蛇類(lèi)中藥飲片分子鑒別方法的研究進(jìn)展

許翊 陸妍 武海萍 卜瑩

[摘要]蛇類(lèi)中藥飲片具有較高的臨床藥用價(jià)值，具有抗炎、鎮(zhèn)痛、通絡(luò)等功效，藥理作用明顯。近年來(lái)，由于野生動(dòng)植物資源匱乏、蛇類(lèi)中藥飲片價(jià)格昂貴，市場(chǎng)上出現(xiàn)了很多偽品和混淆品。傳統(tǒng)的中藥飲片鑒別方法包括基源、形態(tài)、顯微、理化鑒別四大方法體系，但這些方法都存在一些弊端，包括對(duì)中藥樣本有較高的形態(tài)學(xué)要求、鑒別過(guò)程復(fù)雜、易受主觀因素影響等。隨著分子生物學(xué)研究的深入和分子遺傳標(biāo)記技術(shù)的發(fā)展，中藥鑒別方法逐漸多元化，一些新興的理論和技術(shù)被引入中藥材鑒別領(lǐng)域，RAPD技術(shù)、PCR反應(yīng)、DNA條形碼分析等。該文將著重對(duì)當(dāng)前蛇類(lèi)中藥飲片的分子鑒別方法作簡(jiǎn)要綜述。

[關(guān)鍵詞]蛇類(lèi)中藥飲片； RAPD； PCR； DNA條形碼分析

Progress in molecular identification of snake drugs

XU Yi1， LU Yan1， WU Haiping2， BU Ying2*

（1China Pharmaceutical University， Nanjing 210009， China；

2 Institute for Drug and Instrument Control of Joint Logistics Department of Nanjing Military Area

Command， Nanjing 210008， China）

[Abstract]Snake drugs have high values in clinical medication for antiinflammatory， analgesia activities and dredging collaterals However， owing to their deficient resource and substantial profit， many counterfeits for snake drugs have appeared on the market Traditional methods for Chinese medicine authentication include identification of origin， morphology identification， microscopy and physiochemical identification But these methods are restricted in application because of their high morphological requirement for specimens， complex process for assays and indeterminate results guided by subjective With the development of molecular biology and molecular genetic techniques， new theories and technologies for molecular detection have been introduced to the authentication of Chinese medicine， such as RAPD， specific PCR amplification， DNA barcoding analysis and so on， improved the authentication system of Chinese medicine Here， we will give a brief review of molecular detection methods for snake drugs authentication

[Key words]snake drugs； RAPD； PCR； DNA barcoding analysis

中藥是中華民族的偉大瑰寶，蛇類(lèi)藥材來(lái)源于藥用蛇類(lèi)的特定部位，是動(dòng)物類(lèi)中藥材的重要組成部分。蛇類(lèi)中藥飲片產(chǎn)地各異、形態(tài)多樣、成分復(fù)雜、作用靶點(diǎn)多，臨床主要用于祛風(fēng)、通絡(luò)、止痙等。但是，市場(chǎng)上層出不窮的仿冒品對(duì)人民群眾的用藥安全構(gòu)成了威脅，因此對(duì)其進(jìn)行準(zhǔn)確鑒別是當(dāng)前對(duì)蛇類(lèi)中藥飲片質(zhì)量控制的首要前提。隨著現(xiàn)代科學(xué)技術(shù)的發(fā)展，中藥鑒別逐漸形成了基源、形態(tài)、顯微、理化四大方法體系。顯微和理化鑒別是借助現(xiàn)代化儀器對(duì)藥材的微觀形態(tài)特征和主要有效成分進(jìn)行分析，從而達(dá)到鑒別的目的。現(xiàn)代化分析技術(shù)既是對(duì)經(jīng)驗(yàn)性鑒別方法的補(bǔ)充，也是對(duì)其科學(xué)的詮釋?zhuān)贿^(guò)這些方法也受到主觀判斷和環(huán)境變化的影響，僅憑有效成分不能準(zhǔn)確鑒別藥材。中藥材不同于合成藥物，尤其是來(lái)源于動(dòng)植物的藥材，雖然通過(guò)了多項(xiàng)炮制工藝，但是藥用部位的DNA依然保存完整。鑒別藥材特有的DNA序列將從根本上確定藥材的真?zhèn)巍?010年版《中國(guó)藥典》收入烏梢蛇Zaocys dhumnades、蘄蛇Agkistrodon acutus的PCR鑒別方法，明確了分子鑒別技術(shù)在蛇類(lèi)藥材鑒別領(lǐng)域的作用。但是該方法存在目的基因單一、開(kāi)管易污染、特異性差等缺點(diǎn)。本文通過(guò)回顧蛇類(lèi)中藥飲片分子鑒別研究的發(fā)展歷程，希望對(duì)完善蛇類(lèi)藥材的分子鑒別方法有所啟示。

1基于隨機(jī)引物擴(kuò)增的RAPD技術(shù)

RAPD技術(shù)（random amplified polymorphism，RAPD）以PCR為基礎(chǔ)，以人工合成的大約10 nt的寡核苷酸單鏈作為隨機(jī)引物。隨機(jī)引物的退火溫度一般為36 ℃，既能與目的序列相互結(jié)合，又能保證一定的錯(cuò)粘，擴(kuò)大了DNA的檢測(cè)區(qū)域。待測(cè)模板上結(jié)合位點(diǎn)的突變將直接導(dǎo)致其PCR產(chǎn)物的改變。分析PCR產(chǎn)物在電泳圖上的分布，可從中獲得全基因組多態(tài)性的信息，這對(duì)后續(xù)如基因指紋圖譜[1]、動(dòng)植物育種[2]、基因定位[3]、物種親緣關(guān)系的建立[4]等研究具有理論和實(shí)踐指導(dǎo)意義。endprint

目前，基因指紋圖譜是對(duì)中藥材進(jìn)行質(zhì)控的重要方法，RAPD技術(shù)可實(shí)現(xiàn)理想的分子標(biāo)記。待測(cè)樣品經(jīng)隨機(jī)引物擴(kuò)增后，其PCR產(chǎn)物在凝膠電泳上可呈現(xiàn)出物種特有的DNA指紋圖譜。研究者通過(guò)直接對(duì)比待測(cè)樣品和標(biāo)準(zhǔn)品的DNA指紋圖譜，即可鑒別藥材的真?zhèn)?。如通過(guò)基因組DNA電泳圖譜和標(biāo)準(zhǔn)圖譜的比對(duì)分析，對(duì)金錢(qián)白花蛇和烏梢蛇的混偽品具有良好的鑒別效果[5]。目前RAPD技術(shù)已經(jīng)成功地運(yùn)用于多種中藥材以及其他動(dòng)植物的遺傳多樣性分析和品種的鑒別中。RAPD技術(shù)在物種遺傳多樣性研究中，結(jié)合生物統(tǒng)計(jì)學(xué)，可實(shí)現(xiàn)物種的種屬劃分，達(dá)到鑒別的目的。如王義權(quán)等運(yùn)用該技術(shù)研究了蛇類(lèi)的種屬親緣關(guān)系[6]。

RAPD技術(shù)的優(yōu)點(diǎn)在于：①模板用量少，無(wú)需酶切、產(chǎn)物轉(zhuǎn)移、探針雜交等繁瑣的操作，簡(jiǎn)單易行；②含多個(gè)隨機(jī)引物，標(biāo)記的分子DNA序列多，可實(shí)現(xiàn)全基因組多態(tài)性分析；③實(shí)驗(yàn)條件沒(méi)有嚴(yán)格的限制，如無(wú)需同位素標(biāo)記、特異性引物設(shè)計(jì)。但是，近幾年RAPD技術(shù)的研究逐漸減少，研究者鮮有單獨(dú)使用RAPD技術(shù)研究物種DNA分子多態(tài)性。究其原因主要是該技術(shù)存在判定標(biāo)準(zhǔn)不同、有序列同源的干擾[7]、實(shí)驗(yàn)結(jié)果不具穩(wěn)定性、重復(fù)性差[8]等不足。

綜合以上原因使RAPD的單獨(dú)使用受到了嚴(yán)重的限制。因此，尋找特異性的基因，增加實(shí)驗(yàn)的穩(wěn)定性和重復(fù)性，將是蛇類(lèi)中藥飲片分子鑒別的新方向。

2基于特異性引物擴(kuò)增的DNA序列分析

在蛇類(lèi)藥材的分子鑒別研究中，研究者發(fā)現(xiàn)了12S rRNA和Cytb這2個(gè)理想的保守基因，可應(yīng)用特異性PCR擴(kuò)增技術(shù)對(duì)其進(jìn)行擴(kuò)增檢測(cè)，以鑒別蛇類(lèi)中藥飲片的真?zhèn)巍?/p>

21基于線粒體12S rRNA基因序列的鑒別研究12S rRNA存在于線粒體基因組DNA（mitochondrial DNA，mtDNA）上，是一種核糖體RNA。作為核外DNA，12S rRNA具有母系遺傳、足夠的變異、結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單、無(wú)重組等特點(diǎn)。該序列在不同的物種間差異大，而在同一物種內(nèi)又具有足夠的保守性。因此，可針對(duì)該基因序列設(shè)計(jì)特異性的引物，優(yōu)化實(shí)驗(yàn)條件，最終，以產(chǎn)物在電泳中是否出現(xiàn)目的條帶判斷正偽。

對(duì)于蛇類(lèi)中藥飲片的鑒別，2010年版《中國(guó)藥典》收入的烏梢蛇是基于12S rRNA的特異性PCR擴(kuò)增方法，說(shuō)明該序列特異性明顯。基于12S rRNA的鑒別研究發(fā)現(xiàn)種內(nèi)差異對(duì)鑒別無(wú)影響[9]。12S rRNA序列還可以用于測(cè)序鑒別研究，不僅能鑒別烏梢蛇的正偽品，而且可以獲得待測(cè)樣本的種屬關(guān)系[10]。

目前12S rRNA基因主要作為物種系統(tǒng)進(jìn)化以及親緣關(guān)系的分子標(biāo)記，除了蛇類(lèi)研究以外，種屬關(guān)系研究較為廣泛和成熟的動(dòng)物還有龜甲類(lèi)、鳥(niǎo)類(lèi)、蛙類(lèi)、魚(yú)類(lèi)[1114]等，并且都取得了顯著的成績(jī)。

22基于Cytb基因序列的鑒別研究Cytb是編碼線粒體內(nèi)細(xì)胞色素b氧化酶亞基基因，與12S rRNA同為理想的基因標(biāo)記位點(diǎn)：嚴(yán)格的母系遺傳，與核基因組DNA無(wú)共同序列，沒(méi)有基因重組現(xiàn)象。因此該基因在研究基因進(jìn)化、物種親緣關(guān)系和物種的鑒定[1516]等方面同樣具有重要意義。在蛇類(lèi)中藥飲片的鑒別中，可使用經(jīng)典的Cytb通用引物擴(kuò)增相關(guān)蛇類(lèi)的目的序列并測(cè)序。在中藥蛇類(lèi)與混偽品的研究中發(fā)現(xiàn)，Cytb基因在同種蛇類(lèi)中序列差別小，而在不同種蛇類(lèi)中序列差別大[1718]，說(shuō)明蛇類(lèi)Cytb基因是一種理想的分子標(biāo)記。如果能設(shè)計(jì)高特異性的引物，優(yōu)化反應(yīng)條件如退火溫度、酶的活性、反應(yīng)循環(huán)數(shù)等，不僅可以在種間高效地區(qū)分正偽，也能在序列差異較小的種內(nèi)準(zhǔn)確鑒別。以Cytb基因作為分子標(biāo)記對(duì)銀環(huán)蛇目的序列進(jìn)行特異性PCR擴(kuò)增，可快速有效地鑒別銀環(huán)蛇來(lái)源的金錢(qián)白花蛇[19]，即使在多重PCR擴(kuò)增體系中，特異性的引物也能穩(wěn)定擴(kuò)增金錢(qián)白花蛇的目的序列，在其常見(jiàn)的偽品赤鏈蛇、赤練華游蛇、金環(huán)蛇中做出準(zhǔn)確的鑒別[20]。

雖然基于Cytb基因和12S rRNA基因的物種DNA序列研究日趨完善，但是基于特異性引物擴(kuò)增的方法在蛇類(lèi)鑒別中還存在一些不足：①在不同種蛇類(lèi)研究中，PCR實(shí)驗(yàn)條件的摸索時(shí)間較長(zhǎng)，成本高，且不容易轉(zhuǎn)向?qū)嶋H應(yīng)用；②動(dòng)物類(lèi)藥材不同于植物藥材，不會(huì)固定生長(zhǎng)，不同地區(qū)的同一個(gè)物種也可能因?yàn)榄h(huán)境、氣候、地理等原因在序列上存在差異。因此需要收集多個(gè)標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行對(duì)比[9]；③分子鑒別方法自身的不足。對(duì)于特殊的蛇類(lèi)中藥飲片如金錢(qián)白花蛇[19]，其藥用基原是銀環(huán)蛇的幼蛇，如有成蛇混在正品中，此方法將無(wú)法進(jìn)行區(qū)分。在實(shí)際的鑒別工作中，單考慮某個(gè)線粒體基因并不能充分鑒別一個(gè)物種，需要結(jié)合其他基因位點(diǎn)，并且需要聯(lián)合形態(tài)學(xué)和理化特征研究，才能準(zhǔn)確鑒別。

3基于通用引物擴(kuò)增的DNA序列條形碼分析

DNA條形碼分子鑒定法是利用基因組中一段公認(rèn)的、相對(duì)較短的DNA序列來(lái)進(jìn)行物種鑒定的一種分子生物學(xué)技術(shù)。近年來(lái)，基于DNA條形碼的序列擴(kuò)增方法在物種鑒別領(lǐng)域中得到了快速的發(fā)展和應(yīng)用，廣泛應(yīng)用于動(dòng)植物的鑒定和鑒別中，如昆蟲(chóng)類(lèi)[21]、鳥(niǎo)類(lèi)[22]、魚(yú)類(lèi)[2324]、蛇類(lèi)[25]等，在物種保護(hù)、生物安全、生物多樣性研究等方面具有重要意義。

DNA條形碼技術(shù)操作簡(jiǎn)便、結(jié)果準(zhǔn)確、易于推廣。動(dòng)物類(lèi)中藥材采用的序列鑒定以細(xì)胞色素C氧化亞酶I基因（cytochrome C oxidase subanit Ⅰ gene，COⅠ）為主，以?xún)?nèi)部轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)2（internal transcribed spacer，ITS2）為輔。COⅠ基因具有高度保守、插入和缺失較少、能夠被通用引物擴(kuò)增等優(yōu)點(diǎn)，相比同為編碼蛋白的Cytb基因，其通用引物的普適性更強(qiáng)；而與12S rRNA序列相比，該基因片段插入和缺失更少，序列相對(duì)簡(jiǎn)單，進(jìn)化速度快，在親緣關(guān)系密切的物種鑒別中具有獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)。

基于COⅠ條形碼的分子鑒別，由于可以使用通用引物擴(kuò)增、獲取未知的目的序列，所以可以使用計(jì)算機(jī)軟件，將擴(kuò)增的序列進(jìn)行測(cè)序、序列比對(duì)和遺傳距離分析，并構(gòu)建系統(tǒng)分支樹(shù)，從聚類(lèi)圖中獲得物種的種屬關(guān)系；同時(shí)也可建立COⅠ數(shù)據(jù)庫(kù)，最后進(jìn)行品種鑒定。這也為蛇類(lèi)中藥飲片的鑒別提供了定性的方法，COⅠ條形碼技術(shù)能夠區(qū)分親緣關(guān)系極為接近的烏梢蛇和灰鼠蛇[26]，金錢(qián)白花蛇及其混偽品[27]，相比于其他分子標(biāo)記方法準(zhǔn)確性更高。基于COⅠ條形碼的分子鑒別研究已經(jīng)顯現(xiàn)出強(qiáng)大的應(yīng)用前景，2015年版《中國(guó)藥典》已經(jīng)收入記載了中藥材分子鑒定法指導(dǎo)原則。endprint

綜上所述，DNA條形碼技術(shù)在物種分子鑒別領(lǐng)域發(fā)展迅速，對(duì)于物種親緣關(guān)系和遺傳多樣性的研究相比于其他線粒體DNA分子標(biāo)記物準(zhǔn)確性更高，包含的遺傳信息更多。但是仍然存在不足之處：①不能用于混合物鑒別；②中藥材炮制過(guò)程中，硫磺熏蒸對(duì)DNA檢測(cè)存在干擾；③同一物種若存在種內(nèi)變異，如何確定種內(nèi)閾值是個(gè)難題[28]；④mtDNA中假基因的存在容易產(chǎn)生旁系同源擴(kuò)增，干擾結(jié)果判斷[29]。

4其他分子檢測(cè)方法

以上3種分子鑒別方法根據(jù)靶序列性質(zhì)的不同，分別采用隨機(jī)引物、特異性引物、通用引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，但它們最后都通過(guò)凝膠電泳進(jìn)行檢測(cè)。雖然凝膠電泳是常見(jiàn)的核酸分離方法，但是在實(shí)際操作中需要開(kāi)管取樣，易產(chǎn)生交叉污染，且耗時(shí)長(zhǎng)，增加了分子檢測(cè)的時(shí)間和人工成本。實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè)方法雖然可實(shí)現(xiàn)閉管無(wú)污染的檢測(cè)[30]，但儀器昂貴、技術(shù)要求高，限制了其在基層單位的應(yīng)用。近幾年，隨著材料學(xué)的發(fā)展，可視化的檢測(cè)方法引起了研究者的興趣，其中最為典型的是基于熒光共振能量轉(zhuǎn)移（fluorescence resonance energy transfer，F(xiàn)RET）的陽(yáng)離子高分子聚合物（cationic conjugated polyelectrolytes，CCP）[31]，目前，已有文獻(xiàn)報(bào)道將CCP用于蛇類(lèi)中藥飲片的正偽鑒別中。水溶性的CCP可與帶負(fù)電荷的DNA鏈結(jié)合，在紫外光激發(fā)下，吸收光能量而顯色。若PCR產(chǎn)物中存在靶序列，CCP與之結(jié)合后，能量將傳遞至DNA鏈上修飾了熒光基團(tuán)的dUTP（fluoresceinlabeled dUTP，F(xiàn)dUTP）上。而CCP自身的能量降低，波長(zhǎng)紅移，指示顏色發(fā)生變化。FdUTP作為DNA鏈合成的原料出現(xiàn)在目的PCR產(chǎn)物中，而引物二聚體較短，即使含有少量的FdUTP，也不能引起CCP的顏色變化，因此無(wú)假陽(yáng)性干擾。研究者已經(jīng)對(duì)蛇類(lèi)樣本聯(lián)合運(yùn)用特異性PCR擴(kuò)增和CCPFRET進(jìn)行檢測(cè)，證明該檢測(cè)方法操作簡(jiǎn)單、靈敏度高，在紫外下可實(shí)現(xiàn)可視化檢測(cè)，且檢測(cè)結(jié)果與基因測(cè)序比對(duì)結(jié)果一致，具有高度準(zhǔn)確性[32]?；谝陨蠑⑹觯欣碛上嘈欧肿由飳W(xué)與材料學(xué)、物理學(xué)乃至更多的學(xué)科之間相互交叉融合、優(yōu)勢(shì)互補(bǔ)，可促進(jìn)中藥材鑒別學(xué)的快速發(fā)展。

5展望

我國(guó)中藥資源豐富，中藥市場(chǎng)潛力巨大，中藥材的準(zhǔn)確鑒別是中藥標(biāo)準(zhǔn)化和現(xiàn)代化的第一步。動(dòng)物類(lèi)藥材攜帶有自身特有的DNA序列，為分子鑒別奠定了生物學(xué)基礎(chǔ)。隨著分子生物學(xué)研究的不斷深入，DNA序列分析也將實(shí)現(xiàn)科學(xué)化與規(guī)范化。如何在實(shí)際運(yùn)用中發(fā)揮它的優(yōu)勢(shì)、完善不足是接下來(lái)的研究目標(biāo)，相信分子生物學(xué)的不斷進(jìn)步也將為蛇類(lèi)中藥飲片鑒別領(lǐng)域的發(fā)展帶來(lái)新的突破，為中藥市場(chǎng)的繁榮和穩(wěn)定做出貢獻(xiàn)。

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[責(zé)任編輯呂冬梅]endprint