中劑量中心依次大約是（-075，075），（075，075），（-025，1）；高劑量組中心依次大約是（075，05），（325，-02），（175，12）。丹參紅花藥對(duì)不同制法提取物的高劑量組的中心離空白組最近，說(shuō)明高劑量組的活血化瘀效應(yīng)較好，其中，50%乙醇提取物的高劑量組的中心離正常組最近，表示該組對(duì)急性血瘀大鼠的改善作用最好；丹參紅花藥對(duì)不同制法提取物的中劑量組介于空白組和模型組的中心，表明它們對(duì)急性血瘀大鼠的改善作用弱于高劑量組；丹參紅花藥對(duì)不同制法提取物的低劑量組的中心離模型組最近，表示它們對(duì)急性血瘀大鼠的改善作用較弱。整體而言，在實(shí)驗(yàn)的劑量范圍內(nèi)，丹參紅花藥對(duì)隨著劑量的增加，其活血化瘀療效也相應(yīng)的增強(qiáng)，呈現(xiàn)一定的量效關(guān)系。endprint

35基于多指標(biāo)綜合指數(shù)法的不同制法丹參紅花藥對(duì)的活血化瘀效應(yīng)整合將各組大鼠所有指標(biāo)的源數(shù)據(jù)導(dǎo)入MassLynx v41（Waters公司）軟件的EZ info中，采用偏最小二乘法分析得到各個(gè)指標(biāo)的VIP，見(jiàn)圖2，VIP越大，說(shuō)明在本實(shí)驗(yàn)中該指標(biāo)對(duì)分類的貢獻(xiàn)越大[11]。WBV（1 s-1），HCT，F(xiàn)IB和APTT的VIP均大于1，PV，WBV（5 s-1），TT，WBV（30 s-1），WBV（200 s-1），ESR，ADP和PT的VIP較小。采用本課題組前期的多指標(biāo)綜合指數(shù)法對(duì)各指標(biāo)進(jìn)行歸一化處理，得到各組的總活血化瘀效應(yīng)值，見(jiàn)表3，進(jìn)而得到不同制法的丹參紅花藥對(duì)的總活血效應(yīng)值，見(jiàn)圖3，大小順序依次為：DH50%A高>DHW高>DHA高>DH50%A中>DHW中>DHA中>DH50%A低>DHW低>DHA低，說(shuō)明丹參紅花藥對(duì)50%乙醇提取物的高劑量組的總活血效應(yīng)值最

好。由此表明，不同制法的丹參紅花藥對(duì)在相同劑量下，50%乙醇提取物的總活血效應(yīng)皆優(yōu)于其他組，而乙醇提取物的總活血效應(yīng)最差；提取方式相同時(shí)，丹參紅花藥對(duì)提取物在實(shí)驗(yàn)劑量范圍內(nèi)，隨著劑量的增加，各組的活血作用均有所加強(qiáng)，呈現(xiàn)一定的量效關(guān)系。

36不同制法丹參紅花藥對(duì)的活血化瘀效應(yīng)整合的聚類熱圖分析基于丹參紅花藥對(duì)不同劑量的生物活性數(shù)據(jù)，建立不同指標(biāo)的量效關(guān)系數(shù)學(xué)模型，根據(jù)這些模型，每一個(gè)生物活性數(shù)據(jù)都能轉(zhuǎn)化成劑量數(shù)據(jù)，從而形成熱圖，見(jiàn)圖4，并采用聚類的方法對(duì)不同制法、不同劑量組的活血化瘀效應(yīng)進(jìn)行相應(yīng)的統(tǒng)計(jì)分析，從而對(duì)不同制法丹參紅花藥對(duì)樣品差異性進(jìn)行了區(qū)別。丹參紅花藥對(duì)50%乙醇和水提取物的高劑量時(shí)活血化瘀效應(yīng)非常相近，對(duì)急性血瘀大鼠的改善效果接近于陽(yáng)性藥，同時(shí)50%乙醇和水提取物的低劑量組，乙醇和水提取物的中劑量組，乙醇提取物的高劑量組和50%乙醇提取物的中劑量組活血化瘀效應(yīng)相似，同一制法的丹參紅花藥對(duì)隨著劑量的增加，其活血化瘀療效也相應(yīng)的增強(qiáng)，呈現(xiàn)一定的量效關(guān)系。

37結(jié)合PCA法、聚類熱圖分析和多指標(biāo)綜合指數(shù)法綜合評(píng)價(jià)丹參紅花藥對(duì)不同制法活血效應(yīng)綜合PCA法、聚類熱圖分析和多指標(biāo)綜合指數(shù)法中的總活血化瘀效應(yīng)結(jié)果可知，丹參紅花藥對(duì)不同提取物，隨著劑量的增加，活血化瘀效應(yīng)均有所加強(qiáng)，呈現(xiàn)一定的量效關(guān)系，其中50%乙醇提取物的高劑量組的總活血化瘀效應(yīng)最好，3種分析方法所得結(jié)果相一致。這可能與50%乙醇提取時(shí)丹參紅花藥對(duì)中發(fā)揮活血化瘀功效的有效成分溶出增多有關(guān)。

4討論

中醫(yī)學(xué)認(rèn)為，凡離經(jīng)之血不能及時(shí)排出和消散，停留于體內(nèi)，或因氣虛、氣滯、寒凝、熱結(jié)、痰阻、濕濁、外傷、飲食、七情等病因所致血行不暢，停遏于經(jīng)脈之內(nèi)，及瘀積于臟腑組織器官的，均稱為瘀血[15]。寒凝與氣滯是導(dǎo)致血瘀的主要原因之一，肝氣郁結(jié)，疏泄不利，血的運(yùn)行可因之而阻塞；寒侵于經(jīng)，經(jīng)脈瑟縮而拘急，血液凝澀而失暢行，常可因之而瘀滯。已知機(jī)體處于暴怒狀態(tài)時(shí)能自主分泌大量腎上腺素，高兒茶酚胺血癥常與紅細(xì)胞黏聚性相關(guān)，故大鼠皮下給予大劑量鹽酸腎上腺素模擬“暴怒”時(shí)的機(jī)體變化，以冰水浴模擬“寒邪”入侵，兩者交替運(yùn)用促使血液迅速呈現(xiàn)“濃、黏、凝、聚”的淤血模型特征狀態(tài)[16]，并以復(fù)方丹參滴丸和阿司匹林作為活血藥物的陽(yáng)性對(duì)照，對(duì)模型進(jìn)行了有效性驗(yàn)證。

現(xiàn)代研究認(rèn)為，血瘀證最典型的變化是血液流變性的異常改變，血液流變性異常，會(huì)引起機(jī)體血液循環(huán)障礙，以血液黏度增加為首要因素，凝血功能障礙也是其一因素[17]。為了綜合反映不同制法丹參紅花藥對(duì)的活血化瘀藥效，本實(shí)驗(yàn)選擇了血液流變學(xué)（WBV和PV），凝血功能（TT，PT，APTT和FIB），HCT，ESR與ADP多個(gè)效應(yīng)指標(biāo)來(lái)綜合評(píng)價(jià)其藥效。但各指標(biāo)的評(píng)價(jià)基點(diǎn)和藥物對(duì)各指標(biāo)的反應(yīng)靈敏度往往不一致，因此為了對(duì)不同樣品的終末效應(yīng)有一個(gè)整體的、直觀的認(rèn)識(shí)，需要對(duì)這些指標(biāo)進(jìn)行標(biāo)化，并統(tǒng)一計(jì)量單位，形成整合效應(yīng)以綜合評(píng)價(jià)。

多指標(biāo)綜合指數(shù)法是將多個(gè)不同類別、不同性質(zhì)、不同計(jì)量單位的指標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)化，最后轉(zhuǎn)化成一個(gè)無(wú)量綱的相對(duì)評(píng)價(jià)值，并能反映事物相對(duì)水平和整體變動(dòng)的一種綜合評(píng)價(jià)方法[18]。PCA屬于多指標(biāo)綜合評(píng)價(jià)法中的客觀賦權(quán)法，該方法是通過(guò)恰當(dāng)?shù)臄?shù)學(xué)變換，使新變量主成分成為原變量的線性組合，并選取少數(shù)幾個(gè)在變差總信息量中比例較大的主成分來(lái)分析事物的一種方法[1920]。此外本文采用比較常用、方法成熟且易操作的專家評(píng)分法結(jié)合相關(guān)效應(yīng)指標(biāo)在文獻(xiàn)中出現(xiàn)的頻次來(lái)綜合確定權(quán)重系數(shù)，在一定程度上彌補(bǔ)了專家評(píng)分法的不足，并采用PLSDA中的VIP對(duì)血液流變學(xué)及凝血功能各指標(biāo)進(jìn)行了評(píng)分，因此本文綜合各方法對(duì)丹參紅花的各效應(yīng)指標(biāo)進(jìn)行評(píng)分，為權(quán)重系數(shù)的確定提供了客觀的理論依據(jù)[2122]。

結(jié)合多指標(biāo)綜合指數(shù)法和PCA對(duì)急性血瘀大鼠的血液流變學(xué)和凝血功能指標(biāo)進(jìn)行整合，結(jié)果顯示，丹參紅花50%乙醇提取物高劑量組與空白組的PCA聚類圖最為接近，提示50%乙醇提取的給藥組更有利于模型趨向正常。有研究表明，丹參中水溶性丹酚酸類成分為丹參治療心血管疾病的主要藥效物質(zhì)基礎(chǔ)，其中含量最高的2個(gè)成分丹酚酸A和丹酚酸B活性最強(qiáng)，具有抗氧化、抗凝、抗血栓等藥理作用；紅花對(duì)心血管系統(tǒng)保護(hù)作用主要表現(xiàn)為改變血液流變性，改善微循環(huán)，降低血液黏度等。其中，羥基紅花黃色素A是紅花黃色素中最重要的成分，是發(fā)揮心血管藥理作用的主要有效成分[67]。前期研究發(fā)現(xiàn)，同一比例的丹參紅花不同制法下，除了丹參酮類成分，丹酚酸類、醌式查耳酮類、黃酮類成分在50%甲醇制法下的相對(duì)溶出度均明顯高于相同條件下水提與甲醇提的相對(duì)溶出度[8]，說(shuō)明在水提取時(shí)有利于水溶性丹酚酸類、醌式查耳酮類和黃酮類成分的有效溶出，同時(shí)適當(dāng)增加一定比例的醇溶劑可以進(jìn)一步促使其相對(duì)溶出，這些主要活性物質(zhì)溶出度的增加可能與促使丹參紅花藥對(duì)活血化瘀協(xié)同效應(yīng)的發(fā)揮有著密切的關(guān)系。這些研究結(jié)果為闡釋和優(yōu)化丹參紅花的配伍應(yīng)用提供了科學(xué)依據(jù)，也為藥對(duì)配伍研究提供思路與方法。endprint

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[責(zé)任編輯張寧寧]endprint