• <tr id="yyy80"></tr>
  • <sup id="yyy80"></sup>
  • <tfoot id="yyy80"><noscript id="yyy80"></noscript></tfoot>
  • 99热精品在线国产_美女午夜性视频免费_国产精品国产高清国产av_av欧美777_自拍偷自拍亚洲精品老妇_亚洲熟女精品中文字幕_www日本黄色视频网_国产精品野战在线观看 ?

    高產(chǎn)橙花叔醇的酵母細(xì)胞工廠(chǎng)創(chuàng)建

    2017-08-30 20:22:41張麗麗馬曉琳王冬郁彭黃璐琦張學(xué)禮戴住波
    中國(guó)中藥雜志 2017年15期
    關(guān)鍵詞:精油

    張麗麗 馬曉琳 王冬 郁彭 黃璐琦 張學(xué)禮 戴住波

    [摘要]橙花叔醇為萜類(lèi)精油成分,具有抗菌、抗腫瘤和抗氧化等多種生物學(xué)活性。為了實(shí)現(xiàn)在釀酒酵母中異源生產(chǎn)橙花叔醇,該研究首先將獼猴桃Actinidia chinensis來(lái)源的橙花叔醇合酶(NES)基因通過(guò)密碼子優(yōu)化、人工合成后轉(zhuǎn)入底盤(pán)菌株FPP001中獲得工程菌株NES001,其橙花叔醇產(chǎn)量達(dá)到271 mg·L-1。在進(jìn)一步工作中,橙花叔醇合酶的N端通過(guò)連接肽GGGS 融合法尼烯合酶(FPS)后得到橙花叔醇產(chǎn)量顯著提高的工程菌NES002,其產(chǎn)量是NES001的5980倍,達(dá)到16207 mg·L-1。最終,通過(guò)恢復(fù)NES002中色氨酸生物合成缺陷基因TRP1得到工程菌NES003,該菌在高密度發(fā)酵體系中橙花叔醇產(chǎn)量能達(dá)到1 71153 mg·L-1。該研究為微生物發(fā)酵法生產(chǎn)橙花叔醇等倍半萜化合物提供了基礎(chǔ)。

    [關(guān)鍵詞]精油;橙花叔醇;合成生物學(xué);釀酒酵母

    Construction of cell factories for high production of nerolidol

    in Saccharomyces cerevisiae

    ZHANG Lili1,2,3, MA Xiaolin1,2,3, WANG Dong2,3, YU Peng1, HUANG Luqi4, ZHANG Xueli2,3*, DAI Zhubo2,3*

    (1 College of Biotechnology, Tianjin University of Science & Technology, Tianjin 300457, China;

    2.Tianjin Institute of Industrial Biotechnology, Chinese Academy of Sciences, Tianjin 300308, China;

    3.Key Laboratory of Systems Microbial Biotechnology, Chinese Academy of Sciences, Tianjin 300308, China;

    4 State Key Laboratory Breeding Base of Daodi Herbs, National Resource Center for Chinese Materia Medica,

    China Academy of Chinese Medical Sciences, Beijing 100700, China)

    [Abstract]Nerolidol is an important constituent of terpenoid essential oil and has excellent antitumor, antibacterial, and antioxidative properties For realizing heterogenous production of nerolidol, our research firstly integrated the codonoptimized Actinidia sinensis nerolidol synthase gene (NES) into the terpenoid chassis strain FPP001, and obtained NES001 that could produce 271 mg·L-1 nerolidol Then, the Nterminal of the NES was fused with FPS by linker peptide GGGS With this strategy, nerolidol production improved by 5980fold, reaching 16207 mg·L-1 Finally, by introduction of auxotrophic marker TRP1 in NES002, the resulting strain NES003 could produce 1 71153 mg·L-1 by high cell density fermentation method This study provides the basis for the fermentative production of nerolidol and other sesquiterpenoids

    [Key words]essential oils; nerolidol; synthetic biology; Saccharomyces cerevisiae

    橙花叔醇(nerolidol)是具有芳香性的倍半萜精油成分[1],主要存在于中藥降香,陳皮等100多種香料植物中[2]。由于橙花叔醇特殊的香味,可用于配制玫瑰型、紫丁香型等多種花香型日化香精,被廣泛應(yīng)用于化妝品和洗滌領(lǐng)域;同時(shí)橙花叔醇具有抗瘧疾[3],抗腫瘤[4],抗?jié)僛5],抗氧化[6]和抗菌[7]等多種生物活性,已被美國(guó)食品和藥物管理局批準(zhǔn)作為食品調(diào)味劑[8]。目前,橙花叔醇的傳統(tǒng)獲得方法是從植物精油中濃縮、浸取而得,由于該方法存在提取效率低、浪費(fèi)植物資源、破壞生態(tài)環(huán)境等問(wèn)題,不符合可持續(xù)發(fā)展的要求[9]。

    近年來(lái),利用合成生物學(xué)的原理,設(shè)計(jì)和改造微生物菌株來(lái)生產(chǎn)青蒿素,人參皂苷等中藥有效成分已被認(rèn)為是一種很有潛力的方法[1012]。釀酒酵母由于其遺傳背景清晰、遺傳改造技術(shù)和發(fā)酵方法成熟,已經(jīng)被廣泛應(yīng)用到構(gòu)建合成萜類(lèi)化合物的底盤(pán)菌中。在釀酒酵母中,乙酰輔酶A在MVA途徑7個(gè)酶的催化下,可生成所有萜類(lèi)化合物合成的前體物質(zhì)異戊烯焦磷酸(IPP)和二甲基烯丙基焦磷酸(DMAPP)。在倍半萜化合物生物合成途徑中,IPP和DMAPP可在法呢基焦磷酸合成酶(FPS)的作用下生成倍半萜類(lèi)化合物的合成前體法呢烯基焦磷酸(FPP),F(xiàn)PP可在不同倍半萜合成酶的催化作用下生成橙花叔醇等各種倍半萜化合物,見(jiàn)圖1。endprint

    實(shí)驗(yàn)室前期,已構(gòu)建了1株過(guò)表達(dá)MVA途徑7個(gè)基因的底盤(pán)菌株NK2SQ,其可顯著增加釀酒酵母內(nèi)萜類(lèi)化合物的合成通量[11]。在本研究中,底盤(pán)菌株NK2SQ中參與乙醇合成乙酰輔酶A的乙醇脫氫酶(ADH2)、乙醛脫氫酶(ALD6)和乙酰輔酶A合酶(ACS1)等酶基因的表達(dá)調(diào)控,獼猴桃Actinidia chinensis來(lái)源的橙花叔醇合酶(NES)基因(GenBank: JN2422431)密碼子優(yōu)化,NES與FPS酶蛋白融合,以及高密度發(fā)酵等策略進(jìn)一步用于提高細(xì)胞工廠(chǎng)合成橙花叔醇的能力。相關(guān)結(jié)果為微生物發(fā)酵法生產(chǎn)橙花叔醇等倍半萜化合物奠定了基礎(chǔ)。

    1材料

    11工具酶與試劑PrimeSTAR HS DNA聚合酶購(gòu)自于大連寶生物工程公司;酵母基因組DNA提取試劑盒購(gòu)自北京康為世紀(jì)有限公司;質(zhì)粒小量快速提取試劑盒購(gòu)自美國(guó)Axygen公司;氨芐青霉素、DNA清潔試劑盒與DNA回收試劑盒購(gòu)自生工生物工程(上海)股份有限公司;酵母選擇培養(yǎng)基購(gòu)自北京泛基諾科技有限公司;麥角固醇、鯊烯和橙花叔醇標(biāo)準(zhǔn)品購(gòu)自美國(guó)SigmaAldrich公司;其他試劑均為分析純。

    12質(zhì)粒,菌株及引物本次研究所用的質(zhì)粒,菌株及引物信息見(jiàn)表1,2。

    HMGCoA 3hydroxy3methylglutaryl coenzyme A; IPP isopentenyldiphosphate; DMAPP dimethylallyldiphosphate; FPPfarnesyl pyrophosphate; ERG10 acetoacetylCoA thiolase; ERG13 HMGCoA synthase; HMG1 HMGCoA reductase; ERG12 mevalonate kinase; ERG8 phosphomevalonate kinase; ERG19 mevalonate pyrophosphate decarboxylase; IDI1 isopentenyl diphosphate isomerase 1; ERG20 FPP synthase; ADH2alcohol dehydrogenase; ALD6 acetaldehyde dehydrogenase; ACS1 acetylCoA synthetase; NES nerolidol synthase。

    13培養(yǎng)基LB培養(yǎng)基:1% 蛋白胨,05% 酵母粉,1% 氯化鈉,100 mg·L-1氨芐青霉素;SMUra篩選培養(yǎng)基:08% 酵母選擇培養(yǎng)基(三缺,UraTrpHis),2%葡萄糖,001% Trp,0005% His;SMUraHis篩選培養(yǎng)基:08% 酵母選擇培養(yǎng)基(三缺,UraTrpHis),2% 葡萄糖,001%Trp;SMUraHisLeu篩選培養(yǎng)基:08% 酵母選擇培養(yǎng)基(四缺,UraTrpHisLeu),2% 葡萄糖,001% Trp。SMUraHisLeuTrp篩選培養(yǎng)基:08% 酵母選擇培養(yǎng)基(四缺,UraTrpHisLeu),2% 葡萄糖。上述液體培養(yǎng)基加2% 的Agar可配成相應(yīng)的固體培養(yǎng)基。

    高密度發(fā)酵培養(yǎng)基和補(bǔ)料培養(yǎng)基參照人參皂苷高密度發(fā)酵培養(yǎng)基配方配制[12]。

    2方法

    21FPP001菌株的構(gòu)建構(gòu)建FPP001工程菌株所采用的方法為多片段同源重組。首先,模板和引物的搭配方案見(jiàn)圖2和表3,用PrimeSTAR HS高保真聚合酶擴(kuò)增和割膠回收得到用于同源重組的各

    個(gè)片段。用SMUra培養(yǎng)基活化NK2SQ后將各個(gè)片段轉(zhuǎn)入醋酸鋰方法制備的感受態(tài)中,并用SMUraHis固體培養(yǎng)基篩選轉(zhuǎn)化子。轉(zhuǎn)化子再分別用SacⅡPGK1/ADH2Asc1,PacpTDH3/ACS1Asc1,SacⅡpTEF1/ALD6Asc1等 3對(duì)引物進(jìn)行PCR驗(yàn)證和測(cè)序驗(yàn)證后,得到工程菌FPP001。

    22NES系列菌株的構(gòu)建用醋酸鋰的方法制備FPP001感受態(tài)細(xì)胞,將質(zhì)粒pRS313NES轉(zhuǎn)入FPP001感受態(tài)細(xì)胞,并用SMUraHisLeu固體培養(yǎng)基篩選轉(zhuǎn)化子。轉(zhuǎn)化子再用SacIIpTEF1/NESAsc1引物進(jìn)行PCR驗(yàn)證和測(cè)序驗(yàn)證后,得到工程菌NES001。

    用醋酸鋰的方法制備FPP001感受態(tài)細(xì)胞,將質(zhì)粒PRS313FPSGGGSNES轉(zhuǎn)入FPP001感受態(tài)細(xì)胞,并用SMUraHisLeu固體培養(yǎng)基篩選轉(zhuǎn)化子。轉(zhuǎn)化子再用SacIIpTEF1/NESAsc1引物進(jìn)行PCR驗(yàn)證和測(cè)序,得到工程菌NES002。

    以ZDTRP1intergup/ZDTRP1intergdown為引物,BY4742基因組為模板,使用 PrimeSTAR HS高保真聚合酶擴(kuò)增和割膠回收得到用于同源重組的片段TRP1。用醋酸鋰的方法制備N(xiāo)ES002感受態(tài)細(xì)胞,將片段TRP1轉(zhuǎn)入NES002感受態(tài)細(xì)胞,并用SMUraHisLeuTrp固體培養(yǎng)基篩選轉(zhuǎn)化子。直接將轉(zhuǎn)化子進(jìn)行測(cè)序,得到工程菌NES003。

    23發(fā)酵及產(chǎn)物提取搖瓶發(fā)酵:挑取平板上的單克隆于相應(yīng)液體培養(yǎng)基中,30 ℃,250 r·min-1過(guò)夜制備種子液。將種子液接種以1%的接種量接種于含15 mL相應(yīng)液體選擇培養(yǎng)基的100 mL三角瓶中,30 ℃,250 r·min-1振蕩培養(yǎng)1 d,然后加入15 mL正十二烷,繼續(xù)震蕩培養(yǎng)6 d。最后,將三角瓶中液體轉(zhuǎn)移至50 mL離心管,5 000 r·min-1離心5 min,收集有機(jī)相,用正己烷稀釋10倍,過(guò)有機(jī)尼龍膜(022 μm)后備用。

    高密度發(fā)酵:經(jīng)火焰接種環(huán),將300 mL種子液加入含3 L發(fā)酵培養(yǎng)基的7 L發(fā)酵罐中。發(fā)酵過(guò)程中參數(shù)設(shè)定值分別為:溫度30 ℃,pH 50,溶氧30%,空氣流量3~20 L·min-1,攪拌轉(zhuǎn)速300~1 000 r·min-1,溶氧與攪拌轉(zhuǎn)速、通氣相偶聯(lián)。補(bǔ)料策略為:溶氧值大于60%時(shí),向發(fā)酵罐中加入補(bǔ)料培養(yǎng)基至發(fā)酵液中葡萄糖濃度為10 g·L-1。尾氣管通入含有300 mL正十二烷的吸收瓶,發(fā)酵112 h后向發(fā)酵罐中加入200 mL正十二烷,500 r·min-1攪拌1 h,收集有機(jī)相,用正己烷稀釋100倍,過(guò)有機(jī)尼龍膜(022 μm)后備用。endprint

    24橙花叔醇、麥角固醇及鯊烯的檢測(cè)正己烷配制橙花叔醇,麥角固醇和鯊烯對(duì)照品溶液,使用GCMS進(jìn)行樣品的定性和定量分析[12]。橙花叔醇GCMS測(cè)定條件:進(jìn)樣口溫度250 ℃,進(jìn)樣體積1 μL,不分流,溶劑延時(shí)3 min;色譜柱:HP5ms (025 mm×30 m);色譜條件:45 ℃,1 min,10 ℃·min-1到300 ℃保溫5 min;MS條件:Full Scan: 50~750 amu。麥角固醇和鯊烯GCMS測(cè)定條件:進(jìn)樣口溫度300 ℃,進(jìn)樣體積1 μL,不分流,溶劑延時(shí)12 min;色譜柱:HP5 ms(025 mm×30 m);色譜條件:80 ℃,1 min;20 ℃·min-1到300 ℃保溫18 min;MS條件:SIM69,109,135,363,411。

    3結(jié)果與分析

    31橙花叔醇釀酒酵母細(xì)胞工廠(chǎng)創(chuàng)建及產(chǎn)物鑒定橙花叔醇合成酶基因(NES)能以釀酒酵母中生成的FPP為底物合成目標(biāo)產(chǎn)物橙花叔醇,見(jiàn)圖1。實(shí)驗(yàn)室前期,已構(gòu)建了1株過(guò)表達(dá)MVA途徑7個(gè)基因的底盤(pán)菌株NK2SQ,其可顯著增加釀酒酵母內(nèi)萜類(lèi)化合物的合成通量[11]。為了進(jìn)一步強(qiáng)化底盤(pán)菌的性能,底盤(pán)菌株NK2SQ中參與乙醇合成乙酰輔酶A的乙醇脫氫酶(ADH2)、乙醛脫氫酶(ALD6)和乙酰輔酶A合酶(ACS1)等3個(gè)酶基因被過(guò)表達(dá):PCR克隆得到的ADH2,ACS1,ALD6基因分別與相應(yīng)的強(qiáng)啟動(dòng)子PGK1,TDH3,TEF1和終止子連接后,利用同源重組一次整合到NK2SQ基因組的NDT80位點(diǎn),見(jiàn)圖2。轉(zhuǎn)化子經(jīng)過(guò)缺陷培養(yǎng)基的篩選、PCR和測(cè)序驗(yàn)證后得到倍半萜類(lèi)化合物底盤(pán)菌FPP001,PCR驗(yàn)證結(jié)果見(jiàn)圖3A。

    AFPP001 PCR驗(yàn)證圖;BNES001 PCR驗(yàn)證圖;CNES002 PCR驗(yàn)證圖;MTrans 2K plus marker;A圖中泳道1~3分別是3個(gè)基因及相應(yīng)的啟動(dòng)子的PCR驗(yàn)證圖,泳道4~6為對(duì)照菌PCR驗(yàn)證圖; B圖中泳道1~2分別是NES001和對(duì)照菌PCR驗(yàn)證圖;C圖中泳道1~2分別是NES002和對(duì)照菌PCR驗(yàn)證圖。

    在此基礎(chǔ)上,將人工合成的NES基因置于強(qiáng)啟動(dòng)子TEF1下獲得質(zhì)粒pRS313NES,再將pRS313NES轉(zhuǎn)入到釀酒酵母底盤(pán)菌FPP001中,轉(zhuǎn)化子經(jīng)缺陷培養(yǎng)基的篩選,PCR與測(cè)序驗(yàn)證后得到工程菌NES001,見(jiàn)圖3B。底盤(pán)菌FPP001和工程菌NES001在缺陷培養(yǎng)基中發(fā)酵6 d后,利用GCMS對(duì)發(fā)酵產(chǎn)物進(jìn)行定性和定量分析,發(fā)現(xiàn)工程菌株NES001能在1460 min出現(xiàn)與反式橙花叔醇對(duì)照品相同質(zhì)譜圖的新峰見(jiàn)圖4,其產(chǎn)量為271 mg·L-1,見(jiàn)圖5。

    A Nerolidol 代表橙花叔醇對(duì)照品,F(xiàn)PP001代表工程菌FPP001發(fā)酵產(chǎn)物,NES001代表工程菌NES001發(fā)酵產(chǎn)物; B反式橙花叔醇標(biāo)準(zhǔn)品質(zhì)譜圖; C工程菌NES001發(fā)酵產(chǎn)物中橙花叔醇質(zhì)譜圖。

    32蛋白質(zhì)融合方法優(yōu)化橙花叔醇釀酒酵母細(xì)胞工廠(chǎng)生物合成途徑上各個(gè)酶的空間靠近對(duì)中間產(chǎn)物的流向有著非常重要的影響。拉近合成途徑中的2個(gè)(或多個(gè))功能相關(guān)的酶的空間距離,從而在空間上更有利于2個(gè)催化反應(yīng)的進(jìn)行,能有效提高產(chǎn)物的產(chǎn)量。因此,利用連接肽將功能相關(guān)的酶進(jìn)行融合,已經(jīng)成為蛋白質(zhì)工程優(yōu)化重要策略[13]。在橙花叔醇的生物合成途徑中,法呢基焦磷酸合成酶(FPS)能催化IPP和DMAPP合成NES酶的底物法呢基焦磷酸(FPP)。為進(jìn)一步提高橙花叔醇的產(chǎn)量,利用連接肽GGGS將FPS融合到NES酶的N端,轉(zhuǎn)入底盤(pán)菌FPP001得到橙花叔醇產(chǎn)量顯著提高的工程菌NES002,其產(chǎn)量是初始菌株NES001的5980倍,達(dá)到16207 mg·L-1。

    工程菌營(yíng)養(yǎng)缺陷基因的恢復(fù)能提高菌株的發(fā)酵性能。在NES002菌株的基礎(chǔ)上,恢復(fù)了其缺陷基因TRP1,轉(zhuǎn)化子經(jīng)缺陷培養(yǎng)基篩選和測(cè)序驗(yàn)證后得到工程菌NES003。 NES003在缺陷培養(yǎng)基中發(fā)酵6 d后,其橙花叔醇產(chǎn)量達(dá)到19560 mg·L-1,見(jiàn)圖5。較菌株NES002產(chǎn)量提高了2069%。

    33NES003高密度發(fā)酵進(jìn)一步提高橙花叔醇產(chǎn)量酵母菌的高密度發(fā)酵既可提高產(chǎn)物的生產(chǎn)率,又能充分利用生物反應(yīng)器的容積和降低分離成本[12,1415]。本研究中,利用實(shí)驗(yàn)室前期建立的萜類(lèi)發(fā)酵工藝對(duì)高產(chǎn)菌NES003進(jìn)行高密度發(fā)酵。工程菌NES003發(fā)酵72 h后,細(xì)胞生長(zhǎng)進(jìn)入平臺(tái)期,112 h時(shí)菌的生長(zhǎng)A600能達(dá)到22517,此時(shí)橙花叔醇的產(chǎn)量達(dá)1 71154 mg·L-1,與搖瓶發(fā)酵相比,提高了775倍,見(jiàn)圖6。其中,發(fā)酵尾氣中橙花叔醇的含量約占總量的210%,發(fā)酵罐和尾氣瓶中分別為1 67633,3521 mg·L-1,發(fā)酵產(chǎn)物存在一定揮發(fā)性。另外鯊烯和麥角固醇等競(jìng)爭(zhēng)性分支途徑的代謝物分別為9410,31564 mg·L-1。

    4討論

    近年來(lái),蛋白質(zhì)融合技術(shù)已經(jīng)發(fā)展成為一種有效提高目標(biāo)化合物產(chǎn)量的手段,例如:ZHOU等把SmCPS,SmKSL進(jìn)行融合,以及BTS1(GGPP合酶),ERG20(FPP合成酶)的融合等方法應(yīng)用于次丹參酮二烯工程菌的構(gòu)建,釀酒酵母工程菌次丹參酮二烯的產(chǎn)量達(dá)到了365 mg·L-1[16]。ZHAO等通過(guò)構(gòu)建Erg20p(F96WN127W)tVoGES融合酶,并對(duì)中間連接肽和酶順序進(jìn)行優(yōu)化,運(yùn)用其他代謝手段,釀酒

    酵母工程菌香葉醇產(chǎn)量達(dá)到662 mg·L-1,產(chǎn)量比原來(lái)報(bào)道的最高香葉醇產(chǎn)量高出了7倍多[17]。本研究將功能相關(guān)的NES和FPS進(jìn)行融合,將橙花叔醇的產(chǎn)量提高了5980倍,為利用融合蛋白技術(shù)提高目標(biāo)化合物產(chǎn)量提供了強(qiáng)有力的支持。

    在發(fā)酵過(guò)程中,TRP1營(yíng)養(yǎng)缺陷型篩選標(biāo)記的缺失會(huì)對(duì)釀酒酵母的生長(zhǎng)表型產(chǎn)生影響,例如使用TRP1功能缺陷的NES002進(jìn)行高密度發(fā)酵時(shí),雖然我們?cè)谂囵B(yǎng)基中添加了適量的色氨酸作為補(bǔ)充,但其細(xì)胞生物量指標(biāo)A600未超過(guò)3000,然而當(dāng)利用NES003進(jìn)行發(fā)酵時(shí)其菌株A600顯著提高超過(guò)7倍,可以達(dá)到22517。另外,工程菌株中競(jìng)爭(zhēng)性分支途徑的代謝物鯊烯的含量一直維持在很低水平,提示代謝流主要流向橙花叔醇合成方向,下一步改造將圍繞提高萜類(lèi)化合物整體代謝流展開(kāi)。endprint

    橙花叔醇是具有怡人香味的萜類(lèi)精油化合物,在化妝品和食品領(lǐng)域有廣泛應(yīng)用,目前全球需求范圍在10~100 t[18]。利用合成生物學(xué)原理,創(chuàng)建人工酵母細(xì)胞生產(chǎn)橙花叔醇可為橙花叔醇的制備提供新的來(lái)源。本研究通過(guò)底盤(pán)菌株優(yōu)化,外源橙花叔醇合酶的轉(zhuǎn)入,蛋白質(zhì)融合以及高密度發(fā)酵等策略,最終獲得可生產(chǎn)1 71153 mg·L-1橙花叔醇的酵母細(xì)胞工廠(chǎng)NES003。本研究為微生物發(fā)酵法生產(chǎn)橙花叔醇等倍半萜化合物提供了基礎(chǔ)。

    [參考文獻(xiàn)]

    [1]Neves R C,Camara C A.Chemical composition and acaricidal activity of the essential oils from Vitex agnuscastus L (Verbenaceae) and selected monoterpenes[J].An Acad Bras Cienc,2016,88,(3):1221.

    [2]程必強(qiáng),馬信祥,許勇,等.橙花叔醇植物資源及利用的研究[J].林產(chǎn)化學(xué)與工業(yè),1996(2):22.

    [3]Saito A Y, Rodriguez A A M, Vega D S M, et al.Antimalarial activity of the terpene nerolidol[J].Int J Antimicrob Agents,2016,48(6):641.

    [4]Triana J, Eiroa J L, Morales M, et al.A chemotaxonomic study of endemic species of genus Tanacetum from the Canary Islands[J].Phytochemistry,2013,92:87.

    [5]Klopell F C, Lemos M, Sousa J P, et al.Nerolidol, an antiulcer constituent from the essential oil of Baccharis dracunculifolia DC (Asteraceae)[J].Z Naturforsch C,2007,62(7/8):537.

    [6]Ferreira F M, Palmeira C M, Oliveira M M, et al. Nerolidol effects on mitochondrial and cellular energetics[J].Toxicol Vitro,2012,26(2):189.

    [7]Braca A, Siciliano T, D′arrigo M, et al.Chemical composition and antimicrobial activity of Momordica charantia seed essential oil[J].Fitoterapia,2008,79(2):123.

    [8]Chan W K, Tan L T, Chan K G, et al. Nerolidol: a sesquiterpene alcohol with multifaceted pharmacological and biological activities[J].Molecules,2016,21(5):40.

    [9]Galili G, Galili S, Lewinsohn E, et al.Genetic, molecular, and genomic approaches to improve the value of plant foods and feeds[J].Crit Rev Plant Sci,2002,21(3):167.

    [10]Paddon C J, Westfall P J, Pitera D J, et al. Highlevel semisynthetic production of the potent antimalarial artemisinin[J].Nature,2013,496(7446):528.

    [11]林庭庭, 王冬, 戴住波,等.創(chuàng)建釀酒酵母細(xì)胞工廠(chǎng)發(fā)酵生產(chǎn)羽扇豆醇[J].中國(guó)中藥雜志,2016,41(6):1008.

    [12]Dai Z B, Liu Y, Zhang X A, et al. Metabolic engineering of Saccharomyces cerevisiae for production of ginsenosides[J].Metab Eng,2013,20:146.

    [13]Zhao F L, Bai P, Liu T, et al. Optimization of a cytochrome p450 oxidation system for enhancing protopanaxadiol production in Saccharomyces cerevisiae[J].Biotechnol Bioeng,2016,113(8):1787.

    [14]尹淑琴, 范艷, 常泓.基因工程菌的高密度發(fā)酵研究[J].安徽農(nóng)業(yè)科學(xué),2007(11):3175.

    [15]Brennan T C, Turner C D, Kromer J O, et al. Alleviating monoterpene toxicity using a twophase extractive fermentation for the bioproduction of jet fuel mixtures in Saccharomyces cerevisiae[J].Biotechnol Bioeng,2012,109(10):2513.

    [16]Zhou Y J, Gao W, Rong Q X, et al. Modular pathway engineering of diterpenoid synthases and the mevalonic acid pathway for miltiradiene production[J].J Am Chem Soc,2012,134(6):3234.

    [17]Zhao J Z, Bao X M, Li C, et al. Improving monoterpene geraniol production through geranyl diphosphate synthesis regulation in Saccharomyces cerevisiae[J].Appl Microbiol Biotechnol,2016,100(10):4561.

    [18]Mcginty D,Letizia C S,Api A M.Addendum to frangrance material review on nerolidol(isomer unspecified)[J].Food Chem Toxcol,2010,48(3):S43.

    [責(zé)任編輯呂冬梅]endprint

    猜你喜歡
    精油
    幾種飼用植物精油添加劑抑菌效果的比較
    湖南飼料(2022年6期)2022-12-20 07:10:08
    板栗花精油提取研究
    酸橙精油GC-MS分析及其生物活性
    中成藥(2019年12期)2020-01-04 02:03:08
    為自己調(diào)香,造一座精油芳香花園
    長(zhǎng)白山一“絕”——芭芙拉紅松子精油
    長(zhǎng)白山一“絕”——芭芙拉紅松子精油
    云南高原芳香植物精油在化妝品中的應(yīng)用
    植物精油的生理功能及其在飼料中的應(yīng)用
    廣東飼料(2016年4期)2016-12-01 03:43:17
    精油:抗細(xì)菌耐藥性的新視野
    復(fù)配精油對(duì)采后葡萄灰霉菌抑制作用的研究
    婷婷色综合www| 18禁国产床啪视频网站| 亚洲欧美精品自产自拍| 亚洲国产av影院在线观看| 欧美大码av| 2021少妇久久久久久久久久久| 午夜视频精品福利| 久久久久精品人妻al黑| 麻豆国产av国片精品| 成年女人毛片免费观看观看9 | 老汉色∧v一级毛片| 男人添女人高潮全过程视频| 国产成人精品久久二区二区91| 少妇人妻久久综合中文| 免费在线观看日本一区| 丝袜在线中文字幕| 国产一区二区激情短视频 | 人人澡人人妻人| 亚洲欧美中文字幕日韩二区| 国产精品麻豆人妻色哟哟久久| 国产免费现黄频在线看| 亚洲国产av影院在线观看| 国产免费视频播放在线视频| 亚洲精品国产av蜜桃| 欧美黑人欧美精品刺激| 69精品国产乱码久久久| 丁香六月欧美| 亚洲国产精品国产精品| 精品国产一区二区三区久久久樱花| 美女主播在线视频| 国产成人a∨麻豆精品| 老汉色∧v一级毛片| 欧美黑人欧美精品刺激| 18禁黄网站禁片午夜丰满| 校园人妻丝袜中文字幕| 纯流量卡能插随身wifi吗| 深夜精品福利| 女警被强在线播放| 日日夜夜操网爽| 每晚都被弄得嗷嗷叫到高潮| 女性生殖器流出的白浆| 极品人妻少妇av视频| 免费在线观看日本一区| 亚洲 国产 在线| 成年人免费黄色播放视频| 中文欧美无线码| 亚洲欧洲精品一区二区精品久久久| 手机成人av网站| 搡老岳熟女国产| 欧美激情极品国产一区二区三区| 极品人妻少妇av视频| 大片免费播放器 马上看| 久久久久久久国产电影| 老司机影院毛片| 少妇人妻 视频| 免费在线观看日本一区| 亚洲图色成人| 性色av乱码一区二区三区2| 爱豆传媒免费全集在线观看| 日韩免费高清中文字幕av| 91成人精品电影| 亚洲人成77777在线视频| 国产熟女午夜一区二区三区| 国产成人a∨麻豆精品| 国产精品久久久久久精品古装| 少妇粗大呻吟视频| 男女无遮挡免费网站观看| 美女视频免费永久观看网站| 亚洲情色 制服丝袜| 午夜激情久久久久久久| 女人精品久久久久毛片| 婷婷丁香在线五月| 国产片内射在线| xxxhd国产人妻xxx| 亚洲成人手机| a 毛片基地| 晚上一个人看的免费电影| 日韩 欧美 亚洲 中文字幕| 国产伦理片在线播放av一区| 久久国产精品大桥未久av| 亚洲av国产av综合av卡| 精品国产乱码久久久久久小说| 中文字幕色久视频| 久久久久久久久免费视频了| 国产精品久久久久成人av| 国产黄色视频一区二区在线观看| 丝瓜视频免费看黄片| 赤兔流量卡办理| 天天添夜夜摸| av福利片在线| 国产日韩一区二区三区精品不卡| 99国产精品一区二区三区| 飞空精品影院首页| 久久亚洲精品不卡| 大话2 男鬼变身卡| 欧美另类一区| 老司机靠b影院| www.av在线官网国产| 亚洲一卡2卡3卡4卡5卡精品中文| 国产免费一区二区三区四区乱码| 国产亚洲av片在线观看秒播厂| 你懂的网址亚洲精品在线观看| 极品人妻少妇av视频| 又黄又粗又硬又大视频| 另类亚洲欧美激情| 国产一区二区三区av在线| 久久久久久久久免费视频了| 欧美成人精品欧美一级黄| www.999成人在线观看| 亚洲人成电影免费在线| 女性被躁到高潮视频| 午夜福利乱码中文字幕| 成年人黄色毛片网站| 精品少妇久久久久久888优播| 丝袜在线中文字幕| 黄频高清免费视频| 中国国产av一级| 亚洲国产成人一精品久久久| 亚洲七黄色美女视频| 国产激情久久老熟女| 亚洲欧美一区二区三区国产| 亚洲久久久国产精品| 精品国产乱码久久久久久小说| av国产久精品久网站免费入址| 亚洲成人免费av在线播放| 日本a在线网址| 色综合欧美亚洲国产小说| 精品福利观看| 亚洲精品美女久久久久99蜜臀 | 黄网站色视频无遮挡免费观看| 男女床上黄色一级片免费看| 桃花免费在线播放| 又紧又爽又黄一区二区| 国产精品二区激情视频| 日本vs欧美在线观看视频| 亚洲精品国产av成人精品| 国产主播在线观看一区二区 | 丝瓜视频免费看黄片| 成年美女黄网站色视频大全免费| 18禁裸乳无遮挡动漫免费视频| 黄色视频在线播放观看不卡| 在线精品无人区一区二区三| 国产一区二区三区av在线| 99久久综合免费| 精品人妻1区二区| cao死你这个sao货| 亚洲av电影在线观看一区二区三区| 飞空精品影院首页| 纵有疾风起免费观看全集完整版| 高潮久久久久久久久久久不卡| 午夜精品国产一区二区电影| 满18在线观看网站| 日日摸夜夜添夜夜爱| 欧美精品高潮呻吟av久久| av网站免费在线观看视频| 久久午夜综合久久蜜桃| 男女午夜视频在线观看| 视频在线观看一区二区三区| 99久久综合免费| 美女中出高潮动态图| 国产精品国产三级专区第一集| 国产99久久九九免费精品| 精品亚洲乱码少妇综合久久| 天天操日日干夜夜撸| 黑人猛操日本美女一级片| 欧美成人精品欧美一级黄| 久久中文字幕一级| 久久久久久久精品精品| 精品一品国产午夜福利视频| 18禁黄网站禁片午夜丰满| 五月天丁香电影| a级片在线免费高清观看视频| 91国产中文字幕| 免费av中文字幕在线| 伊人亚洲综合成人网| 亚洲一码二码三码区别大吗| 午夜av观看不卡| 国产成人啪精品午夜网站| 中文字幕av电影在线播放| 麻豆乱淫一区二区| 亚洲国产毛片av蜜桃av| 女性生殖器流出的白浆| 99精品久久久久人妻精品| 日本av手机在线免费观看| 久久精品亚洲熟妇少妇任你| 国产成人av激情在线播放| 亚洲自偷自拍图片 自拍| 99久久人妻综合| 国产三级黄色录像| 99香蕉大伊视频| 亚洲 欧美一区二区三区| 夜夜骑夜夜射夜夜干| 男女午夜视频在线观看| 精品少妇黑人巨大在线播放| 青草久久国产| 成人国产av品久久久| 国产亚洲欧美在线一区二区| 51午夜福利影视在线观看| 国产麻豆69| 久久精品久久精品一区二区三区| 女人爽到高潮嗷嗷叫在线视频| 十八禁高潮呻吟视频| 欧美人与善性xxx| 日本一区二区免费在线视频| 一级毛片女人18水好多 | 久久人妻熟女aⅴ| 最黄视频免费看| 免费av中文字幕在线| 无限看片的www在线观看| 欧美亚洲日本最大视频资源| 日韩电影二区| 免费在线观看影片大全网站 | 人人妻人人添人人爽欧美一区卜| 成年女人毛片免费观看观看9 | 在线天堂中文资源库| 黄网站色视频无遮挡免费观看| 欧美黑人欧美精品刺激| 一区二区av电影网| 久久影院123| 亚洲欧美激情在线| 亚洲国产精品999| 久久性视频一级片| 青青草视频在线视频观看| 午夜视频精品福利| 国产熟女欧美一区二区| 色视频在线一区二区三区| 97在线人人人人妻| 纵有疾风起免费观看全集完整版| 国产1区2区3区精品| 搡老岳熟女国产| 人成视频在线观看免费观看| 国产成人a∨麻豆精品| 在线观看人妻少妇| 精品熟女少妇八av免费久了| 午夜日韩欧美国产| 一本综合久久免费| 色婷婷av一区二区三区视频| 曰老女人黄片| 性少妇av在线| 欧美在线一区亚洲| 久久精品国产亚洲av涩爱| 精品人妻1区二区| 日韩中文字幕欧美一区二区 | 午夜福利在线免费观看网站| 一级毛片我不卡| 亚洲精品国产色婷婷电影| 精品国产一区二区久久| 欧美精品一区二区大全| 我的亚洲天堂| 国产精品久久久av美女十八| 精品熟女少妇八av免费久了| 亚洲成人免费电影在线观看 | 色婷婷久久久亚洲欧美| 日韩熟女老妇一区二区性免费视频| 啦啦啦在线观看免费高清www| 亚洲精品在线美女| av网站免费在线观看视频| 亚洲精品久久午夜乱码| 两个人免费观看高清视频| 午夜老司机福利片| 热re99久久精品国产66热6| 精品国产乱码久久久久久男人| 中国国产av一级| 国产有黄有色有爽视频| 各种免费的搞黄视频| 激情视频va一区二区三区| 中文字幕另类日韩欧美亚洲嫩草| 午夜福利视频精品| 尾随美女入室| 久久久精品94久久精品| 十八禁高潮呻吟视频| 中国美女看黄片| 男男h啪啪无遮挡| 国产在线观看jvid| 久久这里只有精品19| 欧美久久黑人一区二区| 日韩精品免费视频一区二区三区| 国产成人91sexporn| 老司机亚洲免费影院| 欧美日本中文国产一区发布| 中国国产av一级| 国产日韩欧美在线精品| 精品一区二区三区四区五区乱码 | 人人妻人人澡人人爽人人夜夜| 免费av中文字幕在线| 国产在线一区二区三区精| 久久性视频一级片| 一级黄片播放器| 99国产综合亚洲精品| 久久综合国产亚洲精品| 午夜免费男女啪啪视频观看| 欧美日韩亚洲国产一区二区在线观看 | 久久亚洲国产成人精品v| 午夜福利在线免费观看网站| 最近最新中文字幕大全免费视频 | 老司机在亚洲福利影院| 亚洲专区国产一区二区| 999久久久国产精品视频| 超碰成人久久| 午夜福利影视在线免费观看| 中文精品一卡2卡3卡4更新| 一区在线观看完整版| 黄片小视频在线播放| 国产97色在线日韩免费| 免费在线观看完整版高清| avwww免费| 新久久久久国产一级毛片| 国产av一区二区精品久久| 久久久国产精品麻豆| 久9热在线精品视频| 国产片特级美女逼逼视频| 老司机影院毛片| 久久久久久久久免费视频了| 久久狼人影院| e午夜精品久久久久久久| 亚洲国产成人一精品久久久| 如日韩欧美国产精品一区二区三区| 国产片特级美女逼逼视频| 黑丝袜美女国产一区| 色视频在线一区二区三区| 赤兔流量卡办理| 久久久久国产一级毛片高清牌| 中文字幕制服av| 亚洲精品久久久久久婷婷小说| av不卡在线播放| 少妇粗大呻吟视频| 老司机亚洲免费影院| 亚洲美女黄色视频免费看| 亚洲精品久久久久久婷婷小说| 欧美日韩成人在线一区二区| 久久天堂一区二区三区四区| 波多野结衣av一区二区av| 亚洲欧美精品综合一区二区三区| 午夜久久久在线观看| 七月丁香在线播放| 91国产中文字幕| 一本—道久久a久久精品蜜桃钙片| 一级毛片女人18水好多 | 啦啦啦在线观看免费高清www| 嫩草影视91久久| 亚洲av国产av综合av卡| 九色亚洲精品在线播放| 纵有疾风起免费观看全集完整版| 女性被躁到高潮视频| 久久女婷五月综合色啪小说| 久久 成人 亚洲| 免费在线观看完整版高清| 久久久精品94久久精品| 精品一品国产午夜福利视频| 亚洲av男天堂| 日本91视频免费播放| 99热国产这里只有精品6| 精品国产超薄肉色丝袜足j| 一级,二级,三级黄色视频| 色婷婷久久久亚洲欧美| 亚洲av欧美aⅴ国产| 男人爽女人下面视频在线观看| 精品国产乱码久久久久久男人| 丰满少妇做爰视频| 国产一卡二卡三卡精品| 国产国语露脸激情在线看| 一本大道久久a久久精品| 亚洲一区中文字幕在线| 青春草亚洲视频在线观看| 亚洲国产精品一区三区| 亚洲av日韩在线播放| 男女国产视频网站| 丝袜脚勾引网站| 老熟女久久久| 国产伦理片在线播放av一区| 夫妻性生交免费视频一级片| av有码第一页| 欧美成狂野欧美在线观看| 久久午夜综合久久蜜桃| 欧美黄色片欧美黄色片| 黄片播放在线免费| 99国产精品免费福利视频| 青青草视频在线视频观看| 人人妻人人爽人人添夜夜欢视频| 黄色a级毛片大全视频| 亚洲,欧美精品.| 国产男人的电影天堂91| 精品人妻在线不人妻| 欧美国产精品一级二级三级| 热99久久久久精品小说推荐| 国产成人av激情在线播放| 欧美黄色片欧美黄色片| 日日夜夜操网爽| 久久毛片免费看一区二区三区| 一区二区av电影网| 国产精品三级大全| svipshipincom国产片| 少妇 在线观看| 欧美日韩亚洲综合一区二区三区_| 久久热在线av| 日韩 欧美 亚洲 中文字幕| 精品一区二区三区四区五区乱码 | 日本欧美视频一区| 最黄视频免费看| 亚洲欧美精品综合一区二区三区| 丝袜美腿诱惑在线| 免费在线观看日本一区| 一区二区日韩欧美中文字幕| 菩萨蛮人人尽说江南好唐韦庄| 日韩中文字幕欧美一区二区 | 女性被躁到高潮视频| 亚洲男人天堂网一区| 亚洲激情五月婷婷啪啪| www.精华液| 久久久精品区二区三区| 一级,二级,三级黄色视频| 国产老妇伦熟女老妇高清| 精品国产一区二区三区久久久樱花| 亚洲,一卡二卡三卡| 人妻 亚洲 视频| 一区二区av电影网| 少妇 在线观看| 国产精品二区激情视频| 母亲3免费完整高清在线观看| 一级毛片电影观看| 亚洲av在线观看美女高潮| 嫁个100分男人电影在线观看 | 久久亚洲精品不卡| 亚洲国产精品一区二区三区在线| 少妇人妻 视频| 亚洲一区中文字幕在线| 久久狼人影院| 纵有疾风起免费观看全集完整版| 午夜日韩欧美国产| 香蕉丝袜av| 一边摸一边抽搐一进一出视频| 天天操日日干夜夜撸| 黄色视频在线播放观看不卡| 国产成人精品久久久久久| 国产片特级美女逼逼视频| 视频在线观看一区二区三区| 欧美中文综合在线视频| 2018国产大陆天天弄谢| 午夜免费观看性视频| www.熟女人妻精品国产| 亚洲,欧美,日韩| 亚洲精品久久午夜乱码| 99精国产麻豆久久婷婷| 色婷婷久久久亚洲欧美| 嫁个100分男人电影在线观看 | 香蕉国产在线看| 欧美日韩亚洲高清精品| 性少妇av在线| 欧美黑人精品巨大| 亚洲欧美日韩高清在线视频 | 1024香蕉在线观看| 校园人妻丝袜中文字幕| 国产淫语在线视频| 欧美精品人与动牲交sv欧美| a级毛片在线看网站| 欧美精品av麻豆av| 丝瓜视频免费看黄片| 久久久久久久久久久久大奶| 丰满少妇做爰视频| 国产免费现黄频在线看| 久久久精品94久久精品| 亚洲av成人不卡在线观看播放网 | 成人亚洲精品一区在线观看| 久久午夜综合久久蜜桃| 国产av一区二区精品久久| 午夜激情久久久久久久| 亚洲图色成人| 成年女人毛片免费观看观看9 | 中文精品一卡2卡3卡4更新| 少妇被粗大的猛进出69影院| 啦啦啦在线免费观看视频4| 老司机影院毛片| 曰老女人黄片| 亚洲天堂av无毛| 午夜免费成人在线视频| 欧美日韩亚洲国产一区二区在线观看 | 大话2 男鬼变身卡| 性色av一级| 女警被强在线播放| 欧美97在线视频| 两个人看的免费小视频| 99精国产麻豆久久婷婷| 久久国产精品影院| av福利片在线| 精品一区二区三卡| 日本av手机在线免费观看| 波野结衣二区三区在线| 日韩 亚洲 欧美在线| 欧美人与性动交α欧美精品济南到| 亚洲精品国产av蜜桃| 操美女的视频在线观看| 精品一区二区三卡| 久久综合国产亚洲精品| 欧美日韩亚洲综合一区二区三区_| 亚洲精品一卡2卡三卡4卡5卡 | 久久99一区二区三区| 无限看片的www在线观看| 波野结衣二区三区在线| 成人影院久久| 日日爽夜夜爽网站| 午夜免费男女啪啪视频观看| 久久久国产一区二区| 午夜影院在线不卡| 中文字幕人妻丝袜制服| 亚洲一卡2卡3卡4卡5卡精品中文| 国产精品久久久久久精品电影小说| 看免费成人av毛片| 天堂8中文在线网| a级片在线免费高清观看视频| 日本猛色少妇xxxxx猛交久久| 国产精品麻豆人妻色哟哟久久| 99久久精品国产亚洲精品| 好男人电影高清在线观看| 国产一区二区三区av在线| 建设人人有责人人尽责人人享有的| 只有这里有精品99| 午夜两性在线视频| 又大又爽又粗| 伊人久久大香线蕉亚洲五| 精品欧美一区二区三区在线| 1024香蕉在线观看| 精品卡一卡二卡四卡免费| 国产女主播在线喷水免费视频网站| 天堂俺去俺来也www色官网| 亚洲av男天堂| 国产伦理片在线播放av一区| 日韩免费高清中文字幕av| 超色免费av| 丝瓜视频免费看黄片| 国产精品 欧美亚洲| 女性生殖器流出的白浆| 水蜜桃什么品种好| 日本wwww免费看| 精品视频人人做人人爽| 国产成人av激情在线播放| 免费观看av网站的网址| 国产精品久久久久久精品古装| 狂野欧美激情性xxxx| 人妻一区二区av| 美女主播在线视频| 国产亚洲精品第一综合不卡| 国产人伦9x9x在线观看| 人体艺术视频欧美日本| 一边摸一边做爽爽视频免费| 亚洲免费av在线视频| 午夜福利视频在线观看免费| 成人国语在线视频| 飞空精品影院首页| 男女午夜视频在线观看| av福利片在线| 成年av动漫网址| av福利片在线| 自线自在国产av| 在线av久久热| 欧美黑人精品巨大| 中国国产av一级| 在线天堂中文资源库| 中文字幕高清在线视频| 99国产综合亚洲精品| 老司机亚洲免费影院| 麻豆av在线久日| 国产日韩欧美视频二区| 亚洲天堂av无毛| 亚洲图色成人| 啦啦啦在线观看免费高清www| 久久亚洲国产成人精品v| 日日爽夜夜爽网站| 99精国产麻豆久久婷婷| 曰老女人黄片| 一级,二级,三级黄色视频| 在线观看www视频免费| 亚洲国产精品国产精品| 69精品国产乱码久久久| 亚洲国产欧美日韩在线播放| 后天国语完整版免费观看| 蜜桃国产av成人99| 日韩一本色道免费dvd| 欧美精品啪啪一区二区三区 | 日韩制服丝袜自拍偷拍| 亚洲国产av新网站| av在线app专区| 国产亚洲欧美精品永久| 精品人妻在线不人妻| 91老司机精品| 亚洲中文av在线| 亚洲国产最新在线播放| 99国产精品一区二区蜜桃av | 欧美在线一区亚洲| av线在线观看网站| 国产一区二区 视频在线| 最近最新中文字幕大全免费视频 | 熟女少妇亚洲综合色aaa.| 岛国毛片在线播放| 亚洲精品成人av观看孕妇| 爱豆传媒免费全集在线观看| 一二三四社区在线视频社区8| 亚洲精品日本国产第一区| 操出白浆在线播放| 午夜福利一区二区在线看| 99久久99久久久精品蜜桃| 国产一区二区三区av在线| 97在线人人人人妻| 亚洲国产中文字幕在线视频| 免费看不卡的av| 久久久久国产一级毛片高清牌| 少妇猛男粗大的猛烈进出视频| 日本黄色日本黄色录像| 国产免费视频播放在线视频| 色网站视频免费| 亚洲午夜精品一区,二区,三区| 丝袜人妻中文字幕| 美女视频免费永久观看网站| 久久九九热精品免费| 国产爽快片一区二区三区| 精品免费久久久久久久清纯 |